Name: confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

Författarna är tacksamma mot Julie Merkle för hennes hjälpsamma kommentarer till manuskriptet. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R15GM137236 till O.D. De konfokala och superupplösta bilderna förvärvades med hjälp av en Zeiss LSM 900 med Airyscan 2, köpt med NSF MRI grant 2018748.

1. Flugberedning för äggstocksdissektioner
<ol><li>Lägg 10-15 Drosophila melanogaster honflugor (1-2 dagar gamla) av önskad genotyp i en smal injektionsflaska innehållande ~ 8 ml Drosophila flugmedium strös med en liten mängd granulerad bagerijäst 2-3 dagar före dissektion vid 25 ° C. Att lägga till några hanar i injektionsflaskan kan öka äggkammarens utbyte. Se dock till att det totala antalet flugor inte överstiger 20 eftersom detta kan påverka äggstocksutvecklinge...

BM är avgörande för embryonal och organmorfogenes och vuxna fysiologiska funktioner. Dessutom fungerar BM som en signalplattform för etablering och underhåll av epitelpolaritet och ger vävnader stöd2. Ändå är mekanismerna som reglerar korrekt placering av BM-proteiner dåligt förstådda. En bättre förståelse av de biologiska vägarna som är dedikerade till intracellulär handel och polariserad utsöndring av BM-proteiner kräver en noggrann analys av komponenterna i dessa vägar och...

Källarmembranet (BM) är ett tunt ark av skiktad cellanhängande extracellulär matris (ECM) som är kritisk för epitelstruktur och morfogenes1. Den består av ~ 50 proteiner och finns allestädes närvarande under epitel- och endotelcellerna och ensheathing skelett-, slät- och hjärtmuskelceller och adipocyter 1,2,3. De tre huvudkomponenterna i BM vid epitelcellernas basala sida är kollagen IV, perlekan och lamininer. BM ligger till grund för epitelcellerna och ansvarar för många funktioner, inklusive vävnadsseparation och barriär, tillväxt och stöd och cellpolarisering 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Dess roll som signalplattform reglerar morfologin och differentieringen av epitelceller och vävnader under utveckling 3,13,14. Dessutom är felreglering av BM och / eller ett brott mot dess integritet de främsta orsakerna till många patologiska tillstånd, inklusive tumörmetastas 2,15,16. Trots de väsentliga funktioner som utförs av BM under vävnads- och organmorfogenes är komponenterna i de biologiska vägarna som är avsedda för den polariserade intracellulära handeln och utsöndringen av BM-proteiner vagt kända.
För att studera intracellulär handel med BM-innehållande vesiklar och utsöndringen av BM-proteiner genom epitelceller är follikulärt epitel (FE) i Drosophila-äggstocken ett kraftfullt modellsystem (Figur 1). En Drosophila-äggstock består av 16-20 långa, rörliknande strukturer, kallade ovarioler (figur 1A,B)17,18,19. Varje ovariol kan ses som en äggmonteringslinje, med åldersprogressionen för äggkammare (som var och en ger upphov till ett ägg) som börjar vid den främre änden och rör sig bakåt tills det mogna ägget går ut genom äggledaren. Varje äggkammare är inkapslad av FE, ett monolager av somatiska follikelceller (FC), som omger de centrala könscellerna (GCs). FE är starkt polariserad med en distinkt apikal-basal polaritet där den apikala domänen vetter mot könslinjen och BM-proteinerna utsöndras basalt18,19. FC utsöndrar aktivt alla huvudkomponenter i BM, inklusive kollagen IV, perlekan och lamininer20,21. I epitelceller såsom FC produceras BM-komponenterna och kräver en specialiserad polariserad utsöndringsväg för deras avsättning extracellulärt. Till exempel, när det gäller den vanligaste komponenten i BM, Kollagen IV (Coll IV), är detaljerna kring dess polariserade intracellulära handel och utsöndring vaga trots att dess produktion och avsättning är i fokus för många studier. Coll IV översätts i endoplasmatisk retikulum (ER), vilket också är där varje fibril - bestående av tre polypeptider (två α1-kedjor och en α2-kedja) - monteras i en trippelhelix22. Korrekt Coll IV-vikning och funktion kräver ER-chaperoner och enzymer, inklusive lysyl- och prolyl-hydroxylaser såsom Plod och PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Dessa posttranslationella enzymer reglerar ER-sorteringen av Coll IV, eftersom förlusten av var och en gör att Coll IV fångas i basal ER 20,23,24,25,26. Sedan lämnar nyligen syntetiserade Coll IV ER för Golgi i COPII-belagda vesiklar. Lastreceptorn Tango1 hjälper till att förpacka kollagener i stora Golgi-bundna vesiklar som rymmer stora multimera proteiner20,27. När Coll IV har förpackats i intracellulära exocytiska vesiklar utsöndras den specifikt basalt från epitelceller. För att rikta BM-avsättning till basalsidan kräver epitelceller en annan uppsättning faktorer som är specifikt dedikerade till polariserad BM-utsöndring. Med hjälp av FE för Drosophila-äggstocken har några komponenter i denna nya cellulära process karakteriserats, inklusive nukleotidutbytesfaktorerna (GEFs) Crag och Stratum, GTPaserna Rab8 och Rab10, liksom nivåerna av fosfoinositid PI (4,5) P2 och Kinesin 1 och 3 motorproteiner 20,28,29,30,31 . Dessa komponenter är avgörande för att säkerställa polariserad fördelning av BM-proteiner.
För att övervaka den intracellulära lokaliseringen av BM-proteiner i FE kan endogent märkta källarmembranproteiner (proteinfällor), såsom Viking-GFP (Vkg-GFP eller α2 Coll IV-GFP) och Perlecan-GFP (Pcan-GFP) användas32,33. Dessa proteinfälllinjer har visat sig exakt återspegla den endogena fördelningen av BM-proteiner och möjliggör mer känslig upptäckt av vesikulär handel28,30. Komponenterna som är involverade i den polariserade avsättningen av BM i FE karakteriserades först med hjälp av proteinfälllinjer för Vkg-GFP och Pcan-GFP 20,28,29,30. Proteinfällor kan användas i olika genetiska bakgrunder, inklusive mutanter och Gal4-linjer 34. Dessutom kan proteinfällor användas i kombination med fluorescerande färgämnen och / eller fluorescensimmunfärgning, vilket möjliggör exakt karakterisering av lokaliseringen av BM-proteiner vid jämförelse av vildtyp och mutantförhållanden35.
För att exakt och effektivt bedöma distribution och lokalisering av BM-proteininnehållande vesiklar utgör konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) och superupplösande bildtekniker en betydande fördel för andra avbildningsmetoder. Dessa tillvägagångssätt kopplar samman högupplöst avbildning med relativ användarvänlighet. CLSM är en mikroskopiteknik som möjliggör en förbättrad optisk upplösning genom att skanna provet med en laser på ett rasterskanningssätt med galvanometrar. Pinhålets bländare är en kärnkomponent i ett konfokalmikroskop. Genom att blockera de ofokuserade signalerna som kommer uppifrån eller under fokalplanet resulterar hålöppningen i en mycket överlägsen upplösning i z-axeln36. Detta gör det också möjligt att få en serie bilder i z-planet, kallad en z-stack, motsvarande en serie optiska sektioner. z-stacks skapar därefter en 3D-bild av exemplaret, via 3D-rekonstruktion, med hjälp av bildprogramvara. Konventionella epifluorescensmikroskop (widefield), till skillnad från konfokalmikroskop, tillåter ljus utanför fokus att bidra till bildkvalitet, minska bildupplösningen ochkontrasten 36,37. Detta gör epifluorescensmikroskopi till en mindre attraktiv kandidat när man studerar proteinlokalisering eller samlokalisering.
Även om CLSM är ett lämpligt tillvägagångssätt för olika applikationer, inklusive avbildning och karakterisering av intracellulär handel med BM-proteiner, utgör det fortfarande ett problem när avbildningsprover under Abbes diffraktionsgräns för ljus (200-250 nm). Vid avbildning av sådana prover kan konfokalmikroskopi, särskilt vid användning av ett oljemål, resultera i hög upplösning. Superupplösningstekniker överskrider dock gränsen för konfokalmikroskopi. Det finns olika tillvägagångssätt för att uppnå superupplösningsmikroskopi, var och en med specifika upplösningsgränser, och var och en lämplig för olika analyser. Dessa tillvägagångssätt inkluderar fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), stimulerad emissionsutarmningsmikroskopi (STED), strukturerad belysningsmikroskopi (SIM) och Airyscan (superupplösning) mikroskopi 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Även om Airyscan har en grövre upplösning än PALM/STORM, STED och SIM, kan den fortfarande uppnå en upplösning på upp till ~120 nm (ungefär dubbelt så hög upplösning som CLSM). Dessutom har denna superupplösande mikroskopimetod visat sig ha en fördel jämfört med SIM och andra superupplösningstekniker vid avbildning av tjocka prover och prover med ett lågt signal-brusförhållande47,48.
Airyscan är en relativt ny superupplöst konfokalmikroskopiteknik46. Till skillnad från traditionella CLSM, som använder pinhåls- och enpunktsdetektorer för att avvisa ljus som inte är i fokus, använder denna superupplösningsmetod en 32-kanals galliumarsenidfosfid (GaAsP) fotomultiplikatorrörsdetektor som samlar allt ljus vid varje skanningsposition45. Var och en av de 32 detektorerna fungerar som ett litet hål, vilket minskar hålstorleken från den traditionella 1.0 Airy Unit (A.U.) till en förbättrad 0.2 A.U., vilket möjliggör en ännu högre upplösning och signal-brusförhållande, samtidigt som effektiviteten hos en 1.25 A.U. diameter45 bibehålls. Dessutom resulterar den linjära dekonvolutionen som används av Airyscan i upp till 2x ökning av upplösning45. Med hänsyn till detta är CLSM, och specifikt superupplösningsmikroskopi, väl lämpade för att studera BM-proteiner och proteiner som reglerar den basala avsättningen av BM-proteiner, eftersom de kan producera mycket högupplösta bilder för lokaliserings- och samlokaliseringsstudier, vilket ger nya insikter i de rumsliga, tidsmässiga och molekylära händelser som styr dessa processer.
Ett alternativt tillvägagångssätt för konfokalmikroskopi som kan användas för att utföra lokaliseringsexperiment är bilddekonvolution. Eftersom widefield-mikroskopi tillåter out-of-focus-ljus att nå detektorerna, kan matematiska och beräkningsmässiga dekonvolutionsalgoritmer tillämpas för att ta bort eller omtilldela ljus utanför fokus från bilder som erhållits genom widefield-mikroskopi, vilket förbättrar upplösningen och kontrasten i bilden49. Dekonvolutionsalgoritmer kan också tillämpas på konfokala bilder för att ytterligare öka upplösningen och kontrasten, vilket ger slutliga bilder nästan jämförbara med superupplösningsmikroskopi50. Airyscan använder weiner-filterbaserad dekonvolution tillsammans med Sheppards pixelomplacering, vilket resulterar i en mycket förbättrad rumslig upplösning och signal-brusförhållande. Jämfört med konfokalmikroskopi observeras en ökning med 2x i upplösning i alla tre rumsliga dimensioner (120 nm i x och y och 350 nm i z) när man använder denna superupplösande mikroskopiteknik45,51.
Detta manuskript ger detaljerade och optimerade protokoll för att fläcka, förvärva och visualisera intracellulär handel och avsättning av BM-proteiner med hjälp av FE för Drosophila-äggstocken som ett modellsystem i kombination med konfokal och superupplösande mikroskopi. Drosophila-linjer som uttrycker endogent märkta källarmembranproteiner, t.ex. Vkg-GFP och Pcan-GFP, är effektiva och exakta verktyg för att visualisera BM-proteinhandel och utsöndring. Dessutom kan de enkelt användas i olika genetiska bakgrunder, inklusive mutant- och Gal4 / UAS-linjer 34. Även om endogent märkta källarmembranproteiner rekommenderas, är användningen av antikroppar mot specifika BM-proteiner också kompatibel med de beskrivna protokollen. Dessa protokoll är särskilt användbara för forskare som är intresserade av att studera intracellulär handel och utsöndring av BM-proteiner i intakt epitelvävnad med hjälp av konfokal och superupplösningsavbildning. Dessutom gör förmågan att kombinera epitelvävnadsanalys med de expansiva verktygen för Drosophila-genetik detta tillvägagångssätt särskilt kraftfullt. Slutligen kan dessa protokoll enkelt anpassas för att studera vesikulär handel och sortering av andra proteiner av intresse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>F-Actin Stain (1/500 of 66&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>F-Actin Stain (1/100 of 66&#181;M))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 Antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab30637</td>
			<td>For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7&#181;g/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-Polymount</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1860620</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bakers Yeast (Active Dry Yeast)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten the overies for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (30% solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7284</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression wells</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7156101</td>
			<td>For dissection (glass concavity slide can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Fisher scientifc</td>
			<td>13-820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Genesee Scientific/Invictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Morin et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>33594</td>
			<td>RNAi against Crag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buszczak et al., 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Concavity Slide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7187804</td>
			<td>For dissection (depression wells can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Secondary antibody (GM130 antibody) (5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>DNA Stain (1 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Fisher Scientific: 06-666</td>
			<td>Delicate task wipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fluorescent Stereo Microscope&#160; M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For ovary imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294875X25</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating platform rocker</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>6720</td>
			<td>For ovary fixation and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly BF</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-121</td>
			<td>Fly Food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific: 15713</td>
			<td>For PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>For PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cover Glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>Cover glass for microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900 with Airyscan 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal and super-resolution Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis

Källarmembranet (BM) - ett specialiserat ark av extracellulär matris närvarande vid basalsidan av epitelceller - är avgörande för etablering och underhåll av epitelvävnadsmorfologi och organmorfogenes. Dessutom är BM avgörande för vävnadsmodellering, som fungerar som en signalplattform och ger yttre krafter för att forma vävnader och organ. Trots de många viktiga roller som BM spelar under normal utveckling och patologiska tillstånd, är de biologiska vägarna som styr den intracellulära handeln med BM-innehållande vesiklar och hur basalsekretion leder till polariserad avsättning av BM-proteiner dåligt förstådda. Follikulärt epitel av Drosophila-äggstocken är ett utmärkt modellsystem för att studera den basala avsättningen av BM-membranproteiner, eftersom den producerar och utsöndrar alla huvudkomponenter i BM. Konfokal och superupplösningsavbildning i kombination med bildbehandling i fasta vävnader möjliggör identifiering och karakterisering av cellulära faktorer som är specifikt involverade i intracellulär handel och avsättning av BM-proteiner. Denna artikel presenterar ett detaljerat protokoll för färgning och avbildning av BM-innehållande vesiklar och deponerad BM med användning av endogent märkta proteiner i follikulärt epitel i Drosophila-äggstocken . Detta protokoll kan tillämpas för att ta itu med både kvalitativa och kvantitativa frågor och det utvecklades för att tillgodose screening med hög genomströmning, vilket möjliggör snabb och effektiv identifiering av faktorer som är involverade i polariserad intracellulär handel och utsöndring av vesiklar under epitelvävnadsutveckling.

Metoderna som beskrivs häri kan användas för att effektivt och exakt avbilda och karakterisera intracellulär handel och utsöndring av BM-proteiner i polariserade epitelceller, såsom FE hos Drosophila-äggstocken . Därefter ger vi förväntade resultat som erhållits med hjälp av de beskrivna metoderna, samt användbara råd och potentiella fallgropar. För att göra det används Vkg-GFP, en endogent märkt Vkg (Drosophila Col IV). Samma resultat kan dock uppnås med andra endogent märkta BM-pro...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Källarmembranet är viktigt för vävnads- och organmorfogenes under utvecklingen. För att bättre förstå mekanismerna som leder till korrekt placering av denna struktur beskriver det presenterade protokollet metoder för att visualisera och karakterisera intracellulär handel och utsöndring av källarmembranproteiner i epitelceller med hjälp av konfokal och superupplösningsmikroskopi.

Konfokal och superupplöst avbildning av polariserad intracellulär handel och utsöndring av källarmembranproteiner under Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Detta protokoll möjliggör karakterisering av intracellulär handel och utsöndring av källarmembranproteiner med användning av Drosophila-arrayen som ett modellsystem. Den största fördelen med vår teknik är att den möjliggör högupplöst avbildning av intracellulär handel med källarmembranproteiner med hjälp av endogent taggade proteiner och Airyscan superupplösningsmikroskopi. Även om detta protokoll är utvecklat för att avbilda den intracellulära handeln med källarmembranproteiner, kan det utvidgas till att studera handeln med andra proteiner av intresse och andra biologiska system, inklusive cellodling och organoider.För att börja, efter att ha dissekerat Drosophila-äggstockar i PBS under ett dissekerande omfång, tillsätt en milliliter fixeringslösning och fixa äggstockarna på en nötningsplattform i 15 minuter. Ta bort fixeringslösningen och utför två snabba tvättar, var och en med en milliliter PBST. Genom att försiktigt invertera mikrocentrifugrören fem till sex gånger, utför sedan fyra långa tvättar på 10 minuter vardera med en milliliter PBST på en mutterplattformsvippa.Efter fixering och tvättning, ta bort PBST, tillsätt sedan en milliliter blockeringslösning och blockera äggstockarna på en mutterplattformsvippa i minst en timme. Ta sedan bort blockeringslösningen och tillsätt 300 mikroliter primär antikroppslösning, innehållande primära antikroppar utspädda vid lämpliga koncentrationer i blockerande lösning. Inkubera över natten på en nuterande plattformsvippa vid 4 grader Celsius.Efter avlägsnande av den primära antikroppslösningen, utför två snabbtvättar och fyra långa tvättar, som visats tidigare, ta sedan bort PBST och tillsätt 500 mikroliter sekundär antikroppslösning innehållande fluorescerande sekundära antikroppar som kommer att detektera de primära antikropparna som används. Inkubera äggstockarna i den sekundära antikroppslösningen på en mutterplattformsvippa i två timmar vid rumstemperatur och utför sedan två snabbtvättar och fyra långa tvättar i PBST som tidigare visats på en mutterplattformsvippa. Efter den sista tvätten, använd en P-1000-pipett för att försiktigt pipettera äggstockarna upp och ner i röret för att separera äggkamrarna.Låt äggkamrarna sjunka till botten genom att hålla röret i upprätt läge i fem till 10 minuter. Ta sedan bort PBST med en Pasteur-pipett och lämna cirka 50 mikroliter. Ta sedan bort så mycket av den återstående PBST som möjligt med en P-200-pipett och tillsätt två droppar monteringsmedium, tillräckligt för att spridas jämnt på en täckglidning.För att möjliggöra enkel överföring av det viskösa monteringsmediet till glidet från mikrocentrifugröret, skär av änden på en P-200-pipettspets. Överför sedan långsamt alla äggkamrar i monteringsmediet till glasskivan, så att du inte skapar bubblor. Under ett dissekerande mikroskop sprider du försiktigt ut monteringsmediet och separerade äggkammare med en ny P-200-pipettspets eller pincett för att täcka ett område som är ungefär lika stort som en täckglidning.Använd pincett och placera försiktigt täckglidningen på äggkamrarna i en vinkel för att undvika bubblor och förvara bilden vid rumstemperatur på en plan yta i mörkret i två dagar för att polymerisera. När monteringsmediet har härdat kan bilden förvaras vid 4 grader Celsius i mörkret i några veckor för avbildning. För att visualisera den intracellulära lokaliseringen av källarmembranproteiner, ställ in målet på 63x och placera försiktigt en droppe nedsänkningsolja på linsen och placera sedan bilden på målet med täckglidningen mot målet för att lokalisera provet.Leta reda på det intressanta området med okularet i det epifluorescerande mikroskopet och välj sedan en konfiguration med lämpliga inställningar för fluoroforer till bild enligt beskrivningen i manuskriptet. När konfigurationen har ställts in avbildar du exemplet genom att välja Live under förvärvsläge och justerar zoomen mellan 2 och 4x för att optimera skanningsområdet för exemplet. För varje enskild kanal väljer du ett spår under Kanal och klickar på Live.Justera huvudförstärkningen och lasereffekten när du använder intervallindikatorverktyget och följ alla riktlinjer för att undvika mättade pixlar som beskrivs i manuskriptet, samtidigt som du upprepar samma för varje kanal. I växlingsfönstret Förvärvsläge, under Bildstorlek, klickar du på SR för att maximera detektorns funktioner och justera ramstorleken automatiskt. Håll medelvärdet till Ingen i Airyscan-läge eftersom det vanligtvis inte är nödvändigt och minskar skanningstiden.I vissa fall kan dock ett genomsnitt på 2x förbättra signal-brusförhållandet och klicka sedan på Snap för att få en bild. För att skaffa en Z-stack, klicka på kryssrutan Z-Stack under fliken Förvärv. Välj sedan önskad kanal för att observera provet.Till exempel DAPI-kanalen och klicka på Live för att starta en live-skanning och ställ sedan in ett intervall för Z-stacken med hjälp av finjusteringsknappen på mikroskopet. Ställ sedan in slutpunkterna för Z-stacken genom att klicka på Ange först och Ställ in senast. För optimal 3D-rekonstruktion, ställ in intervallet för Z-stacken lägre än 0.5 mikrometer för att tilldela stegstorleken och klicka på Starta experiment för att påbörja Z-stack-förvärv.När bilderna eller Z-stacken har erhållits klickar du på bearbetning, sedan metod alternativ och välj Airyscan Processing. Utför autofilter för att starta och vid behov utföra ytterligare manuell bearbetning genom att ändra superupplösningsvärdet för att få bästa resultat för provet. När det optimala SR-värdet har fastställts klickar du på Apply för att generera en bearbetad bild.När det gäller Z-stack-bilder, bearbeta antingen som en Z-skiva eller som hela Z-stacken genom att klicka på rutan 3D-bearbetning. För att visualisera proteinhandel i 3D efter förvärvet av en Z-stack, generera en 3D-bild genom att klicka på 3D-ikonen i förhandsgranskningsfönstret, som kommer att visas i visningskontrollavsnittet i airyscan-bearbetade bilden. Från de olika 3D-vyalternativen använder du Ytvy eller Blandad vy när du visar vesiklarnas struktur.För bild av högsta kvalitet väljer du inställningen Exakt eftersom den snabbaste inställningen blir mindre exakt och leder till dålig 3D-rendering. När bilden har genererats manipulerar du 3D-bilden genom att zooma och rotera för att fokusera på en önskad plats. När vyn har erhållits, under fliken 3D, välj Visad upplösning och klicka sedan på Skapa bild, vilket skapar en ögonblicksbild av bilden i samma riktning som den visades och kan sparas och exporteras i olika filformat.Konfokalmikroskopi kan användas för att visualisera intracellulär lokalisering och avsättning av källarmembranproteiner såsom Viking-GFP när förvärvsparametrarna optimeras. När förvärv och bildbehandling utförs korrekt ökar superupplösningsmikroskopi bildupplösningen jämfört med konfokalmikroskopi. Som illustreras av de bättre definierade bilderna i den intracellulära handeln med källarmembranproteiner, såsom Viking.Ortogonal projektion möjliggör visualisering av den totala fördelningen av vesiklar och fack som innehåller källarmembranproteiner i en enda bild med hjälp av konfokal eller superupplöst avbildning. En 3D-rekonstruktion genom att montera en stapel optiska Z-sektioner tagna av konfokal eller superupplösningsavbildning användes för att bedöma lokaliseringen och distributionen av intracellulära källarmembranproteiner. Superupplösningsavbildning kan användas för att bestämma den exakta lokaliseringen av källarmembranproteiner under mutanta förhållanden.Till exempel, i Crag knockdown-epitelceller, ackumuleras källarmembranproteiner både apikalt och basalt, vilket indikerar att det styr den polariserade utsöndringen av källarmembranproteiner. Konfokal och superupplöst mikroskopi kan också användas i samlokaliseringsexperiment. Till exempel visar denna figur den partiella samlokaliseringen av Viking-GFP och en Golgi-markör, GM-130, som bekräftar att Viking sorteras till Golgi före utsöndring.För att effektivt avbilda handeln med källarmembranproteiner med hjälp av superupplöst mikroskopi rekommenderar vi att du försiktigt monterar äggstockarna och är särskilt uppmärksamma när du ställer in förvärvs- och faltningsparametrarna. Detta protokoll är optimerat för att visualisera intracellulär handel och utsöndring av källarmembranproteiner. Det kan dock enkelt modifieras för att effektivt avbilda handeln med andra proteiner av intresse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Live Confocal Imaging för att utveckla Arabidopsis blommor

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

C. elegans Excretory kanalen som en modell för intracellulära Lumen morfogenes och In Vivo polariserade membran biogenes i en enda Cell: märkning av GFP-fusions, RNAi interaktion skärm och Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelat super-upplösning och elektronmikroskopi för att lösa Protein lokalisering i zebrafiskar näthinna

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metoder för Imaging intracellulära pH av follikeln Stem Cell härstamning i levande Drosophila äggstocksvävnad

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levande cellen avbildning av kromosomsegregering under Mitos

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Analys av Epididymal proteinsyntes och utsöndring

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Upptining, odling och bevarandet Drosophila cellinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging och analys av vävnadsorientering och tillväxtdynamik i utvecklande Drosophila Epithelia under pupal stadier

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualisering av cytoskelettberoende handel med lipidhaltiga organeller i Drosophila-embryon

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Användning av expansionsmikroskopi för att fysiskt förstora hela Drosophila-embryon för superupplösningsavbildning

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...