Name: extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-12-09T12:40:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

D.P.B.、K.J.R.和S.M.M.得到了伊恩·波特基金会的支持，JPV是澳大利亚政府研究培训计划Squalend的获得者。

蓝藻物种 Merismopedia 用于本研究38。
1. 原料样品制备
<ol><li>从感兴趣的水生来源或蓝藻培养瓶中收集藻类浮渣，并将其放入50 mL离心管38中。 注意：样品必须在-20°C下冷冻以备以后提取，并在下一步之前解冻。</li>
	<li>将含有样品的管在25°C下以3，500× g离心10分钟。将上清液倒入废物容器中，并将其丢弃到生物废物中。 注意：上清液可以保留用于将来分析外泌体。</li>
	<li>用密封膜牢固地盖住装有样品沉淀的管（参见 材料表），并使用锋利的长鼻镊子在薄膜上刺穿几个孔。将管在-80°C下直立储存30分钟。</li>
	<li>打开并在0.1mbar和-80°C（~30分钟）下平衡冷冻干燥机。 注意：参数（步骤1.4）针对本研究中使用的冷冻干燥机进行了优化（见 材料表）。根据实验室提供的冷冻干燥机型号遵循标准操作程序，如果冷冻干燥机型号未低至-80°C，则设置尽可能低的温度。<ol><li>将离心管直立放入冷冻干燥器玻璃容器中，并将其放入-80°C冰箱中5分钟以冷却罐子。</li>
		<li>从冰箱中取出玻璃容器并盖上橡胶盖。</li>
		<li>确保冷冻干燥机橡胶阀出口上的手柄通风到大气中（朝上），并牢固地连接玻璃容器。</li>
		<li>将橡胶阀出口的手柄非常缓慢地转动到指向向下的位置，使罐子暴露在真空中，并允许长达24小时的冷冻干燥，以确保所有液体的升华。</li>
		<li>要释放罐子中的真空，请将手柄转向朝上的位置，拆下玻璃容器，然后取出冻干的样品。</li>
	</ol></li>
	<li>使用分析天平称量 15-50 mg 干燥样品沉淀到 15 mL 离心管中。 注意：如果在此阶段不进一步处理，样品可以放入-80°C储存中。</li>
</ol>2. 游离NPAA的细胞裂解和分级分离
<ol><li>使用微量移液器向样品管（可选）中加入 100 μL 100 ng/mL D5-2，4-DAB（参见 材料表）标准品。</li>
	<li>如果添加D5-2，4-DAB标准品，则分别加入300-600μL的10%w/v三氯乙酸水溶液（TCA，参见 材料表）或300-600μL的11.7%-13.3%TCA。 注意：选择完全覆盖沉淀的TCA水溶液体积。</li>
	<li>将样品管放入装满碎冰的容器中。</li>
	<li>使用中高功率（70%）的探针超声仪（见 材料表），并按照以下步骤裂解样品1分钟。 注意：使用降噪耳罩确保个人防护装备正确。<ol><li>遵循适当的安全规程，通过在门上放置正在使用的标牌、在通风橱中进行超声处理并使用降噪耳罩来准备使用探头超声仪。</li>
		<li>打开超声仪并输入以下参数：振幅，70%;时间，1 分钟</li>
		<li>将70%乙醇喷洒在不起毛的纸巾上（参见 材料表）并擦拭探针。</li>
		<li>将探头末端完全浸入样品中，然后按 开始。</li>
		<li>当探针超声仪停止时，将装有样品的离心管放在冰上1分钟。</li>
		<li>为确保细胞裂解，请再次重复步骤2.4.3-2.4.5。</li>
	</ol></li>
	<li>将样品放入4°C的冰箱中12-24小时以使蛋白质沉淀。</li>
	<li>将10%TCA水溶液在8°C下以3，500× g 离心15分钟。</li>
	<li>使用微量移液器将上清液转移到标有“游离级分”的 2 mL 管中。</li>
	<li>微量移液器 400 μL 10% TCA 水溶液放入含有剩余样品沉淀的离心管中，并通过涡旋搅拌或微量移液器吸头破碎沉淀。</li>
	<li>重复步骤2.6-2.7，将上清液转移到相同的2 mL“游离级分”管中。</li>
	<li>微量移液器 400 μL 10% TCA/丙酮与剩余沉淀一起放入离心管中，并用涡旋或微量移液器吸头分解沉淀。</li>
	<li>将10%TCA /丙酮样品在8°C下以3，500× g离心15分钟。 使用微量移液器将上清液转移到标有“游离级分”的 2 mL 管中。</li>
	<li>将盖子打开的“自由级分”管放入离心蒸发器中（参见 材料表），直到除去所有挥发性液体（至少1小时）。</li>
	<li>一旦样品不含挥发性液体，用密封膜牢固地覆盖试管，并使用锋利的长鼻镊子用几个孔刺穿膜。将样品放入-80°C冰箱中。</li>
	<li>通过重复步骤1.4中的所有步骤冷冻干燥“游离级分”样品。</li>
	<li>微量移液器将200μL的20mM盐酸（HCl）放入“自由级分”管中，以重建冻干样品并将其置于-80°C冷冻储存中。 注意：样品的“游离部分”已准备好在步骤4中进行过滤。剩余的沉淀将在以下步骤中进一步处理以进行蛋白质分离。</li>
</ol>3. 蛋白质结合的NPAA的分级分离
<ol><li>使用玻璃雕刻机在玻璃壳小瓶上标记样品详细信息以进行识别。 注意：强酸可能会耗散墨水标签;因此，建议在玻璃上雕刻标签。</li>
	<li>微量移液器 100 μL 100 ng/mL D5-2，4-DAB 标准品到样品沉淀上（可选）。</li>
	<li>微量移液器 400 μL 100% 丙酮到样品沉淀上，并使用涡旋搅拌或微量移液器吸头分解沉淀。</li>
	<li>使用设置为 1，000 μL 的 1 mL 微量移液器将洗涤和重悬的沉淀转移到相应的玻璃壳小瓶中。 注意：可以将另外 400 μL 100% 丙酮添加到搅拌的沉淀中，以帮助将沉淀完全转移到玻璃壳小瓶中。如有必要，可以重复第三次。</li>
	<li>在25°C下以8，000× g 离心5分钟，然后将液体倒入生物废物中。</li>
	<li>将剩余的沉淀放入离心蒸发器中，直到除去所有液体并且颗粒干燥（~1小时）。</li>
	<li>通过将 1 mL 的 6 M HCl 加入水解瓶底部来制备真空水解小瓶。</li>
	<li>使用镊子小心地将含有干燥样品的标记壳小瓶插入水解瓶中，确保直立、稳定的位置。 注意：如果样品数量小于水解瓶的容量，则可以使用空壳样品瓶来帮助保持样品瓶直立。</li>
	<li>将盖子连接到水解瓶上，然后推动盖子上的红色旋钮以关闭阀门。</li>
	<li>打开真空泵，将真空管连接到水解瓶盖的头部，然后按下盖子上的绿色旋钮打开阀门。</li>
	<li>让真空泵（见 材料表）从小瓶中除去空气1分钟。</li>
	<li>通过按下水解瓶盖上的红色旋钮关闭小瓶，关闭真空泵，然后取出真空管。</li>
	<li>将橡胶管连接到实验室工作台上的氮气龙头上，然后稍微打开水龙头。将拇指放在管子的末端，密封它，并计数，直到随着压力的增加气体开始逸出。这将是下一步的时间框架。将气流调整到合适的时间范围。</li>
	<li>将橡胶管的另一端连接到水解瓶盖的头部，然后立即推动盖子的绿色旋钮。数到步骤3.13中确定的时间，快速推动盖子上的红色旋钮并取出橡胶管。</li>
	<li>重复步骤3.10-3.14两次，以确保玻璃水解瓶不含空气并充满氮气。</li>
	<li>将水解瓶放入110°C的预热烤箱中16-18小时。</li>
	<li>使用烤箱手套从烤箱中取出玻璃水解瓶，让它在通风橱内冷却 10 分钟。在通风橱内，在远离您的同时，推动绿色旋钮以释放压力和气体。</li>
	<li>使用镊子从水解瓶中取出壳小瓶。</li>
	<li>通过将 200 μL 20 mM HCl 微量移液到壳小瓶中来重建水解样品沉淀。确保通过涡旋或使用移液器吸头重新悬浮沉淀。</li>
	<li>将含有重组样品沉淀的壳小瓶在5，300× g和25°C下离心2分钟。</li>
</ol>4. 样品过滤
<ol><li>将含有 0.2 μm 孔膜过滤器的 2 mL 滤管（参见 材料表）标记为“游离级分”和“蛋白质级分”。</li>
	<li>将步骤2.15（游离级分）和步骤3.20（蛋白质级分）中的重组样品转移到相应的滤管中。</li>
	<li>将它们在5，000× g和25°C的离心机中放置30分钟。</li>
	<li>从过滤管中取出过滤器并盖上盖子。样品现在已准备好在步骤5中进行氨基酸衍生化。 注意：样品可以放入-80°C冰箱中储存，以便以后进行衍生化和分析。</li>
</ol>5. 氨基酸衍生化
<ol><li>根据制造商的说明，使用氯甲酸丙酯（PCF）39 或6-氨基喹啉基-N-氢合琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）40 对样品进行衍生化（见 材料表）。</li>
</ol>

作者没有什么可透露的。

此处概述的用于分析NPAA的提取方案适用于分析生物样品中的任何氨基酸。有关分离和培养蓝藻菌株的指南，可以参考Violi等人38在研究中提出的方法。协议的第一步将样品带到一个点，可以实现样品之间相对于干重的归一化。第二步是细胞裂解以释放分析物，可以使用一系列技术进行，包括机械破碎/裂解，例如本协议中所述的探针超声处理，冷冻/解冻循环，研磨和珠磨，以及非机械破碎，例如酶，洗涤剂和/或化学裂解。众所周知，机械破碎优于非机械破碎，因为它允许样品具有更大的裂解能力，同时允许细胞内键和蛋白质保持完整41，尽管样品基质可能决定细胞裂解的最佳方法。
提取氨基酸进行分析时，蛋白质沉淀是该协议的关键第三步。TCA是最常用的溶剂;然而，还使用了高氯酸、丙酮、甲基叔丁基醚 （MTBE）、甲醇和/或乙腈8，42，其中每种萃取溶剂用于萃取和沉淀不同的底物。这里描述的模型从蓝藻基质中提取NPAA BMAA及其异构体，尽管已经使用了一系列不同的溶剂，但最常见的两种是水（水溶液）中的10%TCA和丙酮中的10%TCA。通常，使用TCA进行蛋白质沉淀通常用于提取氨基酸，以从蛋白质结合的氨基酸中分离出游离氨基酸。此外，TCA提取可以确定总蛋白质含量，减少游离级分的污染物，并以最小的蛋白质降解降低蛋白酶的活性43。游离级分的TCA提取的工作原理是首先冲洗掉有机可溶性物质，在沉淀物中留下蛋白质和不溶性化合物，例如细胞壁残留物，然后使用强酸热水解提取蛋白质结合的氨基酸（结合级分）。
与其他有机溶剂44 相比，用10%的TCA水溶液加超声分馏游离级分会产生最广泛的蛋白质沉淀和最佳的氨基酸回收率42。一些研究选择使用酸与有机溶剂（即丙酮43中的10%-20%TCA）结合来沉淀更多的分子，包括较小的肽/生物分子，最大限度地减少蛋白质降解，并减少盐等污染物43。丙酮中10%TCA的另一个优点是其在制备水解沉淀时干燥速度更快，最大限度地减少水分残留以防止氨基酸改性。然而，与单独使用丙酮44 中的10%TCA相比，10%水溶液TCA加超声处理对游离氨基酸的提取效率更高。此外，10%的TCA水沉淀具有局限性，例如干燥时间长，不能沉淀所有蛋白质或小肽/生物分子，并且取决于目标分析物（即蛋白质或氨基酸），需要添加剂和还原剂来防止氧化和降解45，46。
该方案使用10%水性TCA和10%TCA在丙酮中的组合来增加蛋白质沉淀，确保沉淀较小的肽/生物分子，允许更快的颗粒干燥时间，并提高提取效率，利用这两种溶剂萃取特性。然而，10%TCA水溶液和10%TCA丙酮溶液的组合可以在丙酮上清液中的10%TCA与游离水级分结合后，在游离级分中沉淀小肽/生物分子。在这种情况下，沉淀物应转移到结合的馏分中进行水解。
该协议的后半部分涉及在无氧环境中通过酸蒸气水解在高温下 从 蛋白质沉淀中释放氨基酸（即BMAA）。水解步骤的主要限制因素是制备起来既费时又费力。过夜孵育妨碍了快速、省时的样品制备和分析。此外，将颗粒从离心管定量转移到壳瓶（步骤3.4）是一个艰巨的过程，需要勤奋和耐心，以确保干重的准确归一化点。用户可能面临的问题是沉淀转移不完全、湿沉淀蛋白粘附在移液器吸头和原始管上，以及沉淀的固体颗粒阻塞移液器吸头。帮助更轻松地转移颗粒的实用建议是用一把剪刀从移液器尖端去除约0.3-0.5毫米，允许将较大的颗粒吸入并释放到壳瓶中。这种转移方法是所有氨基酸分析中蛋白质提取的常用方法。然而，应研究修改以提高定量将颗粒转移到壳瓶中的效率和准确性。
可以使用两种形式的水解技术将氨基酸从其蛋白质结合状态释放出来：液相水解和酸蒸气水解。液相水解涉及将6M HCl添加到样品上，然后将其置于110°C的烘箱中过夜，是本协议中描述的酸蒸气水解的替代方案。采用液相水解的提取技术可能需要进一步处理，例如脱盐，特别是如果选择AQC衍生化，因为它需要标记的基本条件40。酸蒸气水解避免了脱盐，并允许用户在过滤前重新配制最终颗粒时自由选择衍生化技术。此外，与所选的水解方法无关，样品可能需要进一步处理，例如用于基质纯化和浓度29，47，48的SPE，具体取决于衍生化技术和/或分析分析的选择（例如，反相LC-MS/MS与亲水相互作用液相色谱[HILIC] LC-MS/MS37).在该协议中，在20mM HCl中重建最终沉淀适用于通过市售氨基酸水解试剂盒39使用PCF试剂48进行衍生化（参见材料表）。AQC和PCF均可衍生样品中存在的所有氨基酸、蛋白质和非蛋白质来源，并且通过使用LC-MS/MS及其保留时间匹配以及定量剂和限定剂MRMs38的仔细选择的组合来获得分析物的选择性。 
目前的水解方案尚未针对BMAA，2，4-DAB和AEG的释放进行优化，而是针对基于现有蛋白质水解方法的22种蛋白质氨基酸进行优化32，其中孵育超过18小时会导致某些氨基酸的降解和修饰，从而影响LC-MS / MS分析，从而影响获得的浓度32。Beach等人49 研究了随时间（0.5-120小时）的水解，以优化水解以分析BMAA和蛋白质氨基酸。他们发现，尽管在水解的前0.5小时内BMAA的早期快速释放，但BMAA水平随着水解时间的增加而继续增加，即使在5天后也没有降解49。关于结合的BMAA及其异构体的真实性质，仍然存在不同的观点和问题，一些研究表明，BMAA与蛋白质的结合不是50，51 或错误掺入蛋白质14，而是肤浅的52。然而，目前在分析“结合”BMAA方面的共识需要经过验证和广泛接受的水解步骤，该步骤分解肽/蛋白质以释放氨基酸，从而释放BMAA及其异构体。
Sedgwick等人42 使用TCA提取法测定了20种蛋白质氨基酸的回收率，导致约100%的回收率。就藻类基质中的BMAA及其异构体而言，比较使用各种提取溶剂提取BMAA效率的研究发现，10%TCA对于游离BMAA27是最有效的。Glover等人25 和Faassen等人53的研究确定了使用液相水解提取的蛋白质结合BMAA的回收率，其中准确性通过加标回收方法确定，平均BMAA回收率分别为108.6%和70%。Faassen等人描述了尖峰回收实验的程序，并说明了回收率如何根据提取过程的阶段而有所不同53。Faassen等人还确定了此处介绍的酸蒸气方案的效率，萃取前加标的BMAA异构体的回收率为83.6%，水解前加标的BMAA异构体的回收率为68.6%24。Banack 26进一步验证了这些回收率、提取方法和分析，蓝藻基质中BMAA的回收率为94%-106%，相对标准偏差（%RSD）在5.6%至20%之间，符合FDA的准确性标准54。建议每个实验室在通过尖峰回收实验 使用 本协议之前首先确定其回收率和准确性。Faassen等人53 和Glover等人25 中提出的回收方法可以作为指导。
可以使用替代形式的水解技术代替过夜烘箱水解，以更快地提取分析物的蛋白质结合。例如，微波提取器可以将水解时间从24小时显着减少到10分钟55。氨基酸的微波水解使用与传统热法相同的原理，使用手套箱在无氧环境中制备和组装微波容器，并加入6 M HCl。一旦气密，装有样品的容器就会受到微波辐射。微波水解已被用于从各种样品基质中提取氨基酸56，57，58;然而，微波水解尚未开发和验证用于BMAA的分析。
总之，10%的TCA水性蛋白质沉淀是从蓝藻基质中提取游离非蛋白质氨基酸的最佳方法27，热水解提供了蛋白质结合级分的可靠且可重现的提取。这种从蓝藻中提取NPAA BMAA及其异构体的方案已经过验证并被广泛接受。进一步优化BMAA提取的未来方向将集中在水解步骤上，该步骤是根据22种蛋白质氨基酸的规格进行的。然而，这里介绍的提取方案对于通过LC-MS/MS 分析 BMAA及其异构体仍应被认为是高效和有效的。

氨基酸是含有至少一个胺和羧酸官能团的化合物。一些氨基酸还含有亚氨基，羧酸以外的功能酸基团;其他氨基酸具有不与α-碳基团1相连的胺基。有超过500种氨基酸2，其中22种被称为蛋白质氨基酸，用于核糖体蛋白质合成中的遗传编码3。这22种氨基酸可以进一步细分为必需氨基酸和非必需氨基酸。必需氨基酸是生物体正常运作所必需的，只能通过外部来源获得。非必需氨基酸可以在生物体内合成。将22种氨基酸分为必需/非必需氨基酸是个别物种独有的。所有其他氨基酸都是非蛋白质氨基酸（NPAA），不编码用于蛋白质合成。氨基酸，无论是蛋白质还是非蛋白质，也可以在生物体内发挥信号传导作用，并充当代谢中介4。由于其重要且不同的作用，氨基酸水平可以提供对生物状况、功能和代谢途径等的洞察。氨基酸可以掺入多肽链中有两种主要机制：核糖体蛋白质合成，它利用编码中的22个氨基酸，以及非核糖体肽合成，它与蛋白质氨基酸一起，允许在合成中使用一些NPAA。某些NPAA可以模仿蛋白质氨基酸，可能导致它们误入肽和蛋白质中。错误掺入会导致蛋白质的错误折叠，这反过来又会产生有害影响5，例如错误掺入NPAA L-3，4二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）代替酪氨酸，对细胞功能和健康产生负面影响6，7。掺入NPAA的另一个来源是通过氨基酸残基的翻译后修饰（PTM）。氨基酸残基因各种原因被修饰，包括肽或蛋白质构象、稳定性和功能的变化。在含PTM的蛋白质或肽水解后，这些修饰的氨基酸残基被释放成其游离NPAA形式8，9。
由蓝藻、硅藻和甲藻10 产生的 NPAA β-甲基氨基-L-丙氨酸 （BMAA） 是一种疑似神经毒素，与各种神经退行性疾病有关，例如肌萎缩侧索硬化症/帕金森综合征-痴呆复合体 （ALS-PDC）11，12、肌萎缩侧索硬化症和阿尔茨海默病13.有人建议将BMAA错误地掺入蛋白质多肽链中，以代替L-丝氨酸14 和/或其他蛋白质氨基酸。BMAA的错误掺入可导致蛋白质的错误折叠，导致蛋白质聚集体在神经元中的沉积14。在过去十年中，对BMAA的兴趣显着增加。已经发现来自淡水，海洋和咸水环境的各种蓝藻物种产生BMAA15，导致它们广泛分布到各种生态系统中16，17。此外，BMAA已被证明可以通过食物链生物放大到人类食物网18，19。由于BMAA毒性的潜在健康影响，缺乏理解和不一致，必须继续进一步研究，直到最终了解BMAA的毒性或BMAA被认为是安全的20，21。
生物样品中氨基酸的分析可分为四个主要步骤：样品制备、氨基酸衍生化、分离和检测以及鉴定和定量。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）是首选的分析方法，因为它提供了靶向且可重现的氨基酸分离和分析。
用于分析蓝藻和其他藻类样品的样品制备技术主要涉及游离和蛋白质结合形式的氨基酸的提取方法。多年来，提取方法与常见元素保持相对一致，包括样品的去溶剂化以将游离氨基酸与其结合形式分离，然后进行蛋白质沉淀和通过在高温下用盐酸（HCl）水解释放结合的氨基酸22.这种提取形式已针对蛋白质氨基酸进行了优化，并用于NPAA。然而，在同一种类的蓝藻中对BMAA及其异构体（图1），氨基乙基甘氨酸（AEG）和2，4-二氨基丁酸（2，4-DAB）的检测和定量在文献中显示出不一致的结果，可能的解释在于生长条件和/或产生不同量或没有数量BMAA的藻类菌株的差异23.有人认为，BMAA及其异构体的检测和定量不一致的更可能的解释是由于未经验证的实验方案，使用广泛的分析技术以及报告的方法中实验细节不足16，24 导致实验室间数据不可重复。然而，Glover等人25 和Banack26 最近开发并验证了一种分析技术，用于根据国际分析化学家协会（AOAC），美国药典和FDA单实验室验证所需的指南，使用超高效液相色谱（UPLC）-MS / MS检测和定量BMAA及其异构体。
这些验证实验侧重于BMAA及其异构体的分离和检测，并未解决样品制备方案中的不一致问题。Lage等人27 比较了通过LC-MS/MS 定量 蓝藻样品中BMAA及其异构体的三种常用提取方法的性能：游离氨基酸28，29的固相萃取（SPE）;一种涉及甲醇萃取和丙酮沉淀的蛋白质沉淀法30;以及最常用的BMAA提取方法，用三氯乙酸（TCA）进行蛋白质沉淀31。他们得出结论，TCA蛋白沉淀是最佳方案，与其他提取方法相比，测试样品中的BMAA浓度更高。他们的研究验证了在蓝藻基质中使用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）衍生化BMAA的TCA提取，为实现可靠和可重现的BMAA数据提供了既定的指南。TCA氨基酸提取是一种公认的常用样品制备技术，也可以应用于其他基质。然而，需要考虑氨基酸在水解过程中的稳定性以防止降解或氧化，这可以通过使用化学改性剂和还原剂32来克服。TCA提取是常规使用并教授给新的研究生的，尽管该方案被广泛报道，但应用该方法的视觉辅助是一种宝贵的资源，可确保正确和一致的执行。
反相色谱通常用于分离氨基酸，在分析之前需要进行衍生化步骤。氨基酸（如BMAA）的衍生化允许色谱保留，并可以提高异构体之间的分离度。它还增加了分子质量并改善了质谱仪中的电离。几种衍生化试剂已用于通过LC-MS/MS分析氨基酸，包括氯甲酸丙酯（PCF）33、6-氨基喹啉基-N-氢合琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）27、9-芴基甲基氯甲酸酯（FMOC）34和丹磺酰氯（DC）35。然而，唯一经过验证的分析BMAA技术使用PCF 36或AQC24，26，37作为衍生试剂。
该协议的范围集中在从蓝藻基质中TCA提取NPAA。这是一种劳动密集型方法，在学术和行业研究实验室中经常使用和教授，这些手稿可能缺乏细节;因此，该协议提供了制备样品以分析游离和结合的BMAA作为模型氨基酸所涉及的程序和技术的详细信息。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL glass shell vials</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>REST-24663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.3% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>BR780546-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mM HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z740441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 M HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.11727</td>
			<td>Dilute 70:1 Ethanol:water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C Freezer</td>
			<td>Martin CHRIST</td>
			<td>102142</td>
			<td>Alpha 2-4 Ldplus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>34967-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale Balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal evaporator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13442549</td>
			<td>DNA120-115 SpeedVac Concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP022620100-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D5-2,4-DAB standard</td>
			<td>CDN Isotopes</td>
			<td>D-7568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>CEO-8492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T2318-500EA</td>
			<td>Greiner centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS8161-100EA</td>
			<td>Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass engraver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrolysis vial &#38; Lid</td>
			<td>Eldex Laboratories/Waters</td>
			<td>WAT007568 &#38; WAT007569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice and container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper wipe</td>
			<td>Kimwipes/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.2 M&#937;.cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen tap with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000055-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - noise cancelling headphones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - oven gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td>QSONICA Sonicators</td>
			<td>Q125 Sonicator</td>
			<td>Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample transfer spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis

非蛋白质氨基酸 （NPAA） 是一大类氨基酸 （AA），它们未通过基因编码以翻译成蛋白质。NPAA的分析可以提供有关细胞摄取和/或功能，代谢途径和潜在毒性的关键信息。β-甲氨基-L-丙氨酸（BMAA）是由各种藻类产生的神经毒性NPAA，与神经退行性疾病的风险增加有关，这导致了重大的研究兴趣。提取AA进行分析的方法有很多，其中液相色谱-串联质谱是最常见的，需要蛋白质沉淀，然后酸水解蛋白质沉淀。关于藻类中BMAA存在的研究提供了相互矛盾的结果，使用未经验证的样品制备/提取和分析是主要原因。与大多数NPAA一样，蛋白质沉淀在10%的TCA水溶液中并用发烟的HCl水解是BMAA及其异构体氨乙基甘氨酸（AEG）和2，4-二氨基丁酸（2，4-DAB）的最合适提取形式。本协议描述了研究和教学实验室中常用的经过验证的NPAA提取方法中的步骤。

图2提供了提取方案的图示，作为总结的参考指南。选择Violi等人38获得的结果来代表该提取方案的阳性结果，用于分析蓝藻中的BMAA异构体。从澳大利亚东部的11个淡水地点培养了19种单一的蓝藻。使用相同的方案，将BMAA异构体提取成游离和蛋白质级分，用PCF衍生化，并使用LC-MS / MS进行分析。 其中17种蓝藻分离株BMAA呈阳性，所有19种均含有2，4-DAB异构体。使用经过验证的LC-MS/MS方法，并在预期保留时间内观察至少三次多重反应监测（MRM）通道，一次作为定量离子，两次作为定性离子，从而确认阳性结果。含有BMAA及其异构体的标准品的代表性MRM色谱图（用颜色编码线表示）如图3所示。表1总结了所有19个样品中BMAA和异构体的存在和浓度，以显示游离和结合馏分中的BMAA和异构体浓度。在从利德尔湖（澳大利亚新南威尔士州）收集的Merismopedia物种的游离馏分中观察到所有三种异构体的阳性检测，其中游离馏分含有68.38μg/g干重（DW）±2.25μg/g DW，2，4-DAB的BMAA浓度为2.25μg/g DW，浓度为1，223.98μg/g DW±20.7μg/g DW， 和AEG，浓度为125.27微克/克DW±4.19微克/克DW。色谱MRM如图4所示。为了说明样品中BMAA及其异构体的阴性结果，图5以色谱方式显示了从Walka Water Works（澳大利亚新南威尔士州）收集的微囊藻-水产物种的结合部分。虽然结合馏分不含BMAA、2，4-DAB和/或AEG，但其游离级分含有所有三种异构体，浓度分别为79.86 μg/g DW±1.59 μg/g DW、1，156.15 μg/g DW±8.46 μg/g DW和433.83 μg/g DW±8.92 μg/g DW。
因此，通过使用该协议，Violi等人38 证实了澳大利亚东部淡水蓝藻中BMAA异构体的存在，并确定哪些蓝藻具有产生毒素的能力。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig01.jpg"> 图1：BMAA及其异构体2，4-DAB和AEG的化学结构。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig02.jpg"> 图 2：提取方案的汇总参考图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig03.jpg"> 图 3：含有 D5-2，4-DAB、2，4-DAB、BMAA 和 AEG 的校准标准品的 LC-MS/MS 色谱图，用于基于保留进行异构体鉴定，由突出显示的峰表示。 钥匙：D5-2，4-DAB 338.01 米/> 6.4 分钟时 278.10 米/兹（红色），2，4-DAB 333.01 米/> 6.4 分钟时 273.10 米/兹（绿色），AEG 333.01 米/> 88.00 米/兹（7.4 分钟时）（橙色），BMAA 333.01 米/> 187.10 米/兹（蓝色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig04.jpg"> 图 4：用于检测从利德尔湖（澳大利亚新南威尔士州）采集的Merismopedia物种中D5-2，4-DAB、2，4-DAB、BMAA和AEG的LC-MS/MS色谱图，由突出显示的峰表示。 钥匙：D5-2，4-DAB 338.01 米/> 6.4 分钟时 278.10 米/兹（红色），2，4-DAB 333.01 米/> 6.4 分钟时 273.10 米/兹（绿色），AEG 333.01 米/> 88.00 米/兹（7.4 分钟时）（橙色），BMAA 333.01 米/> 187.10 米/兹（蓝色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig05.jpg"> 图 5：从 Walka Water Works（澳大利亚新南威尔士州）收集的 2，4-DAB、BMAA 和 AEG 阴性对照的 2，4-DAB、BMAA 和 AEG 色谱图。 键：D5-2，4-DAB 338.01 m/z > 6.4 分钟时为 278.10 m/z（红色 - 峰值突出显示），2，4-DAB 333.01 m/z > 6.4 分钟时为 273.10 m/z（绿色），AEG 333.01 m/z > 7.4 分钟时为 88.00 m/z（橙色），BMAA 333.01 m/z > 7.8 分钟时为 187.10 m/z（蓝色）。虚线表示缺失的 2，4-DAB、AEG 和 BMAA 的保留时间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
表 1：蓝藻分离株中的 BMAA、AEG 和 2，4-DAB 浓度。 浓度 ± 平均值的标准误差 （n = 3）。ND 表示未检测到。检测到的每种异构体的最高浓度以绿色突出显示。该表是Violi等人38的修改版本。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779_Table%201.xlsx" target="_blank">请按此下载此表格。</a>

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Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

本协议描述了在使用液相色谱-串联质谱分析之前通过三氯乙酸（TCA）蛋白质沉淀和酸水解 从 生物基质中提取非蛋白质氨基酸。

从蓝藻中提取非蛋白质氨基酸用于液相色谱-串联质谱分析

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

该协议将帮助用户并教学生提取BMA，AEG和2，4-DAB的正确步骤。从而最大限度地减少出错的机会并产生一致的结果。该方法是提取桑拿细菌基质中BMA及其异构体AEG和2，4-DAB的常用和验证方法。该方法可用于进一步研究BMA的毒性，并提供有关BMA及其相关健康影响的更深入的了解。首先将蓝藻样品在3， 500 G下在25摄氏度下离心10分钟。并将上清液丢弃到生物废物中。用密封膜盖住装有颗粒的离心管，并使用锋利的长鼻镊子在薄膜上刺穿几个孔。然后将管子直立存放在零下 80 摄氏度。30分钟后，将管子直立放入冷冻干燥器玻璃容器中，然后将容器放入零下80摄氏度的冰箱中冷却五分钟。从冰箱中取出玻璃容器并盖上橡胶盖。确保冷冻干燥机橡胶阀出口上的手柄朝上并排放到大气中。牢固地连接玻璃容器。慢慢转动橡胶阀出口的手柄，将其指向向下位置，将罐子暴露在真空中。并允许长达 24 小时的冷冻干燥以升华所有液体。完成后，将15至50毫克冷冻样品颗粒称入15毫升离心管中。使用分析天平。向样品中加入300至600微升10%三氯乙酸水溶液或TCA。将样品管放入装满碎冰的容器中。在将探头末端完全浸入样品中并按下开始之前，用喷有 70% 乙醇的无绒纸擦拭超声仪探头。完成后，将含有离心管的样品放在冰上一分钟。并重复超声处理过程以确保细胞裂解。将样品在4摄氏度下冷却24小时后。在 3， 500 G 下在 8 摄氏度下离心 15 分钟。然后使用微量移液管，将上清液转移到标记的游离级分的两毫升管中。向样品沉淀中加入400微升10%TCA水溶液，并通过涡旋搅拌或微量移液器吸头分解沉淀。离心并将上清液转移到相同的两毫升游离馏分管中。使用10%TCA丙酮第三次重复此步骤。将盖子打开的自由馏分管放入离心蒸发器中，直到除去所有挥发性液体。一旦样品不含挥发性液体，用天花板膜牢固地覆盖管子，并使用锋利的长鼻镊子用几个孔刺穿薄膜。在前面演示的冷冻干燥后，用200微升20毫摩尔盐酸重新配制样品，并将其置于零下80摄氏度的冰箱中。使用微量移液管将400微升100%丙酮添加到样品沉淀中，并使用涡旋搅拌或微量移液器尖端分解沉淀。定量地将洗涤和重悬的颗粒转移到相应的玻璃壳小瓶中。使用一毫升微量移液器。向样品管中再加入400微升丙酮，以帮助转移剩余的沉淀。离心并将上清液倒入生物废物中，然后在离心蒸发器中干燥沉淀，直到液体被除去并且沉淀干燥。为了制备真空水解文件，在水解文件的底部加入一毫升六摩尔盐酸。使用镊子小心地将带有干燥样品的标记贝壳小瓶插入水解文件中，确保直立稳定的位置。将盖子连接到水解文件，然后推动盖子上的红色旋钮以关闭阀门。打开真空泵后，将真空管连接到水解文件盖的头部，然后按下盖子上的绿色旋钮以打开阀门。接下来，让真空泵从小瓶中取出空气一分钟。然后通过按下水解瓶盖上的红色旋钮来关闭小瓶。关闭真空泵并拆下真空管。将橡胶管连接到实验室工作台上的氮气龙头上。并稍微打开水龙头。将拇指放在管子的末端，密封并计数，直到随着压力的增加气体开始逸出。接下来，将橡胶管的另一端连接到水解瓶盖的头部。并立即推动盖子的绿色旋钮。计算气体逸出所需的时间。快速推动盖子上的红色旋钮并取下橡胶管。重复整个真空处理过程两次。确保玻璃水解瓶不含空气并充满氮气。将水解瓶放入预热的烤箱中，设置为110摄氏度16至18小时。使用烤箱手套，从烤箱中取出玻璃水解瓶。让小瓶在通风橱内冷却 10 分钟，然后推动绿色旋钮，同时将其朝外以释放压力和气体。用200微升20摩尔盐酸将水解样品沉淀复溶到壳瓶中，并重悬沉淀。将含有重组样品沉淀的壳小瓶在5，300G和25摄氏度下离心两分钟。将重组的游离级分样品和蛋白质级分转移到含有0.2微米孔径膜过滤器的两个毫升过滤管中，并标记为游离级分和蛋白质级分。将试管在5，000G和25摄氏度下离心30分钟。此处显示了含有β-甲氨基-L-丙氨酸或BMAA的标准品及其异构体的多反应监测色谱图，用颜色编码线表示。在从利德尔湖收集的Merismopedia物种的游离部分中观察到所有三种异构体BMAA，DAB和AEG的阳性检测结果。而从瓦卡水厂收集的微囊藻-水族物种的结合部分表明BMAA及其异构体的结果为阴性。重悬的沉淀必须定量转移到相应的壳小瓶中，以允许基于蓝藻质量的准确归一化点。在执行此步骤时，建议患者和尽职调查。按照此过程操作。提取的馏分必须经过失活步骤以允许反向相。液相色谱、串联质谱分析。该技术的应用扩展了各种科学领域。包括通过分析环境样品中的犬类毒素来研究环境科学。以及毒理学和生物化学等领域，通过对BMA误入理论的研究。

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