Name: extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-12-09T12:40:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

D.P.B., K.J.R. en S.M.M. worden ondersteund door The Ian Potter Foundation en J.P.V. is de ontvanger van een Australian Government Research Training Program, Stipend.

De cyanobacteriënsoort Merismopedia werd gebruikt voor de huidige studie38.
1. Voorbereiding van het ruwe monster
<ol><li>Verzamel het algenschuim uit de aquatische bron van belang of uit een cyanobacteriële gekweekte kolf en plaats het in centrifugebuis38 van 50 ml. OPMERKING: Het monster moet worden ingevroren bij −20 °C voor latere extracties en worden ontdooid vóór de volgende stap.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen met het monster bij 3.500 x g gedurende 10 minuten bij 25 °C. Decanteer het supernatant in een afvalcontainer en gooi het weg in biologisch afval. OPMERKING: Het supernatant kan worden gereserveerd voor toekomstige analyse van het exosoom.</li>
	<li>Bedek de buis met de monsterkorrel stevig met een afdichtingsfilm (zie Materiaaltabel) en prik een paar gaten in de film met een scherp, lang neuspincet. Bewaar de buis rechtop bij −80 °C gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Zet de vriesdroger aan en balanceer op 0,1 mbar en −80 °C (~30 min). OPMERKING: De parameters (stap 1.4) zijn geoptimaliseerd voor de vriesdroger die voor dit onderzoek wordt gebruikt (zie materiaaltabel). Volg de standaard bedrijfsprocedures volgens het vriesdrogermodel dat beschikbaar is in het laboratorium of stel de laagst mogelijke temperatuur in als het vriesdrogermodel niet zo laag gaat als −80 °C.<ol><li>Plaats de centrifugebuis(en) rechtop in een glazen container met vriesdroger en plaats deze gedurende 5 minuten in de vriezer van −80 °C om de pot af te koelen.</li>
		<li>Haal de glazen container uit de vriezer en bevestig het rubberen deksel.</li>
		<li>Zorg ervoor dat het handvat op de rubberen klepuitlaat van de vriesdroger naar de atmosfeer wordt geventileerd (naar boven gericht) en bevestig de glazen container stevig.</li>
		<li>Draai het handvat van de rubberen klepuitlaat heel langzaam naar de naar beneden wijzende positie om de pot bloot te stellen aan het vacuüm en laat tot 24 uur vriesdrogen toe om de sublimatie van alle vloeistof te garanderen.</li>
		<li>Om het vacuüm in de pot vrij te maken, draait u het handvat naar boven, maakt u de glazen container los en verwijdert u de gevriesdroogde monsters.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik een analytische balans om 15-50 mg gedroogde monsterpellets in een centrifugebuis van 15 ml te wegen. OPMERKING: De monsters kunnen in −80 °C-opslag worden geplaatst als ze in dit stadium niet verder worden verwerkt.</li>
</ol>2. Celllysing en fractionering van vrije NPAAs
<ol><li>Voeg 100 μL van 100 ng/ml D5-2,4-DAB (zie materiaaltabel) standaard met behulp van een micropipette toe aan de monsterbuis (optioneel).</li>
	<li>Voeg 300-600 μL van respectievelijk 10% m/v waterig trichloorazijnzuur (TCA, zie Materiaaltabel) of 300-600 μL van 11,7%-13,3% TCA toe als u de D5-2,4-DAB-standaard toevoegt. OPMERKING: Kies een volume waterige TCA dat de pellet volledig bedekt.</li>
	<li>Plaats de monsterbuizen in een container gevuld met gemalen ijs.</li>
	<li>Gebruik een sonde sonicator (zie Materiaaltabel) met een middelhoog vermogen (70%) en laat het monster gedurende 1 minuut lyseren volgens de onderstaande stappen. LET OP: Zorg voor de juiste PBM's met het gebruik van ruisonderdrukkende oorkappen.<ol><li>Volg de juiste veiligheidsprotocollen ter voorbereiding op het gebruik van de sonde sonicator door in gebruik zijnde bewegwijzering op de deur te plaatsen, ultrasoonapparaat in de zuurkast uit te voeren en ruisonderdrukkende oorkappen te gebruiken.</li>
		<li>Schakel de sonicator in en voer de volgende parameters in: amplitude, 70%; tijd, 1 min.</li>
		<li>Spuit 70% ethanol op een pluisvrij papierdoekje (zie Materiaaltabel) en veeg de sonde schoon.</li>
		<li>Dompel het uiteinde van de sonde volledig onder in het monster en druk op start.</li>
		<li>Wanneer de sonde sonicator stopt, plaatst u de centrifugebuis met het monster gedurende 1 minuut op ijs.</li>
		<li>Om ervoor te zorgen dat de cellen worden gelyseerd, herhaalt u stap 2.4.3-2.4.5 nogmaals.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats het monster in een koelkast bij 4 °C gedurende 12-24 uur om eiwitprecipitatie mogelijk te maken.</li>
	<li>Centrifugeer het 10% waterige TCA-monster bij 3.500 x g gedurende 15 minuten bij 8 °C.</li>
	<li>Gebruik een micropipette om het supernatant over te brengen naar een buis van 2 ml met het label "Vrije fractie".</li>
	<li>Micropipette 400 μL van 10% waterige TCA in de centrifugebuis met de resterende monsterpellet en breek de pellet op door vortexbeweging of met de micropipettepunt.</li>
	<li>Herhaal stap 2.6-2.7 en breng het supernatant over naar dezelfde 2 ml "Vrije Fractie" -buis.</li>
	<li>Micropipette 400 μL van 10% TCA/aceton in de centrifugebuis met de resterende pellet en breek de pellet op met vortexing of de micropipettepunt.</li>
	<li>Centrifugeer het 10% TCA/acetonmonster bij 3.500 x g gedurende 15 minuten bij 8 °C. Gebruik een micropipette om het supernatant over te brengen naar de buis van 2 ml met het label "Vrije fractie".</li>
	<li>Plaats de buis "Vrije Fractie" met het deksel open in een centrifugale verdamper (zie Materiaaltabel) totdat alle vluchtige vloeistoffen zijn verwijderd (ten minste 1 uur).</li>
	<li>Zodra het monster vrij is van vluchtige vloeistoffen, bedekt u de buis stevig met afdichtingsfilm en doorboort u de film met een paar gaten met een scherp, lang neuspincet. Plaats het monster in een -80 °C vriezer.</li>
	<li>Vriesdroog het monster "Vrije fractie" door alle stappen in stap 1.4 te herhalen.</li>
	<li>Micropipette 200 μL van 20 mM zoutzuur (HCl) in de buis "Vrije Fractie" om het gevriesdroogde monster te reconstitueren en in de vriescel van −80 °C te plaatsen. OPMERKING: De "Vrije Fractie" van het monster is klaar voor filtratie in stap 4. De resterende pellet zal verder worden verwerkt in de volgende stappen voor eiwitfractionering.</li>
</ol>3. Fractionering van de eiwitgebonden NPAAs
<ol><li>Gebruik een glasgraveerder om glazen flacons te labelen met de monsterdetails voor identificatie. OPMERKING: Sterk zuur kan de etikettering van inkt dissiperen; daarom wordt het graveren van de etiketten op glas aanbevolen.</li>
	<li>Micropipette 100 μL van 100 ng/ml D5-2,4-DAB standaard op de monsterpellet (optioneel).</li>
	<li>Micropipette 400 μL van 100% aceton op de monsterpellet en breek de pellet af met behulp van vortexbeweging of de micropipettepunt.</li>
	<li>Gebruik een micropipette van 1 ml op 1.000 μL om de gewassen en geresuspendeerde pellet over te brengen naar de overeenkomstige glazen injectieflacon. OPMERKING: Nog eens 400 μL van 100% aceton kan worden toegevoegd aan de geagiteerde pellet om te helpen bij de volledige overdracht van de pellet in de glazen injectieflacon. Dit kan indien nodig een derde keer worden herhaald.</li>
	<li>Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 5 minuten bij 25 °C en decanteer de vloeistof in biologisch afval.</li>
	<li>Plaats de resterende pellet in een centrifugale verdamper totdat alle vloeistof is verwijderd en de pellet droog is (~ 1 uur).</li>
	<li>Bereid de vacuümhydrolyseflacon voor door 1 ml 6 M HCl toe te voegen aan de bodem van de hydrolyseflacon.</li>
	<li>Gebruik een pincet om de gelabelde injectieflacons met de gedroogde monsters voorzichtig in de hydrolyseflacon te steken, zodat een rechtopstaande, stabiele positie wordt gegarandeerd. OPMERKING: Injectieflacons met lege omhulsels kunnen worden gebruikt om de injectieflacons met het monster rechtop te houden als het aantal monsters kleiner is dan de capaciteit van de hydrolyseflacon.</li>
	<li>Bevestig het deksel op de hydrolyseflacon en druk op de rode knop op het deksel om de klep te sluiten.</li>
	<li>Zet de vacuümpomp aan, bevestig de vacuümbuis aan de kop van het deksel van de hydrolyseflacon en druk op de groene knop op het deksel om de klep te openen.</li>
	<li>Laat de vacuümpomp (zie Materiaaltabel) de lucht gedurende 1 minuut uit de injectieflacon verwijderen.</li>
	<li>Sluit de injectieflacon door de rode knop op het deksel van de hydrolyseflacon in te drukken, zet de vacuümpomp uit en verwijder de vacuümbuis.</li>
	<li>Bevestig een rubberen buis aan de stikstofgaskraan op de laboratoriumbank en open de kraan iets. Plaats de duim aan het uiteinde van de buis, sluit deze af en tel totdat het gas begint te ontsnappen als de druk toeneemt. Dit zal het tijdsbestek zijn voor de volgende stap. Pas de gasstroom aan op een geschikt tijdsbestek.</li>
	<li>Bevestig het andere uiteinde van de rubberen buis aan de kop van het deksel van de hydrolyseflacon en druk onmiddellijk op de groene knop van het deksel. Tel tot de tijd bepaald in stap 3.13 en druk snel op de rode knop op het deksel en verwijder de rubberen buis.</li>
	<li>Herhaal stap 3.10-3.14 tweemaal om ervoor te zorgen dat de glazen hydrolyseflacon vrij is van lucht en gevuld is met stikstofgas.</li>
	<li>Plaats de injectieflacon met hydrolyse gedurende 16-18 uur in een voorverwarmde oven op 110 °C.</li>
	<li>Gebruik ovenhandschoenen om de glazen hydrolyseflacon uit de oven te halen en laat deze gedurende 10 minuten afkoelen in de zuurkast. In de zuurkast, terwijl je hem van je af kijkt, druk je op de groene knop om druk en gas los te laten.</li>
	<li>Gebruik een pincet om de injectieflacons van de hydrolyseflacon te verwijderen.</li>
	<li>Reconstitueer de gehydrolyseerde monsterpellets door 200 μL van 20 mM HCl in de injectieflacon in de schaal te pipetteren. Zorg ervoor dat de pellet wordt geresuspendeerd door vortexing of met behulp van een pipetpunt.</li>
	<li>Centrifugeer de injectieflacons in de schaal met de gereconstitueerde monsterpellets gedurende 2 minuten bij 5.300 x g en 25 °C.</li>
</ol>4. Voorbeeldfiltering
<ol><li>Label 2 ml filterbuizen (zie materiaaltabel) met 0,2 μm poriemembraanfilters als "Vrije fractie" en "Eiwitfractie".</li>
	<li>Breng de gereconstitueerde monsters uit stap 2.15 (vrije fractie) en stap 3.20 (eiwitfractie) over in de overeenkomstige filterbuizen.</li>
	<li>Plaats ze in de centrifuge gedurende 30 minuten bij 5.000 x g en 25 °C.</li>
	<li>Verwijder de filters uit de filterbuizen en sluit ze af. De monsters zijn nu klaar voor aminozuurontgivatisatie in stap 5. OPMERKING: De monsters kunnen in de -80 °C vriezer worden geplaatst voor opslag voor latere derivatisatie en analyse.</li>
</ol>5. Aminozuur derivatisatie
<ol><li>Derivatiseer de monsters met behulp van propylchloorhopaat (PCF)39 of 6-aminoquinolyl-N-hydrosysuccinimidylcarbamaat (AQC)40 volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het extractieprotocol dat hier wordt beschreven voor de analyse van NPAAs is van toepassing op het analyseren van aminozuren in biologische monsters. Voor gidsen over het isoleren en kweken van cyanobacteriële stammen kan men verwijzen naar de methoden die in de studie van Violi et al.38 worden gepresenteerd. De eerste stap in het protocol brengt het monster naar een punt waar normalisatie tussen monsters tegen het droge gewicht kan worden bereikt. De tweede stap is cellyse om de analyten vrij te geven en kan worden uitgevoerd met behulp van een reeks technieken, waaronder mechanische verstoringen / lyses zoals sonde-sonicatie zoals beschreven in dit protocol, vries- / dooicycli, malen en kraalfrezen, en niet-mechanische verstoringen zoals enzymatische, detergentische en / of chemische lysis. Het is bekend dat mechanische verstoring voordelig is ten opzichte van niet-mechanische, omdat het een grotere capaciteit van het monster mogelijk maakt om te lyseren, terwijl de intracellulaire bindingen en eiwitten intact blijven41, hoewel de monstermatrix de optimale methode voor cellyseren kan dicteren.
Eiwitprecipitatie is de kritieke derde stap van dit protocol bij het extraheren van aminozuren voor analyse. TCA is het meest gebruikte oplosmiddel; perchloorzuur, aceton, methyltert-butylether (MTBE), methanol en/of acetonitril 8,42 zijn echter ook gebruikt, waarbij elk extractieoplosmiddel bedoeld is om verschillende substraten te extraheren en neer te slaan. Het hier beschreven model haalt de NPAA BMAA en zijn isomeren uit een cyanobacteriële matrix, en hoewel een reeks verschillende oplosmiddelen zijn gebruikt, zijn de twee meest voorkomende 10% TCA in water (waterig) en 10% TCA in aceton. Over het algemeen wordt eiwitprecipitatie met TCA vaak gebruikt om aminozuren te extraheren om vrije aminozuren uit de eiwitgebonden aminozuren te fractioneren. Bovendien maakt TCA-extractie het mogelijk om het totale eiwitgehalte te bepalen, verontreinigingen voor de vrije fractie te verminderen en de activiteit van proteasen te verminderen met minimale eiwitafbraak43. De TCA-extractie van de vrije fractie werkt door in eerste instantie organisch oplosbare stoffen uit te spoelen, waarbij eiwitten en onoplosbare verbindingen zoals celwandresten in het neerslag achterblijven, wat vervolgens wordt gevolgd door thermische hydrolyse-extractie van de eiwitgebonden aminozuren (gebonden fractie) met behulp van een sterk zuur.
De fractionering van de vrije fractie met 10% waterige TCA plus ultrasoonapparaat produceert de meest uitgebreide eiwitprecipitatie in vergelijking met andere organische oplosmiddelen44 en de beste aminozuurterugwinningen42. Sommige studies kiezen ervoor om een zuur te gebruiken in combinatie met een organisch oplosmiddel (d.w.z. 10% -20% TCA in aceton43) om meer moleculen neer te slaan, waaronder kleinere peptiden / biomoleculen, eiwitafbraak te minimaliseren en verontreinigingen zoals zoutente verminderen 43. Een ander voordeel van 10% TCA in aceton is de snellere droogsnelheid bij de bereiding van de pellet voor hydrolyse, waardoor vochtresten worden geminimaliseerd om aminozuurmodificatie te voorkomen. 10% waterige TCA plus ultrasoonapparaat heeft echter een betere extractie-efficiëntie van vrije aminozuren in vergelijking met 10% TCA in aceton44 alleen. Bovendien heeft 10% waterige TCA-precipitatie beperkingen zoals een lange droogtijd, niet in staat zijn om alle eiwitten of kleine peptiden / biomoleculen neer te slaan, en afhankelijk van de analyt van belang (d.w.z. eiwitten of aminozuren), waarvoor additieven en reductiemiddelen nodig zijn om oxidatie en afbraak te voorkomen45,46.
Dit protocol maakt gebruik van een combinatie van 10% waterige TCA en 10% TCA in aceton om eiwitprecipitatie te verhogen, ervoor te zorgen dat kleinere peptiden / biomoleculen worden neergeslagen, snellere pelletdroogtijden mogelijk te maken en de extractie-efficiëntie te verhogen, gebruikmakend van beide oplosmiddelextractie-eigenschappen. De combinatie van 10% waterige TCA en 10% TCA in aceton kan echter kleine peptiden/biomoleculen in de vrije fractie neerslaan nadat de 10% TCA in aceton supernatant is gecombineerd met de waterige vrije fractie. In dit geval moeten de neerslagen worden overgebracht naar de gebonden fractie voor hydrolyse.
De tweede helft van dit protocol omvat het vrijkomen van aminozuren (d.w.z. BMAA) uit de eiwitpellet via zuurdamphydrolyse bij verhoogde temperaturen in een zuurstofvrije omgeving. De overwegend beperkende factor voor de hydrolysestap is dat het tijdrovend en arbeidsintensief is om te bereiden. De nachtelijke incubatie voorkomt een snelle en tijdefficiënte monstervoorbereiding en -analyse. Bovendien is de kwantitatieve overdracht van de pellet van een centrifugebuis naar een injectieflacon (stap 3.4) een moeizaam proces dat toewijding en geduld vereist om een nauwkeurig normalisatiepunt voor het droge gewicht te garanderen. Mogelijke problemen waarmee de gebruiker te maken kan krijgen, zijn de onvolledige overdracht van de pellet, natte neergeslagen eiwitten die aan pipetpunten en de originele buis kleven, en vaste deeltjes van de pellet die de pipetpunt blokkeren. Een praktische suggestie om een gemakkelijkere overdracht van de pellet te vergemakkelijken, is om ongeveer 0,3-0,5 mm van het uiteinde van de pipetpunt te verwijderen met een schaar, waardoor grotere pelletdeeltjes kunnen worden getrokken en in de injectieflacon van de schaal kunnen worden vrijgegeven. Deze overdrachtsmethode is gebruikelijk voor eiwitextractie voor alle aminozuuranalyses. Er moeten echter wijzigingen worden onderzocht om de efficiëntie en nauwkeurigheid van het kwantitatief overbrengen van de pellet in de injectieflacon in de schaal te verbeteren.
Twee vormen van hydrolysetechnieken kunnen worden gebruikt om aminozuren vrij te maken uit hun eiwitgebonden toestand: vloeibare fasehydrolyse en zuurdamphydrolyse. Vloeistoffasehydrolyse, waarbij 6 M HCl aan het monster wordt toegevoegd, dat vervolgens 's nachts in een oven van 110 °C wordt geplaatst, is een alternatief voor de zuurdamphydrolyse die in dit protocol wordt beschreven. Extractietechnieken die hydrolyse in vloeibare fase gebruiken, kunnen verdere verwerking vereisen, zoals ontzilting, vooral als AQC-derivatisatie wordt gekozen, omdat het basisvoorwaarden vereist voor het labelenvan 40. Zuurdamphydrolyse vermijdt ontzilting en geeft de gebruiker de vrijheid om de derivatisatietechniek te kiezen bij reconstitutie van de uiteindelijke pellet vóór filtratie. Bovendien kunnen de monsters, onafhankelijk van de gekozen hydrolysemethode, verdere verwerking vereisen, zoals SPE voor matrixzuivering en concentratie 29,47,48, afhankelijk van de keuze van de derivatisatietechniek en/of analytische analyse (bijv. omgekeerde fase LC-MS/MS versus hydrofiele interactievloeistofchromatografie [HILIC] LC-MS/MS 37 ). De reconstitutie van de uiteindelijke pellet in 20 mM HCl in dit protocol is geschikt voor derivatisatie met behulp van PCF-reagentia48via een in de handel verkrijgbare aminozuurhydrolysekit39 (zie Materiaaltabel). Zowel AQC als PCF zullen alle aminozuren, eiwitten en niet-eiwitten in oorsprong in het monster derivatiseren, en de selectiviteit van de analyten wordt verkregen door het gebruik van LC-MS / MS en de combinatie van retentietijdmatching en zorgvuldige selectie van de kwantor en kwalificatie-MRM's38. 
De huidige hydrolyseprotocollen zijn niet geoptimaliseerd voor de afgifte van BMAA, 2,4-DAB en AEG, maar voor de 22 eiwitaminozuren op basis van bestaande methoden voor eiwithydrolyse32, waarbij incubatie gedurende langer dan 18 uur resulteert in de afbraak en wijziging van bepaalde aminozuren, wat van invloed is op de LC-MS / MS-analyse en dus de verkregen concentraties32. Beach et al.49 onderzochten hydrolyse in de loop van de tijd (0,5-120 uur) om de hydrolyse te optimaliseren voor het analyseren van BMAA en de proteïnogene aminozuren. Ze ontdekten dat hoewel er een vroege snelle afgifte van BMAA was tijdens de eerste 0,5 uur van de hydrolyse, de BMAA-niveaus bleven toenemen naarmate de hydrolysetijd toenam, zonder degradatie, zelfs na 5 dagen49. Er zijn ook nog steeds verschillende opvattingen en vragen over de ware aard van gebonden BMAA en zijn isomeren, waarbij sommige studies suggereren dat in plaats van BMAA-binding50,51 of misincorporatie in eiwitten14, BMAA-eiwitassociatie oppervlakkig is52. De huidige consensus in de analyse van "gebonden" BMAA vereist echter de gevalideerde en algemeen aanvaarde hydrolysestap die peptiden / eiwitten uit elkaar haalt om aminozuren en dus BMAA en zijn isomeren vrij te maken.
De herstelpercentages van 20 eiwitaminozuren werden bepaald in een studie door Sedgwick et al.42 met behulp van TCA-extractie, wat resulteerde in ongeveer 100% herstel. In het geval van BMAA en zijn isomeren uit algenmatrices, hebben studies die de efficiëntie van BMAA-extractie met behulp van verschillende extractiemiddelen vergelijken, aangetoond dat 10% TCA het meest efficiënt is voor gratis BMAA27. De herstelpercentages voor eiwitgebonden BMAA geëxtraheerd met behulp van vloeibare fasehydrolyse werden vastgesteld in studies door Glover et al.25 en door Faassen et al.53, waarbij de nauwkeurigheid werd bepaald door spiked recovery-methoden, met een gemiddeld BMAA-herstelpercentage van respectievelijk 108,6% en 70%. Faassen et al. beschreven procedures voor spike-recovery experimenten en illustreerden hoe het herstel verschilt afhankelijk van het stadium van het extractieproces waarin de spike werd gemaakt53. Faassen et al. bepaalden bovendien de efficiëntie van het hier gepresenteerde zuur-dampprotocol, met herstelpercentages van 83,6% voor de BMAA-isomeren die piekten voorafgaand aan extractie en 68,6% voor degenen die piekten vóór hydrolyse24. Deze herstelbewerkingen, extractiemethoden en analyses werden verder gevalideerd door Banack26, met herstelpercentages van 94% -106% voor BMAA in een cyanobacteriële matrix en een %relatieve standaarddeviatie (% RSD) tussen 5,6% en 20%, die voldoen aan de FDA-criteria voor nauwkeurigheid54. Het wordt aanbevolen dat elk laboratorium in eerste instantie zijn herstelpercentages en nauwkeurigheid vaststelt voordat dit protocol wordt gebruikt via spike-herstelexperimenten. De herstelmethoden in Faassen et al.53 en Glover et al.25 kunnen als leidraad worden gevolgd.
Alternatieve vormen van hydrolysetechnieken kunnen worden gebruikt in plaats van nachtelijke ovenhydrolyse voor snellere eiwitgebonden extractie van de analyt. Een magnetronafzuiging kan bijvoorbeeld de hydrolysetijd aanzienlijk verkorten van 24 uur tot slechts 10 minuten55. Microgolfhydrolyse voor aminozuren gebruikt dezelfde principes als de conventionele thermische methode, waarbij een handschoenenkastje wordt gebruikt om het microgolfvat in een zuurstofvrije omgeving te bereiden en te assembleren en 6 M HCl wordt toegevoegd. Eenmaal luchtdicht, ondergaat het vat dat het monster bevat microgolfstraling. Microgolfhydrolyse is gebruikt om aminozuren te extraheren uit verschillende monstermatrices 56,57,58; microgolfhydrolyse moet echter nog worden ontwikkeld en gevalideerd voor de analyse van BMAA.
Kortom, 10% waterige TCA-eiwitprecipitatie is de optimale methode om vrije niet-eiwitaminozuren uit cyanobacteriële matrices27 te extraheren, en thermische hydrolyse zorgt voor een betrouwbare en reproduceerbare extractie van de eiwitgebonden fractie. Dit protocol om de NPAA BMAA en zijn isomeren uit cyanobacteriën te extraheren, is gevalideerd en algemeen aanvaard. Toekomstige aanwijzingen om de extractie van BMAA verder te optimaliseren, zullen zich richten op de hydrolysestap, die wordt uitgevoerd volgens de specificaties van de 22 eiwitaminozuren. Het hier gepresenteerde extractieprotocol moet echter nog steeds als efficiënt en effectief worden beschouwd voor het analyseren van BMAA en zijn isomeren via LC-MS / MS.

Aminozuren zijn chemische verbindingen die ten minste één amine- en carbonfunctiegroep bevatten. Sommige aminozuren bevatten ook een iminogroep, een andere functionele zuurgroep dan carbon; andere aminozuren hebben aminegroepen die niet gehecht zijn aan de α-koolstofgroep1. Er zijn meer dan 500 aminozuren2, waarvan er 22 bekend staan als eiwitaminozuren die worden gebruikt voor genetische codering in ribosomale eiwitsynthese3. Deze 22 aminozuren kunnen verder worden onderverdeeld in essentiële en niet-essentiële. Essentiële aminozuren zijn noodzakelijk voor een organisme om goed te functioneren en kunnen alleen worden verkregen door externe bronnen. Niet-essentiële aminozuren kunnen in het organisme worden gesynthetiseerd. De indeling van de 22 aminozuren in essentieel/niet-essentieel is uniek voor individuele soorten. Alle andere aminozuren zijn niet-eiwit aminozuren (NPAAs) die niet zijn gecodeerd voor eiwitsynthese. Aminozuren, of ze nu eiwitten of niet-eiwitten zijn, kunnen ook een signaalrol spelen binnen een organisme en fungeren als metabole tussenpersonen4. Vanwege hun belangrijke en variërende rollen kunnen aminozuurniveaus inzicht geven in de toestand, functionaliteit en metabole routes van het organisme, enz. Er zijn twee hoofdmechanismen waarmee aminozuren kunnen worden opgenomen in een polypeptideketen: ribosomale eiwitsynthese, die de 22 aminozuren gebruikt bij het coderen, en niet-ribosomale peptidesynthese, die, naast eiwitaminozuren, het gebruik van sommige NPAAs bij de synthese mogelijk maakt. Bepaalde NPAAs kunnen eiwitaminozuren nabootsen, wat mogelijk leidt tot hun misincorporatie in peptiden en eiwitten. De misincorporatie veroorzaakt een misvouwing van eiwitten, wat op zijn beurt schadelijke effecten heeft5, zoals de misincorporatie van de NPAA L-3,4 dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) in plaats van tyrosine, met een negatieve invloed op de cellulaire functie en gezondheid 6,7. Een extra bron van opgenomen NPAAs is door de post-translationele modificatie (PTM) van aminozuurresiduen. Aminozuurresiduen worden om verschillende redenen gewijzigd, waaronder veranderingen in peptide- of eiwitconformatie, stabiliteit en functionaliteit. Bij hydrolyse van PTM-bevattende eiwitten of peptiden komen deze gemodificeerde aminozuurresiduen vrij in hun vrije NPAA-vorm 8,9.
De NPAA-β-methylamino-L-alanine (BMAA) geproduceerd door cyanobacteriën, diatomeeën en dinoflagellaten10 is een vermoedelijk neurotoxine dat betrokken is als een bijdragende factor aan verschillende neurodegeneratieve ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose / parkinsonisme-dementiecomplex (ALS-PDC)11,12, amyotrofische laterale sclerose en de ziekte van Alzheimer13 . Er wordt gesuggereerd dat BMAA ten onrechte is opgenomen in de polypeptideketen van eiwitten in plaats van L-serine14 en / of andere eiwitaminozuren. De misincorporatie van BMAA kan leiden tot het verkeerd vouwen van eiwitten, wat resulteert in de afzetting van eiwitaggregaten in neuronen14. In het afgelopen decennium is de belangstelling voor BMAA aanzienlijk toegenomen. Een breed scala aan cyanobacteriële soorten uit zoetwater-, mariene en brakke omgevingen is ontdekt om BMAA15 te produceren, wat leidt tot hun wijdverspreide verspreiding in verschillende ecosystemen16,17. Bovendien is aangetoond dat BMAA biomagnificeert via de voedselketen naar het menselijke voedselweb18,19. Vanwege de mogelijke gezondheidseffecten, het gebrek aan begrip en de incongruenties van BMAA-toxiciteit, is het noodzakelijk om verder onderzoek voort te zetten totdat de toxiciteit van BMAA uiteindelijk wordt begrepen of BMAA als veilig wordt beschouwd20,21.
De analyse van aminozuren in biologische monsters kan worden onderverdeeld in vier hoofdstappen: monstervoorbereiding, aminozuurderivatisatie, scheiding en detectie, en identificatie en kwantificering. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) is de voorkeursanalysemethode omdat het een gerichte en reproduceerbare scheiding en analyse van aminozuren biedt.
Monstervoorbereidingstechnieken voor het analyseren van cyanobacteriële en andere algenmonsters omvatten voornamelijk een extractiemethode voor aminozuren in hun vrije en eiwitgebonden vormen. In de loop der jaren zijn de extractiemethoden relatief consistent gebleven met gemeenschappelijke elementen, waaronder de desolvatie van het monster om de vrije aminozuren van hun gebonden vorm te scheiden, gevolgd door eiwitprecipitatie en het vrijkomen van de gebonden aminozuren door hydrolyse met zoutzuur (HCl) bij verhoogde temperaturen22 . Deze extractievorm is geoptimaliseerd voor eiwitaminozuren en gebruikt voor NPAAs. De detectie en kwantificering van BMAA en zijn isomeren (figuur 1), aminoethylglycine (AEG) en 2,4-diaminobutyrinezuur (2,4-DAB) bij dezelfde soort cyanobacteriën hebben echter inconsistente resultaten in de literatuur laten zien, met een mogelijke verklaring die ligt in verschillen in de groeiomstandigheden en/of de stam van algen die verschillende of geen hoeveelheden BMAA23 produceren . Er is betoogd dat een meer waarschijnlijke verklaring voor de inconsistenties in de detectie en kwantificering van BMAA en zijn isomeren te wijten is aan niet-gevalideerde experimentele protocollen, het gebruik van een breed scala aan analytische technieken en onvoldoende experimentele details in de gerapporteerde methoden16,24 die leiden tot onherleidbare interlaboratoriumgegevens. Glover et al.25 en Banack26 hebben echter onlangs een analytische techniek ontwikkeld en gevalideerd voor de detectie en kwantificering van BMAA en zijn isomeren met behulp van ultra-performance vloeistofchromatografie (UPLC)-MS / MS in overeenstemming met de International Society of Analytical Chemists (AOAC), US Pharmacopeia en FDA-richtlijnen die nodig zijn voor validatie in één laboratorium.
Deze validatie-experimenten richtten zich op de scheiding en detectie van BMAA en zijn isomeren en gingen niet in op de inconsistenties in monstervoorbereidingsprotocollen. Lage et al.27 vergeleken de prestaties van drie gangbare extractiemethoden voor het kwantificeren van BMAA en zijn isomeren in cyanobacteriële monsters via LC-MS/MS: vaste fase extractie (SPE) van vrije aminozuren28,29; een eiwitprecipitatiemethode met methanolextractie en acetonprecipitatie30; en de meest gebruikte extractiemethode voor BMAA, eiwitprecipitatie met trichloorazijnzuur (TCA)31. Ze concludeerden dat de TCA-eiwitprecipitatie het optimale protocol was, wat hogere BMAA-concentraties in de testmonsters opleverde in vergelijking met de andere extractiemethoden. Hun studie valideerde TCA-extractie met derivatisatie van BMAA met behulp van 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamaat (AQC) in een cyanobacteriënmatrix, wat een gevestigde gids biedt voor het bereiken van betrouwbare en reproduceerbare BMAA-gegevens. TCA-aminozuurextractie is een geaccepteerde en veel voorkomende monstervoorbereidingstechniek die ook op andere matrices kan worden toegepast. De stabiliteit van het aminozuur tijdens hydrolyse moet echter worden overwogen om afbraak of oxidatie te voorkomen, wat kan worden overwonnen met het gebruik van chemische modificatoren en reductiemiddelen32. TCA-extractie wordt routinematig gebruikt en onderwezen aan nieuwe onderzoeksstudenten, en hoewel het protocol op grote schaal wordt gerapporteerd, is een visueel hulpmiddel bij de toepassing van deze methode een waardevolle bron, die zorgt voor een goede en consistente uitvoering.
Omgekeerde fasechromatografie wordt vaak gebruikt om aminozuren te scheiden, waarvoor een derivatisatiestap voorafgaand aan analyses vereist is. De derivatisatie van aminozuren zoals BMAA zorgt voor chromatografische retentie en kan de resolutie tussen isomeren verhogen. Het verhoogt ook de moleculaire massa en verbetert de ionisatie in de massaspectrometer. Verschillende derivatiserende reagentia zijn gebruikt voor de analyse van aminozuren via LC-MS/MS, waaronder propylchloorformine (PCF)33, 6-aminoquinolyl-N-hydrosysuccinimidylcarbamaat (AQC)27, 9-fluorenylmethylchloroformate (FMOC)34 en dansylchloride (DC)35. De enige gevalideerde technieken voor het analyseren van BMAA gebruikten echter PCF36 of AQC 24,26,37 als hun derivatiserende reagens.
De reikwijdte van dit protocol is gericht op de TCA-extractie van NPAAs uit cyanobacteriële matrices. Het is een arbeidsintensieve methode die routinematig wordt gebruikt en onderwezen in academische en industriële onderzoekslaboratoria op basis van manuscripten die mogelijk weinig details bevatten; daarom geeft dit protocol details over de procedure en technieken die betrokken zijn bij het voorbereiden van monsters voor de analyse van vrije en gebonden BMAA als het modelaminozuur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL glass shell vials</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>REST-24663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.3% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>BR780546-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mM HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z740441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 M HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.11727</td>
			<td>Dilute 70:1 Ethanol:water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C Freezer</td>
			<td>Martin CHRIST</td>
			<td>102142</td>
			<td>Alpha 2-4 Ldplus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>34967-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale Balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal evaporator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13442549</td>
			<td>DNA120-115 SpeedVac Concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP022620100-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D5-2,4-DAB standard</td>
			<td>CDN Isotopes</td>
			<td>D-7568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>CEO-8492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T2318-500EA</td>
			<td>Greiner centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS8161-100EA</td>
			<td>Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass engraver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrolysis vial &#38; Lid</td>
			<td>Eldex Laboratories/Waters</td>
			<td>WAT007568 &#38; WAT007569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice and container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper wipe</td>
			<td>Kimwipes/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.2 M&#937;.cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen tap with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000055-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - noise cancelling headphones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - oven gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td>QSONICA Sonicators</td>
			<td>Q125 Sonicator</td>
			<td>Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample transfer spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis

Niet-eiwit aminozuren (NPAAs) zijn een grote klasse aminozuren (AAs) die niet genetisch gecodeerd zijn voor vertaling in eiwitten. De analyse van NPAAs kan cruciale informatie opleveren over cellulaire opname en / of functie, metabole routes en potentiële toxiciteit. β-methylamino-L-alanine (BMAA) is een neurotoxische NPAA geproduceerd door verschillende algensoorten en wordt geassocieerd met een verhoogd risico op neurodegeneratieve ziekten, wat heeft geleid tot aanzienlijke onderzoeksinteresse. Er zijn talloze manieren om AA's te extraheren voor analyse, waarbij vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie de meest voorkomende is, waarvoor eiwitprecipitatie vereist is, gevolgd door zure hydrolyse van de eiwitpellet. Studies naar de aanwezigheid van BMAA bij algensoorten leveren tegenstrijdige resultaten op, waarbij het gebruik van niet-gevalideerde monstervoorbereiding/extractie en analyse een primaire oorzaak is. Zoals de meeste NPAAs is eiwitprecipitatie in 10% waterige TCA en hydrolyse met dampende HCl de meest geschikte vorm van extractie voor BMAA en zijn isomeren aminoethylglycine (AEG) en 2,4-diaminobutyrinezuur (2,4-DAB). Het huidige protocol beschrijft de stappen in een gevalideerde NPAA-extractiemethode die vaak wordt gebruikt in onderzoeks- en onderwijslaboratoria.

Een illustratie van het extractieprotocol is opgenomen in figuur 2 als een samengevatte naslaggids. De resultaten verkregen door Violi et al.38 werden gekozen om een positief resultaat uit dit extractieprotocol weer te geven voor de analyse van BMAA-isomeren uit cyanobacteriën. Negentien enkele soorten cyanobacteriën werden gekweekt uit 11 Oost-Australische zoetwaterlocaties. Met behulp van hetzelfde protocol werden de BMAA-isomeren geëxtraheerd in vrije en eiwitfracties, gederivatiseerd met PCF en geanalyseerd met behulp van LC-MS / MS. Zeventien van de cyanobacteriële isolaten waren positief voor BMAA en alle 19 bevatten het 2,4-DAB-isomeer. Een positief resultaat wordt bevestigd door een gevalideerde LC-MS/MS-methode te gebruiken en ten minste drie mrm-overgangen (multiple reaction monitoring) waar te nemen, één als kwantorion en twee als kwalificatie-ionen op de verwachte retentietijd. Een representatief MRM-chromatogram van een standaard met BMAA en zijn isomeren, aangegeven door de kleurgecodeerde lijnen, is weergegeven in figuur 3. De aanwezigheid en concentratie van BMAA en isomeren in alle 19 monsters, gesegmenteerd om de BMAA- en isomeerconcentratie in de vrije en gebonden fracties weer te geven, is samengevat in tabel 1. Een positieve detectie voor alle drie de isomeren werd waargenomen in de vrije fractie van de Merismopedia-soorten verzameld uit Lake Liddell (NSW, Australië), waar de vrije fractie een BMAA-concentratie van 68,38 μg / g drooggewicht (DW) bevatte ± 2,25 μg / g DW, 2,4-DAB met een concentratie van 1.223,98 μg / g DW ± 20,7 μg / g DW, en AEG met een concentratie van 125,27 μg/g DW ± 4,19 μg/g DW. De chromatografische MRM's zijn weergegeven in figuur 4. Om een negatief resultaat voor BMAA en zijn isomeren in een monster te illustreren, wordt de gebonden fractie van de Microcystis flos-aquae-soorten verzameld bij Walka Water Works (NSW, Australië) chromatografisch weergegeven in figuur 5. Hoewel de gebonden fractie geen BMAA, 2,4-DAB en/of AEG bevatte, bevatte de vrije fractie alle drie de isomeren, met concentraties van respectievelijk 79,86 μg/g DW ± 1,59 μg/g DW, 1.156,15 μg/g DW ± 8,46 μg/g DW en 433,83 μg/g DW ± 8,92 μg/g DW.
Door het gebruik van dit protocol bevestigden Violi et al.38 dus de aanwezigheid van BMAA-isomeren in oost-Australische zoetwatercyanobacteriën en bepaalden welke cyanobacteriën toxineproducerende capaciteiten hadden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig01.jpg"> Figuur 1: De chemische structuur van BMAA en zijn isomeren 2,4-DAB en AEG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig02.jpg"> Figuur 2: Samengevat referentiediagram van het extractieprotocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig03.jpg"> Figuur 3: LC-MS/MS-chromatogram van een kalibratiestandaard die D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA en AEG bevat voor isomeeridentificatie op basis van retentie, aangegeven door de gemarkeerde pieken. Sleutel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z bij 6,4 min (rood), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z bij 6,4 min (groen), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z bij 7,4 min (oranje) en BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z bij 7,8 min (blauw). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig04.jpg"> Figuur 4: LC-MS/MS chromatogram voor het detecteren van D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA en AEG in Merismopedia soorten verzameld uit Lake Liddell (NSW, Australië), aangegeven door de gemarkeerde pieken. Sleutel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z bij 6,4 min (rood), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z bij 6,4 min (groen), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z bij 7,4 min (oranje) en BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z bij 7,8 min (blauw). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig05.jpg"> Figuur 5: LC-MS/MS chromatogram van een negatieve controle voor 2,4-DAB, BMAA en AEG in een gebonden fractie van Microcystis flos-aquae soorten verzameld bij Walka Water Works (NSW, Australië). Sleutel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z bij 6,4 min (rood - piek gemarkeerd), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z bij 6,4 min (groen), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z bij 7,4 min (oranje) en BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z bij 7,8 min (blauw). De stippellijnen vertegenwoordigen de bewaartijden voor ontbrekende 2,4-DAB, AEG en BMAA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: BMAA, AEG en 2,4-DAB concentraties in cyanobacteriële isolaten. Concentraties ± standaardfout van het gemiddelde (n = 3). ND geeft aan dat er geen detectie is. De hoogste concentratie van elk gedetecteerd isomeer wordt groen gemarkeerd. De tabel is een aangepaste versie van Violi et al.38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779_Table%201.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Het huidige protocol beschrijft de extractie van niet-eiwitaminozuren uit biologische matrices via trichloorazijnzuur (TCA) eiwitprecipitatie en zure hydrolyse vóór analyse met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie.

Extractie van niet-eiwit aminozuren uit cyanobacteriën voor vloeistofchromatografie- tandem massaspectrometrieanalyse

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

Dit protocol zal gebruikers helpen en studenten de juiste stappen leren bij de extractie van BMA, AEG en 2, 4-DAB. Daardoor wordt de kans op fouten geminimaliseerd en consistente resultaten behaald. Deze methode is een veelgebruikte en gevalideerde methode voor de extractie van BMA en zijn isomeren, AEG en 2, 4-DAB in een sauna bacteriële matrix.Deze methode kan worden gebruikt om verder onderzoek te doen naar de toxiciteit van BMA's en een beter begrip te geven van BMA en de bijbehorende gezondheidseffecten. Begin met centrifusie van het cyanobacteriënmonster bij 3.500 G gedurende 10 minuten bij 25 graden Celsius. En het supernatant weggooien in biologisch afval.Bedek de centrifugebuis met de pellet met een afdichtingsfilm en prik een paar gaten in de film door met een scherp pincet met lange neus. Bewaar de buis vervolgens rechtop bij min 80 graden Celsius. Plaats de buis na 30 minuten rechtop in een glazen container met vriesdroger en plaats de container vijf minuten in de vriezer van min 80 graden Celsius voor koeling.Haal de glazen container uit de vriezer en bevestig het rubberen deksel. Zorg ervoor dat de handgreep op de rubberen klepuitlaat van de vriesdroger naar boven wijst en naar de atmosfeer wordt geventileerd. Bevestig de glazen container stevig.Draai langzaam aan de handgreep van de rubberen klepuitlaat om deze in een neerwaartse positie te richten om de pot bloot te stellen aan het vacuüm. En laat tot 24 uur vriesdrogen toe om alle vloeistof te sublimeren. Als u klaar bent, weeg dan 15 tot 50 milligram bevroren monsterpellets in een centrifugebuis van 15 milliliter.Met behulp van een analytische balans. Voeg aan het monster 300 tot 600 microliter 10%waterig trichloorazijnzuur of TCA toe. Plaats de monsterbuizen in een container gevuld met gemalen ijs.Veeg de sonicatorsonde af met een pluisvrij papierdoekje bespoten met 70% ethanol voordat u het uiteinde van de sonde volledig in het monster dompelt en op start drukt. Als u klaar bent, plaatst u het monster met de centrifugebuis gedurende één minuut op ijs. En herhaal het ultrasoonapparaatproces om cellysis te garanderen.Na het afkoelen van het monster op vier graden Celsius gedurende 24 uur. Centrifugeer bij 3.500 G gedurende 15 minuten bij acht graden Celsius. Breng vervolgens met behulp van een micropipet het supernatant over op een buis van twee milliliter met het label vrije fractie.Voeg 400 microliter 10% waterige TCA toe aan de monsterpellet en breek de pellet op door vortexbeweging of met de micropipetpunt. Centrifugeer en breng het supernatant over in dezelfde twee milliliter vrije fractiebuis. Herhaal deze stap een derde keer met 10% TCA-aceton.Plaats de vrije fractiebuis met het deksel open in een centrifugale verdamper totdat alle vluchtige vloeistof is verwijderd. Zodra het monster vrij is van vluchtige vloeistoffen, bedekt u de buis stevig met de plafondfolie en doorboort u de film met een paar gaten met een scherp pincet met lange neus. Na vriesdrogen eerder gedemonstreerd, reconstitueer het monster met 200 microliter 20 millimolar zoutzuur en plaats het in een vriezer van min 80 graden Celsius.Voeg 400 microliter 100% aceton toe aan de monsterpellet met behulp van een micropipet en breek de pellet op met behulp van vortex-agitatie of de micropipetpunt. Breng de gewassen en geresuspendeerde pellet kwantitatief over op de overeenkomstige glazen injectieflacon. Met behulp van een micropipet van één milliliter.Voeg nog eens 400 microliter aceton toe aan de monsterbuis om de resterende pellet over te brengen. Centrifugeer en decanteer de bovennatuurlijke vloeistof in biologisch afval voordat de pellet in een centrifugale verdamper wordt gedroogd totdat de vloeistof is verwijderd en de pellet droog is. Voeg ter voorbereiding van het vacuümhydrolysebestand één milliliter van zes molair zoutzuur toe aan de bodem van het hydrolysebestand.Plaats de gelabelde injectieflacons met gedroogde monsters voorzichtig in het hydrolysebestand met behulp van een pincet dat een rechtopstaande stabiele positie garandeert. Bevestig het deksel aan het hydrolysebestand en druk op de rode knop op het deksel om de klep te sluiten. Nadat u de vacuümpomp hebt ingeschakeld, bevestigt u de vacuümbuis aan de kop van het deksel van het hydrolysebestand en drukt u op de groene knop op het deksel om de klep te openen.Laat vervolgens de vacuümpomp de lucht gedurende één minuut uit de injectieflacon verwijderen. Sluit vervolgens de injectieflacon door op de rode knop op het deksel van de hydrolyseflacon te drukken. Schakel de vacuümpomp uit en verwijder de vacuümbuis.Bevestig een rubberen buis aan de stikstofgaskraan op de laboratoriumbank. En open de kraan iets. Plaats de duim aan het einde van de buis, sluit deze af en tel totdat het gas begint te ontsnappen als de druk toeneemt.Bevestig vervolgens het andere uiteinde van de rubberen buis aan de kop van het deksel van de hydrolyseflacon. En druk meteen op de groene knop van het deksel. Tel de tijd die nodig is om het gas te laten ontsnappen.Druk snel op de rode knop op het deksel en verwijder de rubberen buis. Herhaal het hele vacuümbehandelingsproces twee keer. Ervoor zorgen dat de glazen hydrolyseflacon vrij is van lucht en gevuld is met stikstofgas.Plaats de hydrolyseflacon in een voorverwarmde oven op 110 graden Celsius gedurende 16 tot 18 uur. Verwijder met ovenhandschoenen de glazen hydrolyseflacon uit de oven. Laat de injectieflacon 10 minuten afkoelen in de zuurkast voordat u op de groene knop drukt terwijl u deze wegkijkt om druk en gas los te laten.Reconstitueer de gehydrolyseerde monsterpellets met 200 microliter 20 molair zoutzuur in de injectieflacon in de schaalflacon en resuspendeer de pellet. Centrifugeer de injectieflacons met de gereconstitueerde monsterpellets gedurende twee minuten bij 5, 300 G en 25 graden Celsius. Breng de gereconstitueerde vrije fractiemonsters en eiwitfractie over in de twee milliliter filterbuizen met 0,2 micron poriemembraanfilters en gelabeld als vrije fractie en eiwitfractie.Plaats de buisjes voor centrifugatie gedurende 30 minuten op 5.000 G en 25 graden Celsius. Het meervoudige reactiebewakingschromatogram van een standaard die bèta-methylamino-L-alanine of BMAA bevat en de isomeren die worden aangegeven door de kleurgecodeerde lijnen, wordt hier weergegeven. Een positieve detectie voor alle drie de isomeren, BMAA, DAB en AEG werd waargenomen in de vrije fractie van de Merismopedia-soorten verzameld uit het Liddelmeer.Terwijl de gebonden fractie van de Microcystis flos-aquae soorten verzameld bij Waka Waterworks een negatief resultaat illustreerde voor BMAA en zijn isomeren. De geresuspendeerde pellet moet kwantitatief worden overgebracht in de overeenkomstige injectieflacon om een nauwkeurig normalisatiepunt op basis van cyanobacteriënmassa mogelijk te maken. Patiënten en due diligence worden geadviseerd tijdens het uitvoeren van deze stap.Volg deze procedure. De geëxtraheerde fracties zullen een devitalisatiestap moeten ondergaan om een omgekeerde fase mogelijk te maken. Vloeistofchromatografie, tandem massaspectrometrie analyse.De toepassing van deze techniek breidt verschillende wetenschappelijke gebieden uit. Inclusief de milieuwetenschappen door de analyse van cynotoxinen in milieumonsters. En gebieden zoals toxicologie en biochemie door het onderzoek van de Misincorporation-theorie van BMA.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Ongerichte Metabolomics uit biologische grondstoffen gebruiken UltraPerformance Liquid Chromatography-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Met behulp van capillaire elektroforese te kwantificeren organische zuren uit Plant Tissue: A Case Test Onderzoeken<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Zaden

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Een eenvoudige methode voor glucosinolaat Extractie en analyse met hoge-druk vloeistofchromatografie (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

Fizzy Extraction of Volatile Organic Compounds Combined with Atmospheric Pressure Chemical Ionization Quadrupole Mass Spectrometry

Fizzy Extractie van vluchtige organische verbindingen gecombineerd met atmosferische druk Chemische ionisatie Quadrupole Mass Spectrometry

Chemical analysis of volatile and semivolatile compounds dissolved in liquid samples can be challenging. The dissolved components need to be brought to ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Real-time adem analyse met behulp van secundaire Nanoelectrospray ionisatie gekoppeld aan massaspectrometrie voor hoge resolutie

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Synthese en analyse van de Spectrometrie van de massa van Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof/deuteriumuitwisseling voor conformatiekarakterisering van eiwitten met top-down massaspectrometrie

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Curation of Computational Chemical Libraries Demonstrated with Alpha-Amino Acids

Curatie van computationele chemische bibliotheken gedemonstreerd met alfa-aminozuren

Exhaustive generation of molecular structures has numerous chemical and biochemical applications such as drug design, molecular database construction, ...