Name: extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-12-09T12:40:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

D.P.B., K.J.R. og S.M.M. er støttet af The Ian Potter Foundation, og J.P.V. er modtager af et australsk regerings forskningsuddannelsesprogram, Stipend.

Cyanobakteriearten Merismopedia blev anvendt til denne undersøgelse38.
1. Forberedelse af rå prøver
<ol><li>Saml algeskummet fra den akvatiske kilde af interesse eller fra en cyanobakteriel dyrket kolbe og læg den i 50 ml centrifugerør38. BEMÆRK: Prøven skal fryses ved -20 °C til senere ekstraktioner og optøes inden følgende trin.</li>
	<li>Rørene med prøven centrifugeres ved 3.500 x g i 10 minutter ved 25 °C. Dekanter supernatanten i en affaldsbeholder og smider den i biologisk affald. BEMÆRK: Supernatanten kan være forbeholdt fremtidig analyse af exosomet.</li>
	<li>Dæk røret, der indeholder prøvepellet, sikkert med en tætningsfilm (se Materialetabel), og gennembor et par huller i filmen ved hjælp af en skarp, lang næsepincet. Opbevar røret i opretstående stilling ved -80 °C i 30 min.</li>
	<li>Tænd og ligevægt frysetørreren ved 0,1 mbar og -80 °C (~30 min). BEMÆRK: Parametrene (trin 1.4) er optimeret til den frysetørrer, der anvendes til denne undersøgelse (se Materialetabel). Følg standardprocedurerne i henhold til frysetørrermodellen, der er tilgængelig i laboratoriet, eller indstil den lavest mulige temperatur, hvis frysetørrermodellen ikke går så lavt som -80 °C.<ol><li>Anbring centrifugerørene lodret i en frysetørrerglasbeholder, og læg det i -80 °C fryseren i 5 minutter for at afkøle krukken.</li>
		<li>Fjern glasbeholderen fra fryseren, og fastgør gummilåget.</li>
		<li>Sørg for, at håndtaget på frysetørrerens gummiventiludløb er udluftet i atmosfæren (peger opad), og fastgør glasbeholderen fast.</li>
		<li>Drej håndtaget på gummiventiludløbet meget langsomt til pegende nedadgående position for at udsætte krukken for vakuumet, og lad op til 24 timers frysetørring sikre sublimering af al væsken.</li>
		<li>For at frigøre vakuumet i krukken skal du dreje håndtaget til den pegende opadgående position, løsne glasbeholderen og fjerne de frysetørrede prøver.</li>
	</ol></li>
	<li>Brug en analysevægt til at veje 15-50 mg tørrede prøvepiller i et 15 ml centrifugerør. BEMÆRK: Prøverne kan opbevares i -80 °C, hvis de ikke behandles yderligere på dette stadium.</li>
</ol>2. Cellelysering og fraktionering af frie NPAA'er
<ol><li>Der tilsættes 100 μL 100 ng/ml D5-2,4-DAB (se materialetabel) standard ved hjælp af en mikropipette til prøverøret (valgfrit).</li>
	<li>Der tilsættes henholdsvis 300-600 μL 10 % w/v vandigt trichloreddikesyre (TCA, se materialetabel) eller 300-600 μL på 11,7 %-13,3 % TCA, hvis D5-2,4-DAB-standarden tilføjes. BEMÆRK: Vælg et volumen vandig TCA, der dækker pelleten fuldt ud.</li>
	<li>Anbring prøverørene i en beholder fyldt med knust is.</li>
	<li>Brug en sondesonikator (se Materialetabel) ved middelhøj effekt (70%) og lys prøven i 1 min ved at følge nedenstående trin. FORSIGTIG: Sørg for korrekt PPE ved brug af støjreducerende høreværn.<ol><li>Følg de relevante sikkerhedsprotokoller som forberedelse til brugen af sondesonikatoren ved at placere skiltning under brug på døren, udføre sonikering i røghætten og bruge støjreducerende høreværn.</li>
		<li>Tænd for sonikatoren og indtast følgende parametre: amplitude, 70%; tid, 1 min.</li>
		<li>Sprøjt 70% ethanol på en fnugfri papirserviet (se Materialetabel) og tør sonden af.</li>
		<li>Nedsænk slutningen af sonden helt i prøven, og tryk på start.</li>
		<li>Når sondens sonikator stopper, placeres centrifugerøret indeholdende prøven på is i 1 min.</li>
		<li>For at sikre, at cellerne lyseres, skal du gentage trin 2.4.3-2.4.5 igen.</li>
	</ol></li>
	<li>Anbring prøven i et køleskab ved 4 °C i 12-24 timer for at tillade proteinudfældning.</li>
	<li>Den 10 % vandige TCA-prøve centrifugeres ved 3.500 x g i 15 minutter ved 8 °C.</li>
	<li>Brug en mikropipette til at overføre supernatanten til et 2 ml rør mærket "Free Fraction".</li>
	<li>Micropipette 400 μL 10% vandig TCA i centrifugerøret indeholdende den resterende prøvepellet og bryde pelleten op enten ved hvirvelomrøring eller med mikropipettespidsen.</li>
	<li>Gentag trin 2.6-2.7, overfør supernatanten til det samme 2 ml "Free Fraction" rør.</li>
	<li>Micropipette 400 μL 10% TCA/acetone ind i centrifugerøret med den resterende pellet og bryd pelleten op med hvirvel eller mikropipettespidsen.</li>
	<li>10 % TCA/acetoneprøven centrifugeres ved 3.500 x g i 15 minutter ved 8 °C. Brug en mikropipette til at overføre supernatanten til 2 ml røret mærket "Free Fraction".</li>
	<li>Anbring "Free Fraction" -røret med låget åbent i en centrifugalfordamper (se Materialetabel), indtil alle flygtige væsker er fjernet (mindst 1 time).</li>
	<li>Når prøven er fri for flygtige væsker, skal du dække røret sikkert med tætningsfilm og gennembore filmen med et par huller ved hjælp af en skarp, lang næsepincet. Prøven anbringes i en -80 °C fryser.</li>
	<li>Prøven "Free Fraction" fryses tør ved at gentage alle trinnene i trin 1.4.</li>
	<li>Micropipette 200 μL 20 mM saltsyre (HCI) i "Free Fraction" røret for at rekonstituere den frysetørrede prøve og placere den i -80 °C fryseopbevaring. BEMÆRK: Den "frie fraktion" af prøven er klar til filtrering i trin 4. Den resterende pellet vil blive yderligere behandlet i de følgende trin til proteinfraktionering.</li>
</ol>3. Fraktionering af de proteinbundne NPAA'er
<ol><li>Brug en glasgravør til at mærke hætteglas med glasskal med prøvedetaljerne til identifikation. BEMÆRK: Stærk syre kan sprede blækmærkning; Derfor anbefales gravering af etiketterne på glas.</li>
	<li>Micropipette 100 μL af 100 ng/ml D5-2,4-DAB standard på prøvepellet (valgfrit).</li>
	<li>Micropipette 400 μL 100% acetone på prøvepelleten og opdel pelleten ved hjælp af enten hvirvelomrøring eller mikropipettespidsen.</li>
	<li>Brug en 1 ml mikropipette indstillet til 1.000 μL til at overføre den vaskede og resuspenderede pellet til det tilsvarende hætteglas med glasskal. BEMÆRK: Yderligere 400 μL 100% acetone kan tilsættes til den agiterede pellet for at hjælpe med fuldstændig overførsel af pellet til glasskalhætteglasset. Dette kan gentages en tredje gang, hvis det er nødvendigt.</li>
	<li>Der centrifugeres ved 8.000 x g i 5 minutter ved 25 °C, og væsken dekanteres til biologisk affald.</li>
	<li>Anbring den resterende pellet i en centrifugalfordamper, indtil al væsken er fjernet, og pelleten er tør (~ 1 time).</li>
	<li>Hætteglasset med vakuumhydrolyse forberedes ved at tilsætte 1 ml 6 M HCl i bunden af hætteglasset med hydrolyse.</li>
	<li>Brug pincet til omhyggeligt at indsætte de mærkede hætteglas med skal, der indeholder de tørrede prøver, i hydrolysehætteglasset, hvilket sikrer en opretstående, stabil position. BEMÆRK: Tomme hætteglas kan bruges til at hjælpe med at holde prøveglassene oprejst, hvis antallet af prøver er mindre end hydrolysehætteglassets kapacitet.</li>
	<li>Fastgør låget til hydrolysehætteglasset, og tryk på den røde knap på låget for at lukke ventilen.</li>
	<li>Tænd for vakuumpumpen, fastgør vakuumrøret til hovedet på hætteglassets låg til hydrolyse, og tryk på den grønne knap på låget for at åbne ventilen.</li>
	<li>Lad vakuumpumpen (se Materialeoversigt) fjerne luften fra hætteglasset i 1 min.</li>
	<li>Luk hætteglasset ved at trykke den røde knap på hætteglassets låg til hydrolyse, sluk for vakuumpumpen, og fjern vakuumrøret.</li>
	<li>Fastgør et gummirør til nitrogengashanen på laboratoriebænken, og åbn hanen lidt. Placer tommelfingeren i rørets ende, forsegl den og tæl, indtil gassen begynder at slippe ud, når trykket opbygges. Dette vil være tidsrammen for det næste skridt. Juster gasstrømmen til en passende tidsramme.</li>
	<li>Fastgør den anden ende af gummirøret til hovedet på hydrolyseflaskens låg, og tryk derefter straks på lågets grønne knap. Tæl til den tid, der er bestemt i trin 3.13, og tryk hurtigt på den røde knap på låget, og fjern gummirøret.</li>
	<li>Gentag trin 3.10-3.14 to gange for at sikre, at hætteglasset med hydrolyse er fri for luft og fyldt med nitrogengas.</li>
	<li>Hætteglasset med hydrolyse anbringes i en forvarmet ovn, der er indstillet til 110 °C i 16-18 timer.</li>
	<li>Brug ovnhandsker til at fjerne hætteglasset med hydrolyse fra ovnen og lade det køle af inde i røghætten i 10 minutter. Inde i røghætten, mens du vender den væk fra dig, skal du trykke på den grønne knap for at frigive tryk og gas.</li>
	<li>Brug pincet til at fjerne hætteglassene med skallen fra hydrolysehætteglasset.</li>
	<li>De hydrolyserede prøvepiller rekonstitueres ved mikropipettering af 200 μL af 20 mM HCl i hætteglasset med skal. Sørg for, at pelleten er resuspenderet ved enten hvirvel eller ved hjælp af en pipettespids.</li>
	<li>Hætteglassene med skallen med de rekonstituerede prøvepiller centrifugeres i 2 minutter ved 5,300 x g og 25 °C.</li>
</ol>4. Filtrering af prøver
<ol><li>Mærk 2 ml filterrør (se materialetabel), der indeholder 0,2 μm poremembranfiltre, som "Free Fraction" og "Protein Fraction".</li>
	<li>De rekonstituerede prøver overføres fra trin 2.15 (fri fraktion) og trin 3.20 (proteinfraktion) til de tilsvarende filterrør.</li>
	<li>Anbring dem i centrifugen i 30 minutter ved 5.000 x g og 25 °C.</li>
	<li>Fjern filtrene fra filterrørene, og dæk dem. Prøverne er nu klar til aminosyrederivatisering i trin 5. BEMÆRK: Prøverne kan anbringes i -80 °C fryseren til opbevaring til senere derivatisering og analyse.</li>
</ol>5. Aminosyrederivatisering
<ol><li>Afled prøverne ved hjælp af propylchloroformat (PCF)39 eller 6-aminoquinolyl-N-hydrosysuccinimidylcarbamate (AQC)40 i henhold til producentens anvisninger (se Materialetabel).</li>
</ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Ekstraktionsprotokollen, der er skitseret her til analyse af NPAA'er, gælder for analyse af aminosyrer i biologiske prøver. For vejledninger om isolering og dyrkning af cyanobakterielle stammer kan man henvise til de metoder, der præsenteres i undersøgelsen af Violi et al.38. Det første trin i protokollen tager prøven til et punkt, hvor normalisering mellem prøver mod tørvægten kan opnås. Det andet trin er cellelyse for at frigive analysanderne og kan udføres ved hjælp af en række teknikker, herunder mekaniske forstyrrelser / lyser såsom sonde sondering som beskrevet i denne protokol, fryse- / optøningscyklusser, slibning og perlefræsning og ikke-mekaniske forstyrrelser såsom enzymatisk, vaskemiddel og / eller kemisk lyse. Mekanisk forstyrrelse er kendt for at være fordelagtig i forhold til ikke-mekanisk, da det giver mulighed for en større kapacitet af prøven til at lyse, samtidig med at de intracellulære bindinger og proteiner forbliver intakte41, selvom prøvematrixen kan diktere den optimale metode til cellelysning.
Proteinudfældning er det kritiske tredje trin i denne protokol, når aminosyrer ekstraheres til analyse. TCA er det mest almindeligt anvendte opløsningsmiddel; Der er dog også anvendt perchlorsyre, acetone, methyltert-butylether (MTBE), methanol og/eller acetonitril 8,42, hvor hvert ekstraktionsopløsningsmiddel har til formål at ekstrahere og udfælde forskellige substrater. Den her beskrevne model ekstraherer NPAA BMAA og dets isomerer fra en cyanobakteriel matrix, og selvom der er anvendt en række forskellige opløsningsmidler, er de to mest almindelige 10% TCA i vand (vandig) og 10% TCA i acetone. Generelt er proteinudfældning med TCA almindeligt anvendt til at ekstrahere aminosyrer til fraktionering af frie aminosyrer fra de proteinbundne aminosyrer. Derudover giver TCA-ekstraktion mulighed for at bestemme det samlede proteinindhold, reducere forurenende stoffer til den frie fraktion og reducere proteasernes aktivitet med minimal proteinnedbrydning43. TCA-ekstraktionen af den frie fraktion virker ved først at skylle organisk opløselige stoffer ud og efterlade proteiner og uopløselige forbindelser såsom cellevægsrester i bundfaldet, som derefter efterfølges af termisk hydrolyseekstraktion af de proteinbundne aminosyrer (bundet fraktion) ved anvendelse af en stærk syre.
Fraktioneringen af den frie fraktion med 10% vandig TCA plus sonikering producerer den mest omfattende proteinudfældning sammenlignet med andre organiske opløsningsmidler44 og den bedste aminosyregenvinder42. Nogle undersøgelser vælger at bruge en syre kombineret med et organisk opløsningsmiddel (dvs. 10% -20% TCA i acetone 43) til at udfælde flere molekyler, herunder mindre peptider / biomolekyler, minimere proteinnedbrydning og reducere forurenende stoffer såsom salte43. En anden fordel ved 10% TCA i acetone er dens hurtigere tørringshastighed ved fremstilling af pellet til hydrolyse, hvilket minimerer fugtrester for at forhindre aminosyremodifikation. Imidlertid har 10% vandig TCA plus sonikering bedre ekstraktionseffektivitet af frie aminosyrer sammenlignet med 10% TCA i acetone44 alene. Derudover har 10% vandig TCA-udfældning begrænsninger såsom en lang tørretid, ikke at være i stand til at udfælde alle proteiner eller små peptider / biomolekyler og afhængigt af analytten af interesse (dvs. proteiner eller aminosyrer), der kræver additiver og reduktionsmidler for at forhindre oxidation og nedbrydning45,46.
Denne protokol bruger en kombination af 10% vandig TCA og 10% TCA i acetone for at øge proteinudfældningen, sikre, at mindre peptider / biomolekyler udfældes, giver mulighed for hurtigere pellettørringstider og øger ekstraktionseffektiviteten, idet man drager fordel af begge opløsningsmiddelekstraktionsegenskaber. Kombinationen af 10% vandig TCA og 10% TCA i acetone kan imidlertid udfælde små peptider / biomolekyler i den frie fraktion, efter at 10% TCA i acetonesupernatant kombineres med den vandige frie fraktion. I dette tilfælde skal bundfaldene overføres til den bundne fraktion til hydrolyse.
Den anden halvdel af denne protokol involverer frigivelse af aminosyrer (dvs. BMAA) fra proteinpellet via syre-damphydrolyse ved forhøjede temperaturer i et iltfrit miljø. Den overvejende begrænsende faktor for hydrolysetrinnet er, at det er tidskrævende og besværligt at forberede. Inkubationen natten over forhindrer hurtig og tidseffektiv prøveforberedelse og analyse. Derudover er den kvantitative overførsel af pelleten fra et centrifugerør til et hætteglas (trin 3.4) en vanskelig proces, der kræver omhu og tålmodighed for at sikre et nøjagtigt normaliseringspunkt til tørvægten. Mulige problemer, som brugeren kan stå over for, er ufuldstændig overførsel af pellet, våde udfældede proteiner, der klæber til pipettespidser og det originale rør, og faste partikler af pelleten, der blokerer pipettespidsen. Et praktisk forslag til at hjælpe med en lettere overførsel af pelleten er at fjerne ca. 0,3-0,5 mm fra enden af pipettespidsen med en saks, så større pelletspartikler kan trækkes og frigives i hætteglasset med skallen. Denne overførselsmetode er almindelig praksis for proteinekstraktion for alle aminosyreanalyser. Ændringer for at forbedre effektiviteten og nøjagtigheden af kvantitativ overførsel af pelleten til hætteglasset med skal bør dog undersøges.
To former for hydrolyseteknikker kan anvendes til at frigive aminosyrer fra deres proteinbundne tilstand: væskefasehydrolyse og syredamphydrolyse. Væskefasehydrolyse, som indebærer tilsætning af 6 M HCI til prøven, som derefter anbringes i en 110 °C ovn natten over, er et alternativ til syre-damphydrolysen beskrevet i denne protokol. Ekstraktionsteknikker, der anvender væskefasehydrolyse, kan kræve yderligere behandling, såsom afsaltning, især hvis AQC-derivatisering vælges, da det kræver grundlæggende betingelser for mærkningaf 40. Syre-damphydrolyse undgår afsaltning og giver brugeren frihed til at vælge derivatiseringsteknikken ved rekonstitution af den endelige pellet inden filtrering. Uafhængigt af den valgte hydrolysemetode kan prøverne desuden kræve yderligere behandling, såsom SPE til matrixrensning og koncentration 29,47,48, afhængigt af valget af derivatiseringsteknik og/eller analytisk analyse (f.eks. omvendt fase LC-MS/MS vs. hydrofil interaktionsvæskekromatografi [HILIC] LC-MS/MS 37 ). Rekonstitutionen af den endelige pellet i 20 mM HCI i denne protokol er egnet til derivatisering ved anvendelse af PCF-reagenser48via et kommercielt tilgængeligt aminosyrehydrolysesæt39 (se materialetabel). Både AQC og PCF vil aflede alle aminosyrer, protein og ikke-protein i oprindelse, der er til stede i prøven, og analysandernes selektivitet opnås ved brug af LC-MS / MS og dens kombination af retentionstidsmatchning og omhyggelig udvælgelse af kvantifikatoren og kvalifikatorenMRMs 38. 
Nuværende hydrolyseprotokoller er ikke optimeret til frigivelse af BMAA, 2,4-DAB og AEG, men til de 22 proteinaminosyrer baseret på eksisterende metoder til proteinhydrolyse 32, hvor inkubation i mere end 18 timer resulterer i nedbrydning og modifikation af visse aminosyrer, der påvirker LC-MS / MS-analyse og dermed de opnåede koncentrationer32. Beach et al.49 undersøgte hydrolyse over tid (0,5-120 timer) for at optimere hydrolyse til analyse af BMAA og de proteinogene aminosyrer. De fandt ud af, at selvom der var en tidlig hurtig frigivelse af BMAA i løbet af de første 0,5 timer af hydrolysen, fortsatte BMAA-niveauerne med at stige, da hydrolysetiden steg uden nedbrydning, selv efter 5 dage49. Der er også stadig forskellige synspunkter og spørgsmål om den sande natur af bundet BMAA og dets isomerer, hvor nogle undersøgelser tyder på, at BMAA-proteinforeningen i stedet for BMAA-binding50,51 eller forkert inkorporering i protein14 er overfladisk 52. Den nuværende konsensus i analysen af "bundet" BMAA kræver imidlertid det validerede og bredt accepterede hydrolysetrin, der nedbryder peptider / proteiner for at frigive aminosyrer og dermed BMAA og dets isomerer.
Genvindingshastighederne for 20 proteinaminosyrer blev bestemt i en undersøgelse af Sedgwick et al.42 ved anvendelse af TCA-ekstraktion, hvilket resulterede i ca. 100% genopretning. I tilfælde af BMAA og dets isomerer fra algematricer har undersøgelser, der sammenligner effektiviteten af BMAA-ekstraktion ved hjælp af forskellige ekstraktionsmidler, fundet, at 10% TCA er den mest effektive gratis BMAA27. Gendannelseshastighederne for proteinbundet BMAA ekstraheret ved anvendelse af væskefasehydrolyse blev fastlagt i undersøgelser af Glover et al.25 og af Faassen et al.53, hvor nøjagtigheden blev bestemt ved spikede genopretningsmetoder med en gennemsnitlig BMAA-genopretningshastighed på henholdsvis 108,6% og 70%. Faassen et al. beskrev procedurer for spike-recovery eksperimenter og illustrerede, hvordan genopretningen varierer afhængigt af det stadium af ekstraktionsprocessen, spidsen blev foretaget53. Faassen et al. bestemte desuden effektiviteten af syre-dampprotokollen, der præsenteres her, med genvindingshastigheder på 83,6% for BMAA-isomerer, der er spidset før ekstraktion og 68,6% for dem, der er spidset før hydrolyse24. Disse gendannelser, ekstraktionsmetoder og analyser blev yderligere valideret af Banack 26 med genvindingsrater på 94% -106% for BMAA i en cyanobakteriel matrix og en% relativ standardafvigelse (% RSD) mellem 5,6% og20%, der opfylder FDA-kriterierne for nøjagtighed54. Det anbefales, at hvert laboratorium først fastlægger sine gendannelseshastigheder og nøjagtighed, før de bruger denne protokol via spike recovery eksperimenter. De genfindingsmetoder, der er præsenteret i Faassen et al.53 og Glover et al.25 , kan følges som vejledning.
Alternative former for hydrolyseteknikker kan anvendes i stedet for ovnhydrolyse natten over for hurtigere proteinbundet ekstraktion af analysanden. For eksempel kan en mikrobølgeudsugning reducere hydrolysetiden betydeligt fra 24 timer til så lidt som 10 minutter55. Mikrobølgehydrolyse for aminosyrer bruger de samme principper som den konventionelle termiske metode ved hjælp af et handskerum til at forberede og samle mikrobølgebeholderen i et iltfrit miljø og tilføje 6 M HCI. Når beholderen indeholder prøven, er lufttæt, gennemgår den mikrobølgestråling. Mikrobølgehydrolyse er blevet brugt til at ekstrahere aminosyrer fra forskellige prøvematricer56,57,58; Mikrobølgehydrolyse er dog endnu ikke udviklet og valideret til analyse af BMAA.
Afslutningsvis er 10% vandig TCA-proteinudfældning den optimale metode til at ekstrahere frie ikke-proteinaminosyrer fra cyanobakterielle matricer27, og termisk hydrolyse giver en pålidelig og reproducerbar ekstraktion af den proteinbundne fraktion. Denne protokol til ekstraktion af NPAA BMAA og dets isomerer fra cyanobakterier er valideret og bredt accepteret. Fremtidige retninger for yderligere at optimere ekstraktionen af BMAA vil fokusere på hydrolysetrinnet, som udføres i henhold til specifikationerne for de 22 proteinaminosyrer. Den ekstraktionsprotokol, der præsenteres her, bør dog stadig betragtes som effektiv og effektiv til analyse af BMAA og dets isomerer via LC-MS / MS.

Aminosyrer er kemiske forbindelser, der indeholder mindst en amin- og carboxylfunktionel gruppe. Nogle aminosyrer indeholder også en iminogruppe, en funktionel syregruppe bortset fra carboxyl; Andre aminosyrer har amingrupper, der ikke er bundet til α-carbon-gruppe1. Der er over 500 aminosyrer2, hvoraf 22 er kendt som proteinaminosyrer, der anvendes til genetisk kodning i ribosomal proteinsyntese3. Disse 22 aminosyrer kan yderligere opdeles i essentielle og ikke-essentielle. Essentielle aminosyrer er nødvendige for, at en organisme kan fungere korrekt og kan kun erhverves af eksterne kilder. Ikke-essentielle aminosyrer kan syntetiseres i organismen. Klassificeringen af de 22 aminosyrer i essentielle /ikke-essentielle er unik for individuelle arter. Alle andre aminosyrer er ikke-proteinaminosyrer (NPAA'er), der ikke er kodet til proteinsyntese. Aminosyrer, hvad enten de er protein- eller ikke-proteinfattige, kan også spille en signalrolle i en organisme og fungere som metaboliske mellemled4. På grund af deres vigtige og varierende roller kan aminosyreniveauer give et indblik i organismens tilstand, funktionalitet og metaboliske veje osv. Der er to hovedmekanismer, hvormed aminosyrer kan inkorporeres i en polypeptidkæde: ribosomal proteinsyntese, der udnytter de 22 aminosyrer i kodning, og ikke-ribosomal peptidsyntese, som sammen med proteinaminosyrer giver mulighed for anvendelse af nogle NPAA'er i syntese. Visse NPAA'er kan efterligne proteinaminosyrer, hvilket potentielt kan føre til deres misinkorporering i peptider og proteiner. Misinkorporeringen forårsager en fejlfoldning af proteiner, som igen har skadelige virkninger5, såsom fejlinkorporering af NPAA L-3,4 dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) i stedet for tyrosin, negativt påvirker cellulær funktion og sundhed 6,7. En yderligere kilde til inkorporerede NPAA'er er gennem posttranslationel modifikation (PTM) af aminosyrerester. Aminosyrerester modificeres af forskellige årsager, herunder ændringer i peptid- eller proteinkonformation, stabilitet og funktionalitet. Ved hydrolyse af PTM-holdigt protein eller peptider frigives disse modificerede aminosyrerester i deres frie NPAA-form 8,9.
NPAA β-methylamino-L-alanin (BMAA) produceret af cyanobakterier, diatomer og dinoflagellater10 er et mistænkt neurotoksin, der er impliceret som en medvirkende faktor til forskellige neurodegenerative sygdomme såsom amyotrofisk lateral sklerose / parkinsonisme-demenskompleks (ALS-PDC) 11,12, amyotrofisk lateral sklerose og Alzheimers sygdom 13 . Det foreslås, at BMAA fejlagtigt inkorporeres i polypeptidkæden af proteiner i stedet for L-serin14 og / eller andre proteinaminosyrer. Misinkorporeringen af BMAA kan føre til fejlfoldning af proteiner, hvilket resulterer i aflejring af proteinaggregater i neuroner14. I det sidste årti er interessen for BMAA steget betydeligt. En bred vifte af cyanobakterielle arter fra ferskvands-, marine- og brakvandsmiljøer er blevet opdaget at producere BMAA15, hvilket fører til deres udbredte distribution i forskellige økosystemer16,17. Derudover har BMAA vist sig at biomagnificere gennem fødekæden til det menneskelige fødenet18,19. På grund af de potentielle sundhedseffekter, manglende forståelse og inkongruenser af BMAA-toksicitet er det bydende nødvendigt at fortsætte yderligere forskning, indtil enten BMAA's toksicitet i sidste ende forstås, eller BMAA anses for sikker20,21.
Analysen af aminosyrer i biologiske prøver kan opdeles i fire hovedtrin: prøveforberedelse, aminosyrederivatisering, adskillelse og påvisning samt identifikation og kvantificering. Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) er den foretrukne analysemetode, da den giver en målrettet og reproducerbar adskillelse og analyse af aminosyrer.
Prøveforberedelsesteknikker til analyse af cyanobakterielle og andre algeprøver involverer overvejende en ekstraktionsmetode for aminosyrer i deres frie og proteinbundne former. I årenes løb har ekstraktionsmetoderne været relativt i overensstemmelse med almindelige elementer, herunder opløsning af prøven for at adskille de frie aminosyrer fra deres bundne form efterfulgt af proteinudfældning og frigivelse af de bundne aminosyrer gennem hydrolyse med saltsyre (HCI) ved forhøjede temperaturer22 . Denne ekstraktionsform er blevet optimeret til proteinaminosyrer og anvendes til NPAA'er. Påvisning og kvantificering af BMAA og dets isomerer (figur 1), aminoethylglycin (AEG) og 2,4-diaminosmørsyre (2,4-DAB) i samme art af cyanobakterier har imidlertid vist inkonsekvente resultater i litteraturen, hvor en mulig forklaring ligger i forskelle i vækstbetingelserne og/eller algestammen, der producerer varierende eller ingen mængder BMAA23 . Det er blevet fremført, at en mere sandsynlig forklaring på uoverensstemmelserne i påvisning og kvantificering af BMAA og dets isomerer skyldes ikke-validerede forsøgsprotokoller, anvendelsen af en lang række analytiske teknikker og utilstrækkelige eksperimentelle detaljer i de rapporterede metoder16,24, der fører til irreproducerbare data mellem laboratorier. Glover et al.25 og Banack 26 har imidlertid for nylig udviklet og valideret en analytisk teknik til påvisning og kvantificering af BMAA og dets isomerer ved hjælp af ultra-performance væskekromatografi (UPLC)-MS/MS i overensstemmelse med International Society of Analytical Chemists (AOAC), US Pharmacopeia og FDA-retningslinjer, der er nødvendige for validering af enkeltlaboratorier.
Disse valideringseksperimenter fokuserede på adskillelse og påvisning af BMAA og dets isomerer og adresserede ikke uoverensstemmelserne i prøveforberedelsesprotokoller. Lage et al.27 sammenlignede udførelsen af tre almindelige ekstraktionsmetoder til kvantificering af BMAA og dets isomerer i cyanobakterielle prøver via LC-MS/MS: fastfaseekstraktion (SPE) af frie aminosyrer28,29; en proteinudfældningsmetode, der involverer en methanolekstraktion og acetoneudfældning30 og den mest almindeligt anvendte ekstraktionsmetode til BMAA, proteinudfældning med trichloreddikesyre (TCA)31. De konkluderede, at TCA-proteinudfældningen var den optimale protokol, hvilket gav højere BMAA-koncentrationer i testprøverne sammenlignet med de andre ekstraktionsmetoder. Deres undersøgelse validerede TCA-ekstraktion med derivatisering af BMAA ved anvendelse af 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat (AQC) i en cyanobakteriematrix, hvilket giver en etableret vejledning til opnåelse af pålidelige og reproducerbare BMAA-data. TCA aminosyreekstraktion er en accepteret og almindelig prøveforberedelsesteknik, der også kan anvendes på andre matricer. Imidlertid skal stabiliteten af aminosyren under hydrolyse overvejes for at forhindre nedbrydning eller oxidation, som kan overvindes ved anvendelse af kemiske modifikatorer og reduktionsmidler32. TCA-ekstraktion bruges rutinemæssigt og undervises til nye forskerstuderende, og selvom protokollen er bredt rapporteret, er et visuelt hjælpemiddel i anvendelsen af denne metode en værdifuld ressource, der sikrer korrekt og konsekvent udførelse.
Omvendt fasekromatografi bruges almindeligvis til at adskille aminosyrer, hvilket kræver et derivatiseringstrin før analyser. Afledningen af aminosyrer såsom BMAA giver mulighed for kromatografisk retention og kan øge opløsningen mellem isomerer. Det øger også molekylmassen og forbedrer ioniseringen i massespektrometeret. Flere derivatiseringsreagenser er blevet anvendt til analyse af aminosyrer via LC-MS/MS, herunder propylchloroformat (PCF)33, 6-aminoquinolyl-N-hydrosysuccinimidylcarbamat (AQC)27, 9-fluorenylmethylchloroformat (FMOC)34 og dansylchlorid (DC)35. De eneste validerede teknikker til analyse af BMAA brugte imidlertid enten PCF 36 eller AQC24,26,37 som deres derivatiseringsreagens.
Omfanget af denne protokol er fokuseret på TCA-ekstraktion af NPAA'er fra cyanobakterielle matricer. Det er en arbejdskrævende metode, der rutinemæssigt bruges og undervises i akademiske og industrielle forskningslaboratorier baseret på manuskripter, der kan være korte på detaljer; derfor giver denne protokol detaljer om proceduren og teknikkerne, der er involveret i fremstilling af prøver til analyse af fri og bundet BMAA som modelaminosyre.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL glass shell vials</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>REST-24663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.3% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>BR780546-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mM HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z740441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 M HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.11727</td>
			<td>Dilute 70:1 Ethanol:water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C Freezer</td>
			<td>Martin CHRIST</td>
			<td>102142</td>
			<td>Alpha 2-4 Ldplus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>34967-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale Balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal evaporator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13442549</td>
			<td>DNA120-115 SpeedVac Concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP022620100-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D5-2,4-DAB standard</td>
			<td>CDN Isotopes</td>
			<td>D-7568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>CEO-8492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T2318-500EA</td>
			<td>Greiner centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS8161-100EA</td>
			<td>Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass engraver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrolysis vial &#38; Lid</td>
			<td>Eldex Laboratories/Waters</td>
			<td>WAT007568 &#38; WAT007569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice and container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper wipe</td>
			<td>Kimwipes/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.2 M&#937;.cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen tap with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000055-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - noise cancelling headphones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - oven gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td>QSONICA Sonicators</td>
			<td>Q125 Sonicator</td>
			<td>Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample transfer spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis

Ikke-proteinaminosyrer (NPAA'er) er en stor klasse af aminosyrer (AA'er), der ikke er genetisk kodet til oversættelse til proteiner. Analysen af NPAA'er kan give afgørende information om cellulær optagelse og / eller funktion, metaboliske veje og potentiel toksicitet. β-methylamino-L-alanin (BMAA) er en neurotoksisk NPAA produceret af forskellige algearter og er forbundet med en øget risiko for neurodegenerative sygdomme, hvilket har ført til betydelig forskningsinteresse. Der er mange måder at ekstrahere AA'er til analyse, hvor væskekromatografi-tandem massespektrometri er den mest almindelige, hvilket kræver proteinudfældning efterfulgt af syrehydrolyse af proteinpellet. Undersøgelser af tilstedeværelsen af BMAA hos algearter giver modstridende resultater, hvor anvendelse af ikke-valideret prøveforberedelse/ekstraktion og analyse er en primær årsag. Som de fleste NPAA'er er proteinudfældning i 10% vandig TCA og hydrolyse med rygende HCI den mest passende form for ekstraktion til BMAA og dets isomerer aminoethylglycin (AEG) og 2,4-diaminosmørsyre (2,4-DAB). Den nuværende protokol beskriver trinene i en valideret NPAA-ekstraktionsmetode, der almindeligvis anvendes i forsknings- og undervisningslaboratorier.

En illustration af ekstraktionsprotokollen findes i figur 2 som en opsummeret referencevejledning. Resultaterne opnået af Violi et al.38 blev valgt til at repræsentere et positivt resultat fra denne ekstraktionsprotokol til analyse af BMAA-isomerer fra cyanobakterier. Nitten enkeltarter af cyanobakterier blev dyrket fra 11 østlige australske ferskvandssteder. Ved hjælp af den samme protokol blev BMAA-isomererne ekstraheret til frie og proteinfraktioner, afledt med PCF og analyseret ved hjælp af LC-MS / MS. Sytten af de cyanobakterielle isolater var positive for BMAA, og alle 19 indeholdt 2,4-DAB-isomeren. Et positivt resultat bekræftes ved at anvende en valideret LC-MS/MS-metode og observere mindst tre multipel reaktionsovervågningsovergange (MRM), en som kvantifikatorion og to som kvalifikatorioner på det forventede retentionstidspunkt. Figur 3 viser et repræsentativt MRM-kromatogram for en standard indeholdende BMAA og dets isomerer, angivet med de farvekodede linjer. Tilstedeværelsen og koncentrationen af BMAA og isomerer i alle 19 prøver, opdelt for at vise BMAA- og isomerkoncentrationen i de frie og bundne fraktioner, er opsummeret i tabel 1. En positiv påvisning for alle tre isomerer blev observeret i den frie fraktion af Merismopedia-arterne indsamlet fra Liddell-søen (NSW, Australien), hvor den frie fraktion indeholdt en BMAA-koncentration på 68,38 μg/g tørvægt (DW) ± 2,25 μg/g DW, 2,4-DAB med en koncentration på 1.223,98 μg/g DW ± 20,7 μg/g DW og AEG med en koncentration på 125,27 μg/g DW ± 4,19 μg/g DW. De kromatografiske MRM'er er vist i figur 4. For at illustrere et negativt resultat for BMAA og dets isomerer i en prøve er den bundne fraktion af Microcystis flos-aquae-arten indsamlet fra Walka Water Works (NSW, Australien) kromatografisk vist i figur 5. Mens den bundne fraktion ikke indeholdt BMAA, 2,4-DAB og/eller AEG, indeholdt dens frie fraktion alle tre isomerer med koncentrationer på henholdsvis 79,86 μg/g DW ± 1,59 μg/g DW, 1.156,15 μg/g DW ± 8,46 μg/g DW og 433,83 μg/g DW ± 8,92 μg/g DW.
Ved hjælp af denne protokol bekræftede Violi et al.38 således tilstedeværelsen af BMAA-isomerer i østlige australske ferskvandscyanobakterier og bestemte, hvilke cyanobakterier der havde toksinproducerende egenskaber.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig01.jpg"> Figur 1: Den kemiske struktur af BMAA og dets isomerer 2,4-DAB og AEG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig02.jpg"> Figur 2: Opsummeret referencediagram over ekstraktionsprotokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig03.jpg"> Figur 3: LC-MS/MS-kromatogram af en kalibreringsstandard indeholdende D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA og AEG til isomeridentifikation baseret på retention, angivet ved de fremhævede toppe. Nøgle: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z ved 6,4 min (rød), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z ved 6,4 min (grøn), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z ved 7,4 min (orange) og BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z ved 7,8 min (blå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig04.jpg"> Figur 4: LC-MS/MS-kromatogram til påvisning af D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA og AEG i Merismopedia-arter indsamlet fra Liddell-søen (NSW, Australien), angivet med de fremhævede toppe. Nøgle: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z ved 6,4 min (rød), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z ved 6,4 min (grøn), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z ved 7,4 min (orange) og BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z ved 7,8 min (blå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig05.jpg"> Figur 5: LC-MS/MS-kromatogram med negativ kontrol for 2,4-DAB, BMAA og AEG i en bundet fraktion af Microcystis flos-aquae-arter indsamlet fra Walka Water Works (NSW, Australien). Nøgle: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z ved 6,4 min (rød - top fremhævet), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z ved 6,4 min (grøn), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z ved 7,4 min (orange) og BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z ved 7,8 min (blå). De stiplede linjer repræsenterer opbevaringstiderne for manglende 2,4-DAB, AEG og BMAA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Tabel 1: BMAA-, AEG- og 2,4-DAB-koncentrationer i cyanobakterielle isolater. Koncentrationer ± standardfejl i middelværdien (n = 3). ND betegner ikke opdaget. Den højeste koncentration af hver detekteret isomer er fremhævet med grønt. Tabellen er en modificeret version fra Violi et al.38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779_Table%201.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Denne protokol beskriver ekstraktionen af ikke-proteinaminosyrer fra biologiske matricer via trichloreddikesyre (TCA) proteinudfældning og syrehydrolyse før analyse ved anvendelse af væskekromatografi-tandem massespektrometri.

Ekstraktion af ikke-proteinaminosyrer fra cyanobakterier til væskekromatografi-tandem massespektrometrianalyse

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

Denne protokol hjælper brugerne og lærer eleverne de korrekte trin i udvindingen af BMA, AEG og 2, 4-DAB. Derved minimeres chancerne for fejl og producerer ensartede resultater. Denne metode er en almindeligt anvendt og valideret metode til udvinding af BMA og dets isomerer, AEG og 2, 4-DAB i en sauna bakteriel matrix.Denne metode kan bruges til yderligere forskning vedrørende BMAs toksicitet og give en større forståelse af BMA og dens tilknyttede sundhedseffekter. Begynd med centrifusion cyanobakterieprøven ved 3.500 G i 10 minutter ved 25 grader Celsius. Og kassere supernatanten i biologisk affald.Dæk centrifugerøret, der indeholder pellet, med en tætningsfilm, og gennembor et par huller i filmen ved hjælp af en skarp lang næsepincet. Opbevar derefter røret lodret ved minus 80 grader Celsius. Efter 30 minutter placeres røret lodret i en frysetørretumblerglasbeholder og placeres beholderen inde i fryseren minus 80 grader Celsius fryseren i fem minutter til afkøling.Fjern glasbeholderen fra fryseren, og fastgør gummilåget. Sørg for, at håndtaget på frysetørrerens gummiventiludløb peger opad og udluftes til atmosfæren. Fastgør glasbeholderen fast.Drej langsomt håndtaget på gummiventiludløbet for at pege det i en nedadgående position for at udsætte krukken for vakuumet. Og lad op til 24 timers frysetørring sublimere al væsken. Når du er færdig, vejer 15 til 50 milligram frosne prøvepiller i et 15 milliliter centrifugerør.Ved hjælp af en analytisk balance. Til prøven tilsættes 300 til 600 mikroliter 10% vandig trichloreddikesyre eller TCA. Anbring prøverørene i en beholder fyldt med knust is.Tør sonikatorsonden af med en fnugfri papirserviet sprøjtet med 70% ethanol, inden sondens ende nedsænkes helt i prøven og trykkes på start. Når det er gjort, anbringes prøven indeholdende centrifugerøret på is i et minut. Og gentag sonikeringsprocessen for at sikre cellelysis.Efter afkøling af prøven ved fire grader Celsius i 24 timer. Centrifuge ved 3.500 G i 15 minutter ved otte grader Celsius. Brug derefter en mikropipette til at overføre supernatanten til et to milliliter rør mærket fri fraktion.Tilsæt 400 mikroliter 10% vandig TCA i prøvepelleten, og bryd pelleten op enten ved hvirvelomrøring eller med mikropipettespidsen. Centrifuge og overfør supernatanten til det samme to milliliter frie fraktionsrør. Gentag dette trin en tredje gang ved hjælp af 10% TCA acetone.Anbring det frie fraktionsrør med låget åbent i en centrifugalfordamper, indtil al den flygtige væske er fjernet. Når prøven er fri for flygtige væsker, skal du dække røret sikkert med loftfilmen og gennembore filmen med et par huller ved hjælp af en skarp lang næsepincet. Efter tidligere påvist frysetørring rekonstitueres prøven med 200 mikroliter 20 millimolar saltsyre og anbringes i en fryser på minus 80 grader Celsius.Tilsæt 400 mikroliter 100% acetone på prøvepellet ved hjælp af en mikropipette og bryd pelleten op ved hjælp af enten hvirvelomrøring eller mikropipettespidsen. Overfør den vaskede og resuspenderede pellet kvantitativt til det tilsvarende hætteglas med glasskal. Brug af en en milliliter mikropipette.Tilsæt yderligere 400 mikroliter acetone til prøverøret for at hjælpe med at overføre den resterende pellet. Centrifuge og dekantere supernatantvæsken til biologisk affald, inden pelleten tørres i en centrifugalfordamper, indtil væsken fjernes, og pelleten er tør. For at forberede vakuumhydrolysefilen tilsættes en milliliter seks molær saltsyre til bunden af hydrolysefilen.Indsæt forsigtigt de mærkede hætteglas med tørrede prøver i hydrolysefilen ved hjælp af pincet, der sikrer en opretstående stabil position. Fastgør låget til hydrolysefilen, og tryk på den røde knap på låget for at lukke ventilen. Når vakuumpumpen er tændt, skal du fastgøre vakuumrøret til hovedet på hydrolysefillåget og trykke på den grønne knap på låget for at åbne ventilen.Lad derefter vakuumpumpen fjerne luften fra hætteglasset i et minut. Luk derefter hætteglasset ved at trykke den røde knap på hydrolyseflaskens låg. Sluk for vakuumpumpen, og fjern vakuumrøret.Fastgør et gummirør til nitrogengashanen på laboratoriebænken. Og åbn hanen lidt. Placer tommelfingeren i enden af røret, forsegl den og tæl, indtil gassen begynder at slippe ud, når trykket opbygges.Fastgør derefter den anden ende af gummirøret til hovedet på hydrolysehætteglassets låg. Og tryk straks på lågets grønne knap. Tæl den tid, det tager for gassen at slippe ud.Tryk hurtigt på den røde knap på låget, og fjern gummirøret. Gentag hele vakuumbehandlingsprocessen to gange. Sørg for, at hætteglasset med hydrolyse er fri for luft og fyldt med nitrogengas.Hætteglasset med hydrolyse anbringes i en forvarmet ovn, der er indstillet til 110 grader Celsius i 16 til 18 timer. Brug ovnhandsker til at fjerne hætteglasset med hydrolyse fra ovnen. Lad hætteglasset køle af inde i røghætten i 10 minutter, før du skubber den grønne knap, mens du vender den væk for at frigive tryk og gas.De hydrolyserede prøvepiller rekonstitueres med 200 mikroliter 20 molær saltsyre i hætteglasset med skallen, og pelleten suspenderes. Hætteglassene med skallen med de rekonstituerede prøvepiller centrifugeres i to minutter ved 5, 300 g og 25 grader Celsius. Overfør de rekonstituerede frie fraktionsprøver og proteinfraktion til de to milliliter filterrør, der indeholder 0,2 mikron poremembranfiltre og mærket som fri fraktion og proteinfraktion.Rør anbringes til centrifugering i 30 minutter ved 5.000 G og 25 grader Celsius. Multireaktionsovervågningskromatogrammet for en standard indeholdende beta-methylamino-L-alanin eller BMAA og dets isomerer angivet med de farvekodede linjer er vist her. En positiv påvisning for alle tre isomerer, BMAA, DAB og AEG blev observeret i den frie fraktion af Merismopedia-arterne indsamlet fra Liddel-søen.Mens den bundne fraktion af Microcystis flos-aquae-arterne indsamlet fra Waka Waterworks illustrerede et negativt resultat for BMAA og dets isomerer. Den resuspenderede pellet skal overføres kvantitativt til det tilsvarende hætteglas for at muliggøre et nøjagtigt normaliseringspunkt baseret på cyanobakteriemasse. Patienter og due diligence rådgives, mens de udfører dette trin.Efter denne procedure. De ekstraherede fraktioner skal gennemgå et devitaliseringstrin for at muliggøre omvendt fase. Væskekromatografi, tandemmassespektrometrianalyse.Anvendelsen af denne teknik udvider forskellige videnskabelige områder. Herunder miljøvidenskab gennem analyse af cynotoxiner i miljøprøver. Og områder som toksikologi og biokemi gennem undersøgelsen af Misincorporation-teorien om BMA.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Large Scale Ikke-målrettet metabolomisk profilering af Serum fra Ultra Performance Liquid Chromatography-massespektrometri (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Målrettede Metabolomics fra biologiske kilder Brug Ultraperformance væskekromatografi-højopløsningsmassespektrometri (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Brug kapillarelektroforese at kvantificere organiske syrer fra Plant Tissue: En Test Case Undersøgelse<em&gt; Ægte kaffe</em&gt; Frø

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

En HS-MRM analyse til kvantificering af værts-celle proteiner i Protein Biopharmaceuticals af væskekromatografi Ion mobilitet QTOF massespektrometri

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

En enkel metode til glucosinolater Ekstraktion og analyse med Højtryks-væskekromatografi (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

Fizzy Extraction of Volatile Organic Compounds Combined with Atmospheric Pressure Chemical Ionization Quadrupole Mass Spectrometry

Fizzy Ekstraktion af flygtige organiske forbindelser kombineret med atmosfærisk tryk kemisk ionisering Quadrupole massespektrometri

Chemical analysis of volatile and semivolatile compounds dissolved in liquid samples can be challenging. The dissolved components need to be brought to ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Real-time ånde analyse ved hjælp af sekundære Nanoelectrospray ionisering koblet til høj opløsning massespektrometri

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntese og massespektrometri analyse af Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Kapillær elektroforesebaseret hydrogen/deuteriumudveksling til konformationskarakterisering af proteiner med top-down massespektrometri

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Curation of Computational Chemical Libraries Demonstrated with Alpha-Amino Acids

Kuratering af Computational Chemical Libraries Demonstreret med alfa-aminosyrer

Exhaustive generation of molecular structures has numerous chemical and biochemical applications such as drug design, molecular database construction, ...