Name: extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-12-09T12:40:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

D.P.B., K.J.R., ו-S.M.M. נתמכים על ידי קרן איאן פוטר, ו-J.P.V. זוכה בתוכנית הכשרה למחקר של ממשלת אוסטרליה, Stipend.

המין ציאנובקטריה מריסמופדיה שימש למחקר הנוכחי38.
1. הכנת מדגם גולמי
<ol><li>לאסוף את חלאת האצות ממקור העניין הימי או מבקבוקון מתורבת ציאנובקטריאלי ולהניח אותו לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל38. הערה: יש להקפיא את הדגימה בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס לצורך עקירות מאוחרות יותר ולהפשיר אותה לפני השלב הבא.</li>
	<li>צנטריפוגה הצינורות המכילים את הדגימה ב 3,500 x גרם במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. מזרימים את הסופר-נטנט לתוך מיכל פסולת ומשליכים אותו לפסולת ביולוגית. הערה: הסופרנטנט עשוי להיות שמור לניתוח עתידי של האקסוזום.</li>
	<li>מכסים היטב את הצינור המכיל את כדור הדגימה בסרט איטום (ראו טבלת חומרים) וחודרים כמה חורים בסרט באמצעות פינצב אף חד וארוך. אחסן את הצינור במצב זקוף בטמפרטורה של −80 °C למשך 30 דקות.</li>
	<li>הפעילו את מייבש ההקפאה והפעילו אותו בטמפרטורה של 0.1 mbar ו-−80°C (~30 דקות). הערה: הפרמטרים (שלב 1.4) מותאמים למייבש ההקפאה המשמש למחקר הנוכחי (ראו טבלת חומרים). עקוב אחר נהלי ההפעלה הסטנדרטיים בהתאם לדגם מייבש ההקפאה הזמין במעבדה או הגדר את הטמפרטורה הנמוכה ביותר האפשרית אם דגם מייבש ההקפאה אינו יורד עד 80°C-.<ol><li>הכניסו את צינורות הצנטריפוגה זקופים למיכל זכוכית של מייבש הקפאה והניחו אותם בתוך מקפיא של 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לקרר את הצנצנת.</li>
		<li>מוציאים את מיכל הזכוכית מהמקפיא ומחברים את מכסה הגומי.</li>
		<li>ודאו שהידית בשקע שסתום הגומי של מייבש ההקפאה מאווררת לאווירה (מצביעה כלפי מעלה) וחברו את מיכל הזכוכית בחוזקה.</li>
		<li>סובבו את הידית של שקע שסתום הגומי באיטיות רבה למצב הצבעה כלפי מטה כדי לחשוף את הצנצנת לוואקום ואפשרו עד 24 שעות של ייבוש בהקפאה כדי להבטיח סובלימציה של כל הנוזלים.</li>
		<li>כדי לשחרר את השואב בצנצנת, סובבו את הידית למצב הצבעה כלפי מעלה, נתקו את מיכל הזכוכית והסירו את הדגימות המיובשות בהקפאה.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש באיזון אנליטי כדי לשקול 15-50 מ"ג של כדורי דגימה מיובשים לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. הערה: ניתן להכניס את הדגימות לאחסון של −80 מעלות צלזיוס אם לא יעובדו בשלב זה.</li>
</ol>2. שכיבה של תאים ופיצול של NPAAs חופשיים
<ol><li>הוסף 100 μL של 100 ננוגרם/מ"ל של D5-2,4-DAB (ראה טבלת חומרים) סטנדרטי באמצעות מיקרופיפט לצינור הדגימה (אופציונלי).</li>
	<li>הוסף 300-600 μL של 10% עם טריכלורואצטי מימי (TCA, ראה טבלת חומרים) או 300-600 μL של 11.7%-13.3% TCA, בהתאמה, אם מוסיפים את תקן D5-2,4-DAB. הערה: בחר נפח של TCA מימי המכסה באופן מלא את הכדור.</li>
	<li>מניחים את צינורות הדגימה במיכל מלא בקרח כתוש.</li>
	<li>השתמש ב-sonicator של בדיקה (ראה טבלת חומרים) בהספק בינוני-גבוה (70%) ו-lyse את הדגימה במשך דקה אחת בהתאם לשלבים הבאים. התראה: הקפידו על הגנה מספקת על איכות ה-PPE באמצעות אוזניות מבטלות רעשים.<ol><li>עקוב אחר פרוטוקולי הבטיחות המתאימים כהכנה לשימוש בסוניקטור הבדיקה על ידי הצבת שילוט בשימוש על הדלת, ביצוע סוניקציה במכסה האדים ושימוש באוזניות מבטלות רעשים.</li>
		<li>הפעל את הסוניקטור והזן את הפרמטרים הבאים: משרעת, 70%; זמן, דקה אחת.</li>
		<li>יש לרסס 70% אתנול על מגבון נייר ללא מוך (ראו טבלת חומרים) ולנגב את הבדיקה.</li>
		<li>היסחף באופן מלא את קצה הבדיקה לתוך הדגימה ולחץ על start.</li>
		<li>כאשר הסוניקטור של הגשושית נעצר, הנח את צינור הצנטריפוגה המכיל את הדגימה על קרח למשך דקה אחת.</li>
		<li>כדי להבטיח שהתאים מומים, חזור על שלבים 2.4.3-2.4.5 פעם נוספת.</li>
	</ol></li>
	<li>הכניסו את הדגימה למקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 12-24 שעות כדי לאפשר שקיעת חלבון.</li>
	<li>צנטריפוגה דגימת TCA מימית של 10% ב-3,500 x גרם למשך 15 דקות ב-8 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>השתמש במיקרופיפט כדי להעביר את הסופר-נאטנט לצינור 2 מ"ל שכותרתו "שבר חופשי".</li>
	<li>Micropipette 400 μL של 10% TCA מימי לתוך צינור צנטריפוגה המכיל את גלולת הדגימה הנותרת ולפרק את הכדור או על ידי תסיסה מערבולת או עם קצה micropipette.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.6-2.7, העברת supernatant לאותו 2 מ"ל "שבר חופשי" צינור.</li>
	<li>מיקרופיפט 400 μL של 10% TCA/אצטון לתוך צינור צנטריפוגה עם הכדור הנותר ולפרק את הכדור עם מערבולת או קצה micropipette.</li>
	<li>צנטריפוגה של דגימת 10% TCA/אצטון ב-3,500 x גרם למשך 15 דקות ב-8 מעלות צלזיוס. השתמש במיקרופיפטה כדי להעביר את הסופר-נאטנט לצינור 2 מ"ל שכותרתו "שבר חופשי".</li>
	<li>מניחים את צינור "השבר החופשי" כשהמכסה פתוח לתוך מאייד צנטריפוגלי (ראו טבלת חומרים) עד להסרת כל הנוזלים הנדיפים (לפחות שעה אחת).</li>
	<li>לאחר שהדגימה נקייה מנוזלים נדיפים, מכסים היטב את הצינור בסרט איטום וחודרים את הסרט בכמה חורים באמצעות פינצב אף חד וארוך. הכניסו את הדגימה למקפיא של −80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הקפיא יבש את הדוגמה "שבר חופשי" על ידי חזרה על כל השלבים בשלב 1.4.</li>
	<li>Micropipette 200 μL של 20 mM חומצה הידרוכלורית (HCl) לתוך צינור "שבר חופשי" כדי לשחזר את הדגימה מיובשת בהקפאה ולמקם אותו ב -80 מעלות צלזיוס אחסון מקפיא. הערה: "השבר החופשי" של הדגימה מוכן לסינון בשלב 4. הגלולה הנותרת תעובד בהמשך בשלבים הבאים לפיצול חלבון.</li>
</ol>3. פיצול של NPAAs הקשורים לחלבון
<ol><li>השתמש בחרט זכוכית כדי לסמן בקבוקוני מעטפת זכוכית עם פרטי הדגימה לזיהוי. הערה: חומצה חזקה עלולה לפזר את תיוג הדיו; לכן, מומלץ לחרוט את התוויות על זכוכית.</li>
	<li>מיקרופיפט 100 μL של 100 ng/mL D5-2,4-DAB סטנדרטי על גלולת הדגימה (אופציונלי).</li>
	<li>Micropipette 400 μL של 100% אצטון על כדור הדגימה ולפרק את הכדור באמצעות תסיסה מערבולת או קצה micropipette.</li>
	<li>השתמש במיקרופיפטה של 1 מ"ל שנקבעה ב-1,000 μL כדי להעביר את הכדור השטוף והמוחזר לבקבוקון מעטפת הזכוכית המתאים. הערה: ניתן להוסיף עוד 400 μL של 100% אצטון לכדור נסער כדי לסייע בהעברה מלאה של הכדור לתוך בקבוקון קליפת הזכוכית. ניתן לחזור על כך בפעם השלישית במידת הצורך.</li>
	<li>צנטריפוגה בעוצמה של 8,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ומפזרת את הנוזל לפסולת ביולוגית.</li>
	<li>מניחים את הכדור הנותר לתוך מאייד צנטריפוגלי עד שכל הנוזל מוסר והכדור יבש (~1 שעות).</li>
	<li>הכן את בקבוקון ההידרוליזה בוואקום על ידי הוספת 1 מ"ל של 6 M HCl לתחתית בקבוקון ההידרוליזה.</li>
	<li>השתמשו בפינצטה כדי להכניס בזהירות את בקבוקוני הקליפה המסומנים המכילים את הדגימות המיובשות לתוך בקבוקון ההידרוליזה, מה שמבטיח מיקום זקוף ויציב. הערה: ניתן להשתמש בבקבוקוני קליפה ריקה כדי לסייע בשמירה על בקבוקוני הדגימה זקופים אם מספר הדגימות קטן מהקיבולת של בקבוקון ההידרוליזה.</li>
	<li>חבר את המכסה לבקבוקון ההידרוליזה ולחץ את הידית האדומה על המכסה כדי לסגור את השסתום.</li>
	<li>הפעל את משאבת הוואקום, חבר את שפופרת הוואקום לראש מכסה בקבוקון ההידרוליזה ולחץ על הידית הירוקה במכסה כדי לפתוח את השסתום.</li>
	<li>אפשרו למשאבת הוואקום (ראו טבלת חומרים) להוציא את האוויר מהבקבוקון למשך דקה אחת.</li>
	<li>סגור את הבקבוקון על ידי לחיצה על הידית האדומה במכסה בקבוקון ההידרוליזה, כבה את משאבת הוואקום והסר את שפופרת הוואקום.</li>
	<li>חברו צינור גומי לברז גז החנקן על ספסל המעבדה ופתחו מעט את הברז. הניחו את האגודל בקצה הצינור, אטמו אותו וספרו עד שהגז מתחיל לברוח כשהלחץ מצטבר. זו תהיה מסגרת הזמן לשלב הבא. התאם את זרימת הגז למסגרת זמן מתאימה.</li>
	<li>חבר את הקצה השני של צינור הגומי לראש מכסה בקבוקון הידרוליזה ולאחר מכן מיד לדחוף את הידית הירוקה של המכסה. ספרו את הזמן שנקבע בשלב 3.13 ודחפו במהירות את הידית האדומה על המכסה והסירו את צינור הגומי.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.10-3.14 פעמיים כדי להבטיח שבקבוקון ההידרוליזה מזכוכית נקי מאוויר ומלא בגז חנקן.</li>
	<li>הכניסו את בקבוקון ההידרוליזה לתנור שחומם מראש בטמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס למשך 16-18 שעות.</li>
	<li>השתמשו בכפפות התנור כדי להסיר את בקבוקון ההידרוליזה מהזכוכית מהתנור ולאפשר לו להתקרר בתוך קולט האדים למשך 10 דקות. בתוך מכסה המנוע, כשאתה פונה אליו הרחק ממך, לחץ על הידית הירוקה כדי לשחרר לחץ וגז.</li>
	<li>השתמש בפינצטה כדי להסיר את בקבוקוני הקליפה מבקבוקון ההידרוליזה.</li>
	<li>שחזרו את כדורי הדגימה שעברו הידרוליזה על ידי מיקרו-פיפטינג של 200 מיקרו-ליטר של 20 mM HCl לתוך בקבוקון הקליפה. ודא שהכדור עובר החייאה על ידי מערבולת או באמצעות קצה פיפטה.</li>
	<li>צנטריפוגה של בקבוקוני הקונכייה המכילים את כדורי הדגימה המשוחזרים למשך 2 דקות ב 5,300 x g ו 25 °C.</li>
</ol>4. סינון לדוגמה
<ol><li>תייג צינורות מסנן 2 מ"ל (ראה טבלת חומרים) המכילים מסנני קרום נקבוביות 0.2 מיקרומטר כ"שבר חופשי " ו"שבר חלבון ".</li>
	<li>העבר את הדגימות המשוחזרות משלב 2.15 (שבר חופשי) ושלב 3.20 (שבר חלבון) לצינורות הסינון המתאימים.</li>
	<li>מניחים אותם בצנטריפוגה למשך 30 דקות ב 5,000 x גרם ו 25 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר את המסננים מצינורות המסנן וסגור אותם. הדגימות מוכנות כעת להפקת חומצות אמינו בשלב 5. הערה: ניתן להכניס את הדגימות למקפיא −80 מעלות צלזיוס לאחסון לצורך נגזרת וניתוח מאוחרים יותר.</li>
</ol>5. נגזרת חומצת אמינו
<ol><li>לגזור את הדגימות באמצעות פרופיל כלורופורמט (PCF)39 או 6-אמינוקווינוליל-N-הידרוסיסוקסינימידיל קרבמט (AQC)40 בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול המיצוי המתואר כאן לניתוח NPAAs חל על ניתוח חומצות אמינו בדגימות ביולוגיות. עבור מדריכים על בידוד וגידול זנים ציאנובקטריאליים, ניתן להתייחס לשיטות שהוצגו במחקר על ידי Violi et al.38. השלב הראשון בפרוטוקול לוקח את הדגימה לנקודה שבה ניתן להשיג נורמליזציה בין דגימות כנגד המשקל היבש. השלב השני הוא תזה תאית לשחרור האנליטים וניתן לבצעה באמצעות מגוון טכניקות, כולל שיבושים מכניים/ליזות כגון סוניקציית בדיקה כמתואר בפרוטוקול זה, מחזורי הקפאה/הפשרה, שחיקה וכרסום חרוזים, ושיבושים לא מכניים כגון אנזימטי, דטרגנט ו/או תזה כימית. שיבוש מכני ידוע כיתרון על פני לא מכני מכיוון שהוא מאפשר קיבולת גדולה יותר של הדגימה לליזה תוך מתן אפשרות לקשרים ולחלבונים התוך-תאיים להישאר שלמים41, אם כי מטריצת הדגימה עשויה להכתיב את השיטה האופטימלית לליזה של התא.
משקעי חלבון הם השלב השלישי הקריטי של פרוטוקול זה בעת מיצוי חומצות אמינו לניתוח. TCA הוא הממס הנפוץ ביותר; עם זאת, נעשה שימוש גם בחומצה פרכלורית, אצטון, מתיל טרט-בוטיל אתר (MTBE), מתנול ו/או אצטוניטריל 8,42, כאשר כל ממס מיצוי נועד לחלץ ולזרז מצעים שונים. המודל המתואר כאן מחלץ את ה-NPAA BMAA ואת האיזומרים שלו ממטריצה ציאנובקטריאלית, ולמרות שנעשה שימוש במגוון ממסים שונים, שני הממסים הנפוצים ביותר הם 10% TCA במים (מימיים) ו-10% TCA באצטון. באופן כללי, משקעי חלבון עם TCA משמשים בדרך כלל למיצוי חומצות אמינו כדי לפרק חומצות אמינו חופשיות מחומצות האמינו הקשורות לחלבון. בנוסף, מיצוי TCA מאפשר לקבוע את תכולת החלבון הכוללת, להפחית מזהמים עבור החלק החופשי, ולהפחית את הפעילות של פרוטאזות עם השפלה מינימלית של חלבון43. מיצוי ה-TCA של השבר החופשי פועל על ידי שטיפה ראשונית של חומרים מסיסים אורגניים, תוך השארת חלבונים ותרכובות בלתי מסיסות כגון שרידי דופן התא במשקע, ולאחר מכן מיצוי הידרוליזה תרמית של חומצות האמינו הקשורות לחלבון (שבר קשור) באמצעות חומצה חזקה.
הפיצול של החלק החופשי עם 10% TCA מימי בתוספת סוניקציה מייצר את משקעי החלבון הנרחבים ביותר בהשוואה לממיסים אורגניים אחרים44 וחומצת האמינו הטובה ביותר מתאוששת42. מחקרים מסוימים בוחרים להשתמש בחומצה בשילוב עם ממס אורגני (כלומר, 10%-20% TCA באצטון 43) כדי לזרז יותר מולקולות, כולל פפטידים/ביומולקולות קטנות יותר, למזער את פירוק החלבון ולהפחית מזהמים כגון מלחים43. יתרון נוסף של 10% TCA באצטון הוא קצב הייבוש המהיר יותר שלו בהכנת הכדור להידרוליזה, תוך מזעור שאריות הלחות למניעת שינוי חומצות אמינו. עם זאת, 10% TCA מימי בתוספת סוניקציה הם בעלי יעילות מיצוי טובה יותר של חומצות אמינו חופשיות בהשוואה ל-10% TCA באצטון44 בלבד. בנוסף, למשקעי TCA מימיים של 10% יש מגבלות כגון זמן ייבוש ארוך, אי יכולת לזרז את כל החלבונים או פפטידים/ביומולקולות קטנות, ובהתאם לאנליטיט המעניין (כלומר, חלבונים או חומצות אמינו), הדורשים תוספים וחומרים מחזרים כדי למנוע חמצון ופירוק45,46.
פרוטוקול זה משתמש בשילוב של 10% TCA מימי ו-10% TCA באצטון כדי להגדיל את משקעי החלבון, להבטיח זירוז פפטידים/ביומולקולות קטנות יותר, לאפשר זמני ייבוש מהירים יותר של גלולות ולהגביר את יעילות המיצוי, תוך ניצול שתי תכונות מיצוי הממסים. עם זאת, השילוב של 10% TCA מימי ו-10% TCA באצטון יכול לזרז פפטידים/ביומולקולות קטנות בשבר החופשי לאחר ש-10% TCA בסופרנטנט אצטון משולב עם השבר החופשי המיימי. במקרה זה, יש להעביר את המשקעים לחלק המאוגד להידרוליזה.
המחצית השנייה של פרוטוקול זה כוללת שחרור של חומצות אמינו (כלומר, BMAA) מכדור החלבון באמצעות הידרוליזה של אדי חומצה בטמפרטורות גבוהות בסביבה נטולת חמצן. הגורם המגביל בעיקר לשלב ההידרוליזה הוא שזה גוזל זמן ומייגע להכין. הדגירה למשך הלילה מונעת הכנה וניתוח מהירים וחסכוניים בזמן של הדגימה. בנוסף, ההעברה הכמותית של הכדור מצינור צנטריפוגה לבקבוקון פגז (שלב 3.4) היא תהליך מפרך הדורש חריצות וסבלנות כדי להבטיח נקודה מדויקת של נורמליזציה למשקל היבש. בעיות אפשריות שהמשתמש עלול להתמודד איתן הן העברה לא שלמה של הכדור, חלבונים רטובים הנדבקים לקצות הפיפטה ולצינור המקורי, וחלקיקים מוצקים של הכדור החוסמים את קצה הפיפטה. הצעה מעשית בסיוע להעברה קלה יותר של הכדור היא להסיר כ-0.3-0.5 מ"מ מקצה קצה הפיפטה בעזרת זוג מספריים, מה שיאפשר למשוך חלקיקי גלולה גדולים יותר ולשחררם לתוך בקבוקון הקליפה. שיטת העברה זו מקובלת למיצוי חלבונים עבור כל ניתוחי חומצות האמינו. עם זאת, יש לחקור שינויים לשיפור היעילות והדיוק של העברה כמותית של הכדור לתוך בקבוקון הקליפה.
ניתן להשתמש בשתי צורות של טכניקות הידרוליזה כדי לשחרר חומצות אמינו ממצבן הקשור לחלבון: הידרוליזה בפאזה נוזלית והידרוליזה של אדי חומצה. הידרוליזה בפאזה נוזלית, הכוללת תוספת של 6 M HCl על הדגימה, אשר ממוקמת לאחר מכן בתנור של 110 מעלות צלזיוס למשך הלילה, היא חלופה להידרוליזה של אדי חומצה המתוארת בפרוטוקול זה. טכניקות מיצוי המשתמשות בהידרוליזה בשלב נוזלי עשויות לדרוש עיבוד נוסף, כגון התפלה, במיוחד אם נבחרה נגזרת AQC, מכיוון שהיא דורשת תנאים בסיסיים לתיוג40. הידרוליזה של אדי חומצה מונעת התפלה ומאפשרת למשתמש את החופש לבחור בטכניקת הנגזרת עם שחזור הכדור הסופי לפני הסינון. יתר על כן, ללא תלות בשיטת ההידרוליזה שנבחרה, הדגימות עשויות לדרוש עיבוד נוסף, כגון SPE לטיהור מטריצה וריכוז 29,47,48, בהתאם לבחירת טכניקת הנגזרת ו/או ניתוח אנליטי (למשל, LC-MS/MS בפאזה הפוכה לעומת כרומטוגרפיה נוזלית של אינטראקציה הידרופילית [HILIC] LC-MS/MS 37 ). שחזור הכדור הסופי ב-20 mM HCl בפרוטוקול זה מתאים לגזירה באמצעות ריאגנטים PCF48באמצעות ערכת הידרוליזה של חומצת אמינו זמינה מסחרית39 (ראו טבלת חומרים). הן AQC והן PCF יפיקו את כל חומצות האמינו, החלבון והלא-חלבונים שמקורם בדגימה, והסלקטיביות של האנליטים מתקבלת באמצעות שימוש ב-LC-MS/MS והשילוב של התאמת זמן שמירה ובחירה זהירה של ה-MRMs38 הקוונטיפייר והמאשר. 
פרוטוקולי ההידרוליזה הנוכחיים אינם מותאמים לשחרור BMAA, 2,4-DAB ו-AEG אלא ל-22 חומצות אמינו חלבוניות המבוססות על שיטות קיימות להידרוליזה של חלבונים 32, שבהן דגירה למשך יותר מ-18 שעות גורמת לפירוק ושינוי של חומצות אמינו מסוימות, המשפיעה על ניתוח LC-MS/MS, ולכן על הריכוזים המתקבלים32. Beach et al.49 חקרו הידרוליזה לאורך זמן (0.5-120 שעות) כדי לייעל הידרוליזה לניתוח BMAA וחומצות אמינו פרוטאינוגניות. הם מצאו שלמרות שהיה שחרור מהיר מוקדם של BMAA במהלך 0.5 השעות הראשונות של ההידרוליזה, רמות ה-BMAA המשיכו לעלות ככל שזמן ההידרוליזה עלה, ללא השפלה, גם לאחר 5 ימים49. ישנן גם השקפות ושאלות שונות לגבי האופי האמיתי של BMAA קשור והאיזומרים שלו, כאשר כמה מחקרים מציעים כי במקום BMAA קשר 50,51 או שילוב שגוי לתוך חלבונים14, BMAA-חלבון האגודה היא שטחית52. עם זאת, הקונצנזוס הנוכחי בניתוח של BMAA "כרוך" דורש את שלב ההידרוליזה המאומת והמקובל שמפרק פפטידים/חלבונים כדי לשחרר חומצות אמינו, ולכן, BMAA והאיזומרים שלו.
שיעורי ההתאוששות של 20 חומצות אמינו חלבוניות נקבעו במחקר של Sedgwick et al.42 באמצעות מיצוי TCA, וכתוצאה מכך כ-100% התאוששות. במקרה של BMAA והאיזומרים שלו ממטריצות אצות, מחקרים שהשוו את היעילות של מיצוי BMAA באמצעות ממיסים מיצוי שונים מצאו כי 10% TCA הוא היעיל ביותר עבור BMAA27 בחינם. שיעורי ההתאוששות של BMAA הקשור לחלבון שחולצו באמצעות הידרוליזה בפאזה נוזלית נקבעו במחקרים של Glover et al.25 ועל ידי Faassen et al.53, שם הדיוק נקבע על ידי שיטות התאוששות מחודדות, עם שיעור התאוששות BMAA ממוצע של 108.6% ו-70%, בהתאמה. Faassen et al. תיארו נהלים לניסויים בהתאוששות ספייק והדגימו כיצד ההתאוששות שונה בהתאם לשלב תהליך החילוץ של הספייקנעשה 53. Faassen et al. קבעו בנוסף את היעילות של פרוטוקול אדי החומצה שהוצג כאן, עם שיעורי התאוששות של 83.6% עבור איזומרים BMAA שעלו לפני מיצוי ו-68.6% עבור אלה שזינקו לפני הידרוליזה24. שחזורים, שיטות מיצוי וניתוחים אלה אומתו עוד יותר על ידי Banack 26, עם שיעורי התאוששות של 94%-106% עבור BMAA במטריצה ציאנובקטריאלית וסטיית תקן יחסית (%RSD) בין 5.6%ל-20%, העומדים בקריטריונים של ה-FDA לדיוק54. מומלץ שכל מעבדה תקבע תחילה את שיעורי ההתאוששות והדיוק שלה לפני שתשתמש בפרוטוקול זה באמצעות ניסויי התאוששות ספייק. ניתן לעקוב אחר שיטות השחזור המוצגות ב- Faassen et al.53 ו- Glover et al.25 כמדריך.
ניתן להשתמש בצורות חלופיות של טכניקות הידרוליזה במקום הידרוליזה בתנור לילה למיצוי מהיר יותר של האנליט הקשור לחלבון. לדוגמה, מחלץ מיקרוגל יכול להפחית באופן משמעותי את זמן ההידרוליזה מ-24 שעות ל-10 דקות55 בלבד. הידרוליזה במיקרוגל לחומצות אמינו משתמשת באותם עקרונות כמו השיטה התרמית הקונבנציונלית, באמצעות תא כפפות להכנת והרכבת כלי המיקרוגל בסביבה נטולת חמצן והוספת 6 M HCl. לאחר אטום לאוויר, כלי המכיל את הדגימה עובר קרינת מיקרוגל. הידרוליזה במיקרוגל שימשה לחילוץ חומצות אמינו ממטריצות דגימה שונות56,57,58; עם זאת, הידרוליזה של מיקרוגל טרם פותחה ואומתה לניתוח BMAA.
לסיכום, 10% משקעי חלבון TCA מימיים הם השיטה האופטימלית לחילוץ חומצות אמינו חופשיות שאינן חלבוניות ממטריצות ציאנובקטריאליות27, והידרוליזה תרמית מספקת מיצוי אמין וניתן לשחזור של החלק הקשור לחלבון. פרוטוקול זה לחילוץ NPAA BMAA והאיזומרים שלו מציאנובקטריה מאומת ומקובל. כיוונים עתידיים לייעול נוסף של מיצוי BMAA יתמקדו בשלב ההידרוליזה, המתבצע על פי המפרטים של 22 חומצות האמינו החלבון. עם זאת, פרוטוקול החילוץ המוצג כאן עדיין צריך להיחשב יעיל ואפקטיבי לניתוח BMAA והאיזומרים שלו באמצעות LC-MS/MS.

חומצות אמינו הן תרכובות כימיות המכילות לפחות אמין אחד וקבוצה תפקודית קרבוקסילית. חומצות אמינו מסוימות מכילות גם קבוצת imino, קבוצת חומצה פונקציונלית שאינה קרבוקסילית; לחומצות אמינו אחרות יש קבוצות אמין שאינן מחוברות לקבוצת α-פחמן1. ישנן מעל 500 חומצות אמינו2, 22 מהן ידועות כחומצות אמינו חלבוניות המשמשות לקידוד גנטי בסינתזת חלבונים ריבוזומליים3. 22 חומצות אמינו אלה ניתנות לחלוקה נוספת לחיוניות ולא חיוניות. חומצות אמינו חיוניות נחוצות לאורגניזם כדי לתפקד כראוי וניתן לרכוש אותן רק על ידי מקורות חיצוניים. חומצות אמינו לא חיוניות ניתן לסנתז בתוך האורגניזם. הסיווג של 22 חומצות האמינו לחיוניות/לא חיוניות הוא ייחודי למינים בודדים. כל חומצות האמינו האחרות הן חומצות אמינו שאינן חלבוניות (NPAA) שאינן מקודדות לסינתזת חלבונים. חומצות אמינו, בין אם הן חלבוניות או שאינן חלבון, יכולות גם הן למלא תפקיד איתות בתוך אורגניזם ולפעול כמתווכות מטבוליות4. בשל תפקידיהם החשובים והמשתנים, רמות חומצות האמינו יכולות לספק תובנה לגבי מצב האורגניזם, תפקודו, מסלולי חילוף החומרים וכו'. ישנם שני מנגנונים עיקריים שבאמצעותם ניתן לשלב חומצות אמינו בשרשרת פוליפפטידים: סינתזת חלבונים ריבוזומלית, המנצלת את 22 חומצות האמינו בקידוד, וסינתזה פפטידית לא ריבוזומלית, אשר, לצד חומצות אמינו חלבוניות, מאפשרת שימוש בחלק מה- NPAAs בסינתזה. NPAAs מסוימים יכולים לחקות חומצות אמינו חלבוניות, מה שעלול להוביל לשילוב שגוי שלהם בפפטידים ובחלבונים. המיסאינקורפורציה גורמת לקיפול שגוי של חלבונים, אשר, בתורו, יש השפעות מזיקות5, כגון misincorporation של NPAA L-3,4 dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) במקום טירוזין, השפעה שלילית על תפקוד התאים ובריאות 6,7. מקור נוסף של NPAAs משולבים הוא באמצעות שינוי לאחר תרגום (PTM) של שאריות חומצות אמינו. שאריות חומצות אמינו משתנות מסיבות שונות, כולל שינויים בקונפורמציה של פפטידים או חלבונים, יציבות ופונקציונליות. לאחר הידרוליזה של חלבון או פפטידים המכילים PTM, שאריות חומצות אמינו מותאמות אלה משתחררות לצורת NPAAהחופשית שלהם 8,9.
NPAA β-מתילאמינו-L-אלנין (BMAA) המיוצר על ידי ציאנובקטריה, דיאטום ודינופלגלטים10 הוא חשד לנוירוטוקסין המעורב כגורם תורם למחלות נוירודגנרטיביות שונות כגון טרשת אמיוטרופית צידית / קומפלקס פרקינסון-דמנציה (ALS-PDC)11,12, טרשת אמיוטרופית צידית ומחלת אלצהיימר 13 . ההשערה היא ש-BMAA משולב בטעות בשרשרת החלבונים הפוליפפטידים במקום L-serine14 ו/או חומצות אמינו חלבוניות אחרות. שילוב שגוי של BMAA יכול להוביל לקיפול שגוי של חלבונים, וכתוצאה מכך לתצהיר של אגרגטים של חלבונים בנוירונים14. בעשור האחרון, העניין ב- BMAA גדל באופן משמעותי. מגוון רחב של מינים ציאנובקטריאליים מסביבות מים מתוקים, ימיים ומליחים התגלו כמייצרים BMAA15, מה שמוביל לתפוצתם הנרחבת למערכות אקולוגיות שונות16,17. בנוסף, הוכח כי BMAA מתמזג דרך שרשרת המזון אל מארג המזון האנושי18,19. בשל ההשפעות הבריאותיות הפוטנציאליות, חוסר ההבנה וחוסר ההתאמה של רעילות BMAA, חובה להמשיך במחקר נוסף עד שהרעילות של BMAA תובן בסופו של דבר או ש-BMAA ייחשב בטוח20,21.
ניתן לחלק את ניתוח חומצות האמינו בדגימות ביולוגיות לארבעה שלבים עיקריים: הכנת הדגימה, גזירת חומצות אמינו, הפרדה וזיהוי, וזיהוי וכימות. ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה-טנדם נוזלית (LC-MS/MS) היא שיטת הניתוח המועדפת מכיוון שהיא מספקת הפרדה וניתוח ממוקדים וניתנים לשחזור של חומצות אמינו.
טכניקות הכנת דגימות לניתוח דגימות ציאנובקטריאליות ואצות אחרות כוללות בעיקר שיטת מיצוי של חומצות אמינו בצורתן החופשית והקשורה לחלבון. במהלך השנים, שיטות המיצוי נשארו עקביות יחסית עם אלמנטים נפוצים, כולל השממת הדגימה כדי להפריד את חומצות האמינו החופשיות מצורתן הכבולה, ולאחר מכן משקעי חלבון ושחרור חומצות אמינו קשורות באמצעות הידרוליזה עם חומצה הידרוכלורית (HCl) בטמפרטורות גבוהות22 . צורת מיצוי זו עברה אופטימיזציה לחומצות אמינו חלבוניות ומשמשת ל-NPAA. עם זאת, הזיהוי והכימות של BMAA והאיזומרים שלו (איור 1), אמינואתילגליצין (AEG) וחומצה דיאמינו-בוטירית 2,4-(2,4-DAB), באותו מין של ציאנובקטריה, הראו תוצאות לא עקביות בספרות, כאשר הסבר אפשרי טמון בהבדלים בתנאי הגידול ו/או בזן האצות המייצרות כמויות משתנות או ללא צריכה של BMAA23 . נטען כי הסבר סביר יותר לחוסר העקביות בזיהוי וכימות של BMAA והאיזומרים שלו נובע מפרוטוקולים ניסיוניים לא מוערכים, שימוש במגוון רחב של טכניקות אנליטיות, ופירוט ניסיוני לא מספיק בשיטות המדווחות16,24 המוביל לנתונים בין-מעבדתיים בלתי ניתנים לשחזור. עם זאת, Glover et al.25 ו- Banack 26 פיתחו לאחרונה ותקפו טכניקה אנליטית לזיהוי וכימות של BMAA והאיזומרים שלה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UPLC)-MS/MS בהתאם לאיגוד הבינלאומי של כימאים אנליטיים (AOAC), הפרמקופיאה האמריקאית והנחיות ה- FDA הדרושות לאימות מעבדה אחת.
ניסויי תיקוף אלה התמקדו בהפרדה ובזיהוי של BMAA והאיזומרים שלו ולא התייחסו לחוסר העקביות בפרוטוקולים להכנת דגימות. Lage et al.27 השוו את הביצועים של שלוש שיטות מיצוי נפוצות לכימות BMAA והאיזומרים שלו בדגימות ציאנובקטריאליות באמצעות LC-MS/MS: מיצוי פאזה מוצקה (SPE) של חומצות אמינו חופשיות28,29; שיטת מיצוי חלבונים הכוללת מיצוי מתנול ומשקעי אצטון30; ושיטת המיצוי הנפוצה ביותר עבור BMAA, משקעי חלבון עם חומצה טריכלורואצטית (TCA)31. הם הגיעו למסקנה כי משקעי החלבון TCA הם הפרוטוקול האופטימלי, והניב ריכוזי BMAA גבוהים יותר בדגימות הבדיקה בהשוואה לשיטות המיצוי האחרות. המחקר שלהם אימת מיצוי TCA עם נגזרת של BMAA באמצעות 6-אמינוקווינוליל-N-הידרוקסיסוקינימידיל קרבמט (AQC) במטריצת ציאנובקטריה, וסיפק מדריך מבוסס להשגת נתוני BMAA אמינים וניתנים לשחזור. מיצוי חומצות אמינו TCA הוא טכניקת הכנת דגימות מקובלת ונפוצה שניתן ליישם גם על מטריצות אחרות. עם זאת, היציבות של חומצת האמינו במהלך הידרוליזה צריך להיחשב כדי למנוע השפלה או חמצון, אשר ניתן להתגבר עם השימוש של משנים כימיים וחומרים מחזרים32. מיצוי TCA משמש באופן שגרתי ונלמד לתלמידי מחקר חדשים, ולמרות שהפרוטוקול מדווח בהרחבה, סיוע חזותי ביישום שיטה זו הוא משאב יקר ערך, המבטיח ביצוע תקין ועקבי.
כרומטוגרפיה בפאזה הפוכה משמשת בדרך כלל להפרדת חומצות אמינו, הדורשת שלב נגזרת לפני ניתוחים. הנגזרת של חומצות אמינו כגון BMAA מאפשרת שימור כרומטוגרפי ויכולה להגדיל את הרזולוציה בין איזומרים. זה גם מגדיל את המסה המולקולרית ומשפר את היינון בספקטרומטר המסה. מספר ריאגנטים נגזרים שימשו לניתוח חומצות אמינו באמצעות LC-MS/MS, כולל פרופיל כלורופורמט (PCF)33, 6-אמינוקווינוליל-N-הידרוסיסוקסינימידיל קרבמט (AQC)27, 9-פלואורנילמתיל כלורופורמט (FMOC)34, ודנסיל כלוריד (DC)35. עם זאת, הטכניקות המאומתות היחידות לניתוח BMAA השתמשו ב- PCF 36 או ב- AQC24,26,37 כמגיב הנגזר שלהם.
היקף פרוטוקול זה מתמקד במיצוי TCA של NPAAs ממטריצות ציאנובקטריאליות. זוהי שיטה עתירת עבודה שנעשה בה שימוש שגרתי ונלמדת במעבדות מחקר אקדמיות ותעשייתיות המבוססות על כתבי יד שעשויים להיות קצרים בפרטים; לכן, פרוטוקול זה מספק פרטים על ההליך והטכניקות הכרוכות בהכנת דגימות לניתוח של BMAA חופשי ומאוגד כחומצת אמינו מודל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL glass shell vials</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>REST-24663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.3% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>BR780546-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mM HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z740441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 M HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.11727</td>
			<td>Dilute 70:1 Ethanol:water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C Freezer</td>
			<td>Martin CHRIST</td>
			<td>102142</td>
			<td>Alpha 2-4 Ldplus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>34967-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale Balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal evaporator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13442549</td>
			<td>DNA120-115 SpeedVac Concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP022620100-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D5-2,4-DAB standard</td>
			<td>CDN Isotopes</td>
			<td>D-7568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>CEO-8492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T2318-500EA</td>
			<td>Greiner centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS8161-100EA</td>
			<td>Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass engraver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrolysis vial &#38; Lid</td>
			<td>Eldex Laboratories/Waters</td>
			<td>WAT007568 &#38; WAT007569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice and container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper wipe</td>
			<td>Kimwipes/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.2 M&#937;.cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen tap with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000055-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - noise cancelling headphones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - oven gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td>QSONICA Sonicators</td>
			<td>Q125 Sonicator</td>
			<td>Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample transfer spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis

חומצות אמינו שאינן חלבוניות (NPAAs) הן קבוצה גדולה של חומצות אמינו (AAs) שאינן מקודדות גנטית לתרגום לחלבונים. הניתוח של NPAAs יכול לספק מידע חיוני על ספיגה ו/או תפקוד של תאים, מסלולים מטבוליים ורעילות פוטנציאלית. β-מתילאמינו-L-אלנין (BMAA) הוא NPAA נוירוטוקסי המיוצר על ידי מיני אצות שונים ונקשר לסיכון מוגבר למחלות נוירודגנרטיביות, מה שהוביל להתעניינות מחקרית משמעותית. ישנן דרכים רבות לחלץ AAs לניתוח, כאשר ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה-טנדם נוזלית היא הנפוצה ביותר, ודורשת משקעי חלבון ואחריה הידרוליזה חומצית של גלולת החלבון. מחקרים על נוכחות של BMAA במיני אצות מספקים תוצאות סותרות, כאשר השימוש בהכנה/מיצוי וניתוח של דגימות לא מוערכים הוא הגורם העיקרי. כמו רוב ה-NPAA, משקעי חלבון ב-10% TCA מימי והידרוליזה עם HCl מתפוצץ הם צורת המיצוי המתאימה ביותר ל-BMAA ולאיזומרים שלו אמינואתיל-גליצין (AEG) ו-2,4-חומצה דיאמינובוטירית (2,4-DAB). הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים בשיטת מיצוי NPAA מאומתת המשמשת בדרך כלל במעבדות מחקר והוראה.

המחשה של פרוטוקול החילוץ מופיעה באיור 2 כמדריך עזר מסוכם. התוצאות שהתקבלו על ידי Violi et al.38 נבחרו כדי לייצג תוצאה חיובית מפרוטוקול מיצוי זה לניתוח איזומרים של BMAA מציאנובקטריה. 19 מינים בודדים של ציאנובקטריה גודלו בתרבית מ-11 אתרי מים מתוקים במזרח אוסטרליה. באמצעות אותו פרוטוקול, האיזומרים של BMAA חולצו לשברים חופשיים ולחלבונים, נגזרו באמצעות PCF, ונותחו באמצעות LC-MS/MS. 17 מהאיזולטים הציאנובקטריאליים היו חיוביים ל-BMAA, וכל 19 הכילו את האיזומר 2,4-DAB. תוצאה חיובית מאושרת על ידי שימוש בשיטת LC-MS/MS מאומתת וצפייה בלפחות שלושה מעברים לניטור תגובות מרובות (MRM), אחד כיון קוונטיפייר ושניים כיונים מזהים בזמן השמירה הצפוי. כרומטוגרמה מייצגת של MRM של תקן המכיל BMAA והאיזומרים שלו, המסומנת על-ידי הקווים המקודדים בצבע, מוצגת באיור 3. הנוכחות והריכוז של BMAA ואיזומרים בכל 19 הדגימות, שנחתכו כדי להראות את ריכוז ה-BMAA והאיזומרים בשברים החופשיים והמאוגדים, מסוכמים בטבלה 1. זיהוי חיובי של כל שלושת האיזומרים נצפה בחלק החופשי של מיני ה-Merismopedia שנאספו מאגם לידל (NSW, אוסטרליה), שם השבר החופשי הכיל ריכוז BMAA של 68.38 מיקרוגרם/גרם משקל יבש (DW) ± 2.25 מיקרוגרם/גרם DW, 2,4-DAB עם ריכוז של 1,223.98 מיקרוגרם/גרם DW ± 20.7 מיקרוגרם/גרם DW, ו-AEG בריכוז של 125.27 מיקרוגרם/גרם DW ± 4.19 מיקרוגרם/גרם DW. ה-MRMs הכרומטוגרפיים מוצגים באיור 4. כדי להמחיש תוצאה שלילית עבור BMAA והאיזומרים שלו בדגימה, החלק המאוגד של המין Microcystis flos-aquae שנאסף מ-Walka Water Works (NSW, אוסטרליה) מוצג באופן כרומטוגרפי באיור 5. בעוד שהשבר המאוגד לא הכיל BMAA, 2,4-DAB ו/או AEG, השבר החופשי שלו הכיל את כל שלושת האיזומרים, עם ריכוזים של 79.86 מיקרוגרם/גרם DW ± 1.59 מיקרוגרם/גרם DW, 1,156.15 מיקרוגרם/גרם DW ± 8.46 מיקרוגרם/גרם DW ו-433.83 מיקרוגרם/גרם DW ± 8.92 מיקרוגרם/גרם DW, בהתאמה.
לפיכך, באמצעות שימוש בפרוטוקול זה, Violi et al.38 אישרו את נוכחותם של איזומרים של BMAA בציאנובקטריה של מים מתוקים במזרח אוסטרליה וקבעו לאילו ציאנובקטריה יש יכולות ייצור רעלנים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig01.jpg"> איור 1: המבנה הכימי של BMAA והאיזומרים שלו 2,4-DAB ו-AEG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig02.jpg"> איור 2: דיאגרמת ייחוס מסוכמת של פרוטוקול החילוץ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig03.jpg"> איור 3: כרומטוגרמה LC-MS/MS של תקן כיול המכיל D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA ו-AEG לזיהוי איזומרים על בסיס שמירה, המצוין על-ידי הפסגות המודגשות. מפתח: D5-2,4-DAB 338.01 m/z > 278.10 m/z ב-6.4 דקות (אדום), 2,4-DAB 333.01 m/z > 273.10 m/z ב-6.4 דקות (ירוק), AEG 333.01 m/z > 88.00 m/z ב-7.4 דקות (כתום), ו-BMAA 333.01 m/z > 187.10 m/z ב-7.8 דקות (כחול). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig04.jpg"> איור 4: כרומטוגרמה LC-MS/MS לזיהוי D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA ו-AEG במיני מריזמופדיה שנאספו מאגם לידל (NSW, אוסטרליה), המסומנים על-ידי הפסגות המודגשות. מפתח: D5-2,4-DAB 338.01 m/z > 278.10 m/z ב-6.4 דקות (אדום), 2,4-DAB 333.01 m/z > 273.10 m/z ב-6.4 דקות (ירוק), AEG 333.01 m/z > 88.00 m/z ב-7.4 דקות (כתום), ו-BMAA 333.01 m/z > 187.10 m/z ב-7.8 דקות (כחול). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig05.jpg"> איור 5: כרומטוגרמה LC-MS/MS של בקרה שלילית עבור 2,4-DAB, BMAA ו-AEG בחלק מאוגד של מיני Microcystis flos-aquae שנאספו מ-Walka Water Works (NSW, אוסטרליה). מפתח: D5-2,4-DAB 338.01 m/z > 278.10 m/z ב-6.4 דקות (אדום - שיא מודגש), 2,4-DAB 333.01 m/z > 273.10 m/z ב-6.4 דקות (ירוק), AEG 333.01 m/z > 88.00 m/z ב-7.4 דקות (כתום), ו-BMAA 333.01 m/z > 187.10 m/z ב-7.8 דקות (כחול). הקווים המקווקווים מייצגים את זמני השמירה של 2,4-DAB חסרים, AEG ו-BMAA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
טבלה 1: ריכוזי BMAA, AEG ו-2,4-DAB במבודדים ציאנובקטריאליים. ריכוזים ± שגיאת תקן של הממוצע (n = 3). ND מציין שלא זוהה. הריכוז הגבוה ביותר של כל איזומר שזוהה מודגש בירוק. הטבלה היא גרסה שונה של Violi et al.38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779_Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיצוי של חומצות אמינו שאינן חלבוניות ממטריצות ביולוגיות באמצעות משקעי חלבון חומצה טריכלורואצטית (TCA) והידרוליזה חומצית לפני ניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם.

מיצוי חומצות אמינו שאינן חלבוניות מציאנובקטריה לכרומטוגרפיה נוזלית-ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

פרוטוקול זה יסייע למשתמשים וילמד את התלמידים את השלבים הנכונים בחילוץ BMA, AEG ו- 2, 4-DAB. ובכך למזער את הסיכויים לטעות ולהפיק תוצאות עקביות. שיטה זו היא שיטה נפוצה ומאומתת למיצוי BMA והאיזומרים שלו, AEG ו-2, 4-DAB במטריצת חיידקי סאונה.ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקדם מחקר בנוגע לרעילות של BMAs ולספק הבנה טובה יותר לגבי BMA וההשפעות הבריאותיות הקשורות אליו. התחל על ידי centrifusion דגימת ציאנובקטריה ב 3, 500 גרם במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. והשלכת הסופר-נטנט לפסולת ביולוגית.מכסים את צינור הצנטריפוגה המכיל את הכדור בסרט איטום וחודרים כמה חורים בסרט באמצעות פינצב אף ארוך וחד. לאחר מכן לאחסן את הצינור זקוף במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות, הכניסו את השפופרת זקופה למיכל זכוכית של מייבש כביסה והניחו את המיכל בתוך מקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות לקירור.מוציאים את מיכל הזכוכית מהמקפיא ומחברים את מכסה הגומי. ודאו שהידית בשקע שסתום הגומי של מייבש ההקפאה מכוונת כלפי מעלה ומאווררת לאטמוספרה. חבר את מיכל הזכוכית בחוזקה.סובבו באיטיות את הידית של שקע שסתום הגומי כדי לכוון אותה למצב מטה כדי לחשוף את הצנצנת לוואקום. ולאפשר עד 24 שעות של ייבוש בהקפאה כדי סובלימציה של כל הנוזלים. בסיום, שקלו 15 עד 50 מיליגרם של כדורי דגימה קפואים לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.שימוש באיזון אנליטי. לדגימה, הוסף 300 עד 600 מיקרוליטרים של 10% חומצה טריכלורואצטית מימית או TCA. מניחים את צינורות הדגימה במיכל מלא בקרח כתוש.נגבו את הבדיקה של סוניקטור עם מגבון נייר ללא מוך שרוסס ב-70% אתנול לפני טבילה מלאה של קצה הבדיקה לתוך הדגימה ולחיצה על התחלה. לאחר שתסיים, הנח את הדגימה המכילה את צינור הצנטריפוגה על קרח למשך דקה אחת. וחזור על תהליך הסוניקציה כדי להבטיח תזה של תאים.לאחר קירור הדגימה בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. צנטריפוגה ב 3, 500 גרם במשך 15 דקות בשמונה מעלות צלזיוס. לאחר מכן באמצעות מיקרו פיפטה, להעביר את supernatant לצינור שני מיליליטר שכותרתו שבר חופשי.הוסף 400 מיקרוליטרים של 10% TCA מימי לתוך גלולת הדגימה, ופרק את הכדור על ידי תסיסה מערבולת או עם קצה מיקרו פיפטה. צנטריפוגה ולהעביר את supernatant לתוך אותו צינור שני מיליליטר שברים חינם. חזור על שלב זה בפעם השלישית באמצעות 10% אצטון TCA.מניחים את צינור השבר החופשי כשהמכסה פתוח לתוך מאייד צנטריפוגלי עד שכל הנוזל הנדיף מוסר. לאחר שהדגימה נקייה מנוזלים נדיפים, מכסים את הצינור היטב עם סרט התקרה וחודרים את הסרט בכמה חורים באמצעות פינצב אף ארוך וחד. לאחר ייבוש בהקפאה שהוכח קודם לכן, לשחזר את הדגימה עם 200 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית 20 מילימולר ולהניח אותו במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס.הוסף 400 מיקרוליטרים של 100% אצטון על כדור הדגימה באמצעות מיקרו פיפטה ופרק את הכדור באמצעות תסיסה מערבולת או קצה מיקרו פיפטה. מעבירים באופן כמותי את הכדור השטוף והמוחזר לבקבוקון קליפת הזכוכית המתאים. באמצעות מיקרו פיפטה של מיליליטר אחד.הוסיפו עוד 400 מיקרוליטרים של אצטון לצינור הדגימה כדי לסייע בהעברת הכדור הנותר. צנטריפוגה ודקירה את נוזל העל לפסולת ביולוגית לפני ייבוש הכדור במאייד צנטריפוגלי עד להוצאת הנוזל והתייבשותו. כדי להכין את קובץ הידרוליזה ואקום להוסיף מיליליטר אחד של שש חומצה הידרוכלורית טוחנת לתחתית קובץ הידרוליזה.הכנס בזהירות את בקבוקוני המעטפת המסומנים עם דגימות מיובשות לקובץ ההידרוליזה באמצעות פינצטה המבטיחה מיקום יציב זקוף. חברו את המכסה לקובץ ההידרוליזה ולחצו על הידית האדומה של המכסה כדי לסגור את השסתום. לאחר הפעלת משאבת הוואקום, חבר את שפופרת הוואקום לראש מכסה קובץ ההידרוליזה ולחץ על הידית הירוקה במכסה כדי לפתוח את השסתום.לאחר מכן, אפשרו למשאבת הוואקום להוציא את האוויר מהבקבוקון למשך דקה אחת. לאחר מכן סגור את הבקבוקון על ידי לחיצה על הידית האדומה על מכסה בקבוקון הידרוליזה. כבה את משאבת הוואקום והסר את שפופרת הוואקום.חברו צינור גומי לברז גז החנקן על ספסל המעבדה. ופתחו מעט את הברז. מניחים את האגודל בקצה הצינור, אוטמים אותו וסופרים עד שהגז מתחיל לברוח כשהלחץ מצטבר.לאחר מכן, חבר את הקצה השני של צינור הגומי לראש מכסה בקבוקון הידרוליזה. ומיד לדחוף את הידית הירוקה של המכסה. ספרו את הזמן שלוקח לגז לברוח.לחץ במהירות את הידית האדומה על המכסה והסר את צינור הגומי. חזור על כל תהליך הטיפול בוואקום פעמיים. הקפדה על בקבוקון ההידרוליזה מזכוכית נקי מאוויר ומלא בגז חנקן.הכניסו את בקבוקון ההידרוליזה לתנור שחומם מראש בטמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות. בעזרת כפפות תנור, מוציאים את בקבוקון ההידרוליזה מהתנור. הניחו לבקבוקון להתקרר בתוך מכסה האדים למשך 10 דקות לפני שתדחפו את הידית הירוקה כשפניכם הרחק ממנה כדי לשחרר לחץ וגז.שחזרו את כדורי הדגימה שעברו הידרוליזה עם 200 מיקרוליטרים של 20 חומצה הידרוכלורית טוחנת לתוך בקבוקון הקליפה והניחו מחדש את הכדור. צנטריפוגה של בקבוקוני הקונכייה המכילים את כדורי הדגימה המשוחזרים במשך שתי דקות ב 5, 300 G ו 25 מעלות צלזיוס. העבר את דגימות השבר החופשי ושבר החלבון המשוחזרים לשני צינורות מסנן מיליליטר המכילים מסנני קרום נקבוביות של 0.2 מיקרון ומסומנים כשבר חופשי ושבר חלבון.מניחים את הצינורות לצנטריפוגה למשך 30 דקות ב 5, 000 G ו 25 מעלות צלזיוס. כרומטוגרמה לניטור תגובות מרובות של תקן המכיל בטא-מתילאמינו-L-אלנין או BMAA והאיזומרים שלו המסומנים על ידי הקווים המקודדים בצבע מוצגת כאן. זיהוי חיובי של כל שלושת האיזומרים, BMAA, DAB ו-AEG נצפה בחלק החופשי של מיני ה-Merismopedia שנאספו מאגם לידל.ואילו החלק המאוגד של המין Microcystis flos-aquae שנאסף מ-Waka Waterworks המחיש תוצאה שלילית עבור BMAA והאיזומרים שלו. יש להעביר את הכדור המחודש באופן כמותי לתוך בקבוקון המעטפת המתאים כדי לאפשר נקודת נורמליזציה מדויקת המבוססת על מסת ציאנובקטריה. מומלץ למטופלים ולבדיקות נאותות בעת ביצוע שלב זה.בעקבות הליך זה. השברים המופקים יצטרכו לעבור שלב דה-ויטאליזציה כדי לאפשר פאזה הפוכה. כרומטוגרפיה נוזלית, ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם.היישום של טכניקה זו מרחיב תחומים מדעיים שונים. כולל מדעי הסביבה באמצעות ניתוח של cynotoxins בדגימות סביבתיות. ותחומים כמו טוקסיקולוגיה וביוכימיה באמצעות חקירת תיאוריית ה-Misincorporation של BMA.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

באמצעות אלקטרופורזה נימים לכמת חומצות אורגניות מרקמות צמח: מקרה מבחן בחינה<em&gt; קפה ערביקה</em&gt; זרעים

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

וזמינותו HS-MRM עבור כימות של התא המארח חלבונים בחלבון ביופרמצבטיקה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית יון ניידות QTOF ספקטרומטר מסה

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

שיטה פשוטה עבור Glucosinolate הפקה וניתוח עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

Fizzy Extraction of Volatile Organic Compounds Combined with Atmospheric Pressure Chemical Ionization Quadrupole Mass Spectrometry

פיצי הפקה של תרכובות אורגניות נדיפות בשילוב עם לחץ אטמוספרי כימי יוניזציה Quadropole מסה ספקטרומטריית

Chemical analysis of volatile and semivolatile compounds dissolved in liquid samples can be challenging. The dissolved components need to be brought to ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

אנליזת נשימה בזמן אמת באמצעות Nanoelectrospray משני יינון מצמידים ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

סינתזה וניתוח ספקטרומטר מסה של Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

חילופי מימן/דיטריום מבוססי נימי אלקטרופורזה לאפיון קונפורמציה של חלבונים עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Curation of Computational Chemical Libraries Demonstrated with Alpha-Amino Acids

אוצרות של ספריות כימיות חישוביות שהוכחו באמצעות חומצות אלפא-אמינו

Exhaustive generation of molecular structures has numerous chemical and biochemical applications such as drug design, molecular database construction, ...