Name: extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-12-09T12:40:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

डी.पी.बी., के.जे.आर., और एस.एम.एम. को द इयान पॉटर फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया जाता है, और जे.पी.वी. एक ऑस्ट्रेलियाई सरकारी अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम, वजीफा के प्राप्तकर्ता हैं।

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL glass shell vials</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>REST-24663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.3% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>BR780546-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mM HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z740441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 M HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.11727</td>
			<td>Dilute 70:1 Ethanol:water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C Freezer</td>
			<td>Martin CHRIST</td>
			<td>102142</td>
			<td>Alpha 2-4 Ldplus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>34967-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale Balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal evaporator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13442549</td>
			<td>DNA120-115 SpeedVac Concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP022620100-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D5-2,4-DAB standard</td>
			<td>CDN Isotopes</td>
			<td>D-7568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>CEO-8492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T2318-500EA</td>
			<td>Greiner centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS8161-100EA</td>
			<td>Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass engraver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrolysis vial &#38; Lid</td>
			<td>Eldex Laboratories/Waters</td>
			<td>WAT007568 &#38; WAT007569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice and container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper wipe</td>
			<td>Kimwipes/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.2 M&#937;.cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen tap with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000055-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - noise cancelling headphones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - oven gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td>QSONICA Sonicators</td>
			<td>Q125 Sonicator</td>
			<td>Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample transfer spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis

गैर-प्रोटीन अमीनो एसिड (एनपीएए) अमीनो एसिड (एए) का एक बड़ा वर्ग है जो प्रोटीन में अनुवाद के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड नहीं हैं। एनपीएए का विश्लेषण सेलुलर अपटेक और / या फ़ंक्शन, चयापचय मार्गों और संभावित विषाक्तता के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है। β-मिथाइलएमिनो-एल-एलानिन (बीएमएए) विभिन्न शैवाल प्रजातियों द्वारा निर्मित एक न्यूरोटॉक्सिक एनपीएए है और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए बढ़ते जोखिम से जुड़ा हुआ है, जिसने महत्वपूर्ण शोध रुचि पैदा की है। विश्लेषण के लिए एए निकालने के कई तरीके हैं, तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री सबसे आम है, प्रोटीन पेलेट के एसिड हाइड्रोलिसिस के बाद प्रोटीन वर्षा की आवश्यकता होती है। अल्गल प्रजातियों में बीएमएए की उपस्थिति पर अध्ययन विरोधाभासी परिणाम प्रदान करते हैं, जिसमें अमान्य नमूना तैयारी / निष्कर्षण और विश्लेषण का उपयोग एक प्राथमिक कारण है। अधिकांश एनपीएए की तरह, 10% जलीय टीसीए में प्रोटीन वर्षा और फ्यूमिंग एचसीएल के साथ हाइड्रोलिसिस बीएमएए और इसके आइसोमर्स एमिनोइथाइलग्लाइसिन (एईजी) और 2,4-डायमिनोब्यूट्रिक एसिड (2,4-डीएबी) के लिए निष्कर्षण का सबसे उपयुक्त रूप है। वर्तमान प्रोटोकॉल आमतौर पर अनुसंधान और शिक्षण प्रयोगशालाओं में उपयोग की जाने वाली एक मान्य एनपीएए निष्कर्षण विधि में चरणों का वर्णन करता है।

निष्कर्षण प्रोटोकॉल का एक चित्रण चित्र 2 में एक सारांशित संदर्भ गाइड के रूप में प्रदान किया गया है। वायोली एट अल .38 द्वारा प्राप्त परिणामों को साइनोबैक्टीरिया से बीएमएए आइसोमर्स के विश्लेषण के लिए इस निष्कर्षण प्रोटोकॉल से सकारात्मक परिणाम का प्रतिनिधित्व करने के लिए चुना गया था। साइनोबैक्टीरिया की उन्नीस एकल प्रजातियों को 11 पूर्वी ऑस्ट्रेलियाई मीठे पानी के स्थलों से सुसंस्कृत किया गया था। उसी प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, बीएमएए आइसोमर्स को मुक्त और प्रोटीन अंशों में निकाला गया, पीसीएफ के साथ व्युत्पन्न किया गया, और एलसी-एमएस / एमएस का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। एमएस विधि का उपयोग करके और कम से कम तीन एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी (एमआरएम) संक्रमणों का अवलोकन करके एक सकारात्मक परिणाम की पुष्टि की जाती है, एक क्वांटिफायर आयन के रूप में और दो अपेक्षित अवधारण समय पर क्वालीफायर आयनों के रूप में। बीएमएए और उसके आइसोमर्स युक्त मानक का एक प्रतिनिधि एमआरएम क्रोमैटोग्राम, रंग-कोडित लाइनों द्वारा इंगित किया गया है, चित्र 3 में दिखाया गया है। सभी 19 नमूनों में बीएमएए और आइसोमर्स की उपस्थिति और एकाग्रता, मुक्त और बाध्य अंशों में बीएमएए और आइसोमर एकाग्रता दिखाने के लिए वर्गीकृत, तालिका 1 में संक्षेप ति है। सभी तीन आइसोमर्स के लिए एक सकारात्मक पहचान लिडेल झील (एनएसडब्ल्यू, ऑस्ट्रेलिया) से एकत्र किए गए मेरिस्मोपेडिया प्रजातियों के मुक्त अंश में देखी गई, जहां मुक्त अंश में बीएमएए एकाग्रता 68.38 `g / g शुष्क वजन (DW) ± 2.25 μg / g DW, 2,4-DAB की सांद्रता के साथ 1,223.98 μg / g DW ± 20.7 μg / g DW थी। और 125.27 μg / g DW ± 4.19 μg / g DW की एकाग्रता के साथ AEG। क्रोमैटोग्राफिक एमआरएम चित्रा 4 में दिखाए गए हैं। एक नमूने में बीएमएए और इसके आइसोमर्स के लिए एक नकारात्मक परिणाम को चित्रित करने के लिए, वाल्का वाटर वर्क्स (एनएसडब्ल्यू, ऑस्ट्रेलिया) से एकत्र किए गए माइक्रोसिस्टिस फ्लोस-एक्वा प्रजातियों का बाध्य अंश चित्र 5 में क्रोमैटोग्राफिक रूप से प्रस्तुत किया गया है। जबकि बाध्य अंश में कोई बीएमएए, 2,4-डीएबी और / या एईजी नहीं था, इसके मुक्त अंश में सभी तीन आइसोमर्स शामिल थे, जिनकी सांद्रता क्रमशः 79.86 μg / g DW ± 1.59 μg / g DW, 1,156.15 μg / g DW ± 8.46 μg / g DW, और 433.83 μg / g DW ± 8.92 μg / g DW थी।
इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के उपयोग के माध्यम से, वियोली एट अल .38 ने पूर्वी ऑस्ट्रेलियाई मीठे पानी के साइनोबैक्टीरिया में बीएमएए आइसोमर्स की उपस्थिति की पुष्टि की और निर्धारित किया कि किस साइनोबैक्टीरिया में विष पैदा करने की क्षमता थी।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig01.jpg"> चित्रा 1: BMAA और इसके आइसोमर्स 2,4-DAB और AEG की रासायनिक संरचना। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig02.jpg"> चित्रा 2: निष्कर्षण प्रोटोकॉल का सारांशित संदर्भ आरेख। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig03.jpg"> चित्रा 3: प्रतिधारण के आधार पर आइसोमर पहचान के लिए डी 5-2,4-डीएबी, 2,4-डीएबी, बीएमएए और एईजी युक्त अंशांकन मानक का एलसी-एमएस /एमएस क्रोमैटोग्राम, हाइलाइट किए गए चोटियों द्वारा इंगित किया गया है। कुंजी: D5-2,4-DAB 338.01 m/z > 278.10 m/z 6.4 मिनट (लाल), 2,4-DAB 333.01 m/z > 273.10 m/z पर 6.4 मिनट (हरा), AEG 333.01 m/z > 88.00 m/z 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 278.10 m/z > 6.4 मिनट (हरा), AEG 333.01 m/z > 7.4 मिनट (नारंगी) पर 88.00 m/z और BMAA 33.01 m/z 7.4 मिनट (नारंगी) पर >। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig04.jpg"> चित्रा 4: झील लिडेल (एनएसडब्ल्यू, ऑस्ट्रेलिया) से एकत्र किए गए मेरिस्मोपेडिया प्रजातियों में डी 5-2,4-डीएबी, 2,4-डीएबी, बीएमएए और एईजी का पता लगाने के लिए एलसी-एमएस / एमएस क्रोमैटोग्राम, हाइलाइट की गई चोटियों द्वारा इंगित किया गया है। कुंजी: D5-2,4-DAB 338.01 m/z > 278.10 m/z 6.4 मिनट (लाल), 2,4-DAB 333.01 m/z > 273.10 m/z पर 6.4 मिनट (हरा), AEG 333.01 m/z > 88.00 m/z 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 278.10 m/z > 6.4 मिनट (हरा), AEG 333.01 m/z > 7.4 मिनट (नारंगी) पर 88.00 m/z और BMAA 33.01 m/z 7.4 मिनट (नारंगी) पर >। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig05.jpg"> चित्रा 5: वाल्का वाटर वर्क्स (एनएसडब्ल्यू, ऑस्ट्रेलिया) से एकत्र किए गए माइक्रोसिस्टिस फ्लोस-एक्वा प्रजातियों के एक बाध्य अंश में 2,4-डीएबी, बीएमएए और एईजी के लिए नकारात्मक नियंत्रण का एलसी-एमएस / एमएस क्रोमैटोग्राम। कुंजी: D5-2,4-DAB 338.01 m/z > 278.10 m/z 6.4 मिनट (लाल - शिखर हाइलाइट किया गया), 2,4-DAB 333.01 m/z > 273.10 m/z 6.4 मिनट (हरा), AEG 333.01 m/z > 88.00 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 333.01 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 333.01 m/z पर 7.4 मिनट (नीला) > 18.01 m/z। धराशायी लाइनें लापता 2,4-डीएबी, एईजी और बीएमएए के लिए अवधारण समय का प्रतिनिधित्व करती हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig05large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
तालिका 1: साइनोबैक्टीरियल आइसोलेट्स में बीएमएए, एईजी और 2,4-डीएबी सांद्रता। सांद्रता माध्य (एन = 3) की मानक त्रुटि ± है। एनडी का अर्थ है पता नहीं लगाया गया है। पाए गए प्रत्येक आइसोमर की उच्चतम सांद्रता हरे रंग में हाइलाइट की जाती है। तालिका वियोली एट अल .38 से एक संशोधित संस्करण है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779_Table%201.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

वर्तमान प्रोटोकॉल तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके विश्लेषण से पहले ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड (टीसीए) प्रोटीन वर्षा और एसिड हाइड्रोलिसिस के माध्यम से जैविक मैट्रिक्स से गैर-प्रोटीन अमीनो एसिड के निष्कर्षण का वर्णन करता है।

तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए साइनोबैक्टीरिया से गैर-प्रोटीन अमीनो एसिड का निष्कर्षण

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं की सहायता करेगा और छात्रों को बीएमए, एईजी और 2, 4-डीएबी के निष्कर्षण में सही कदम सिखाएगा। जिससे त्रुटि की संभावना कम हो जाती है और लगातार परिणाम मिलते हैं। यह विधि एक सॉना बैक्टीरियल मैट्रिक्स में बीएमए और उसके आइसोमर्स, एईजी और 2, 4-डीएबी के निष्कर्षण के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली और मान्य विधि है।इस विधि का उपयोग बीएमए विषाक्तता के बारे में आगे के शोध के लिए किया जा सकता है और बीएमए और इसके संबंधित स्वास्थ्य प्रभावों के बारे में अधिक समझ प्रदान की जा सकती है। साइनोबैक्टीरिया नमूने को 3,500 ग्राम पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करके शुरू करें। और सुपरनैटेंट को जैविक अपशिष्ट में फेंक देना।एक सीलिंग फिल्म के साथ गोली युक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को कवर करें और तेज लंबी नाक चिमटी का उपयोग करके फिल्म में कुछ छेद छेद करें। फिर ट्यूब को माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर सीधा स्टोर करें। 30 मिनट के बाद, ट्यूब को फ्रीज ड्रायर ग्लास कंटेनर में सीधा रखें और कंटेनर को ठंडा करने के लिए पांच मिनट के लिए माइनस 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के अंदर रखें।फ्रीजर से ग्लास कंटेनर निकालें और रबर का ढक्कन संलग्न करें। सुनिश्चित करें कि फ्रीज ड्रायर के रबर वाल्व आउटलेट पर हैंडल ऊपर की ओर इशारा कर रहा है और वायुमंडल में निकाला गया है। कांच के कंटेनर को मजबूती से संलग्न करें।धीरे-धीरे रबर वाल्व आउटलेट के हैंडल को घुमाएं ताकि इसे वैक्यूम में उजागर करने के लिए नीचे की स्थिति में इंगित किया जा सके। और सभी तरल को सबलिमेट करने के लिए 24 घंटे तक फ्रीज सुखाने की अनुमति दें। जब किया जाता है, तो 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जमे हुए नमूना छर्रों के 15 से 50 मिलीग्राम वजन करें।एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करना। नमूने में, 10% जलीय ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड या टीसीए के 300 से 600 माइक्रोलीटर जोड़ें। नमूना ट्यूबों को कुचल बर्फ से भरे कंटेनर में रखें।नमूने में जांच के अंत को पूरी तरह से डुबोने और शुरू करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ छिड़के गए लिंट-फ्री पेपर वाइप के साथ सोनिकेटर जांच को पोंछें। एक बार पूरा हो जाने के बाद, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब युक्त नमूने को एक मिनट के लिए बर्फ पर रखें। और सेल लाइसिस सुनिश्चित करने के लिए सोनिकेशन प्रक्रिया को दोहराएं।नमूने को 24 घंटे तक चार डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करने के बाद। सेंट्रीफ्यूज 3,500 ग्राम पर 15 मिनट के लिए आठ डिग्री सेल्सियस पर। फिर एक माइक्रो पिपेट का उपयोग करके, सतह पर तैरने वाले को दो मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसे मुक्त अंश लेबल किया गया है।नमूना गोली में 10% जलीय टीसीए के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें, और पेलेट को या तो भंवर आंदोलन द्वारा या माइक्रो पिपेट टिप के साथ तोड़ दें। सेंट्रीफ्यूज और सुपरनैटेंट को एक ही दो मिलीलीटर मुक्त अंश ट्यूब में स्थानांतरित करें। 10% TCA एसीटोन का उपयोग करके इस चरण को तीसरी बार दोहराएं।ढक्कन के साथ मुक्त अंश ट्यूब को एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरणकर्ता में खोलें जब तक कि सभी वाष्पशील तरल को हटा न दिया जाए। एक बार जब नमूना वाष्पशील तरल पदार्थ से मुक्त हो जाता है, तो ट्यूब को छत की फिल्म के साथ सुरक्षित रूप से कवर करें और तेज लंबी नाक चिमटी का उपयोग करके फिल्म को कुछ छेदों के साथ छेद दें। फ्रीज सुखाने के बाद, 20 मिलीमोलर हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 200 माइक्रोलीटर के साथ नमूने का पुनर्गठन करें और इसे माइनस 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।माइक्रो पिपेट का उपयोग करके नमूना गोली पर 100% एसीटोन के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें और भंवर आंदोलन या माइक्रो पिपेट टिप का उपयोग करके गोली को तोड़ दें। मात्रात्मक रूप से धोए गए और पुन: निलंबित गोली को संबंधित ग्लास शेल शीशी में स्थानांतरित करें। एक मिलीलीटर माइक्रो पिपेट का उपयोग करना।शेष गोली को स्थानांतरित करने में मदद करने के लिए नमूना ट्यूब में एसीटोन के एक और 400 माइक्रोलीटर जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज और सतह पर तैरने वाले तरल को जैविक अपशिष्ट में डुबोएं और एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरणकर्ता में गोली को तब तक सुखाएं जब तक कि तरल को हटा नहीं दिया जाता है और गोली सूख न जाए। वैक्यूम हाइड्रोलिसिस फ़ाइल तैयार करने के लिए हाइड्रोलिसिस फ़ाइल के तल में छह मोलर हाइड्रोक्लोरिक एसिड का एक मिलीलीटर जोड़ें।सूखे नमूनों के साथ लेबल की गई शेल शीशियों को सावधानीपूर्वक एक सीधी स्थिर स्थिति सुनिश्चित करने के लिए चिमटी का उपयोग करके हाइड्रोलिसिस फ़ाइल में डालें। ढक्कन को हाइड्रोलिसिस फ़ाइल से संलग्न करें और वाल्व को बंद करने के लिए ढक्कन पर लाल घुंडी को धक्का दें। वैक्यूम पंप को चालू करने के बाद, वैक्यूम ट्यूब को हाइड्रोलिसिस फ़ाइल ढक्कन के सिर से संलग्न करें और वाल्व खोलने के लिए ढक्कन पर हरे नॉब को दबाएं।इसके बाद, वैक्यूम पंप को एक मिनट के लिए शीशी से हवा को हटाने की अनुमति दें। फिर हाइड्रोलिसिस शीशी के ढक्कन पर लाल घुंडी को निराश करके शीशी को बंद करें। वैक्यूम पंप को बंद करें और वैक्यूम ट्यूब को हटा दें।प्रयोगशाला बेंच पर नाइट्रोजन गैस टैप के लिए एक रबर ट्यूब संलग्न करें। और नल को थोड़ा सा खोलें। अंगूठे को ट्यूब के अंत में रखें, इसे सील करें और तब तक गिनती करें जब तक कि दबाव बनने पर गैस निकलना शुरू न हो जाए।इसके बाद, रबर ट्यूब के दूसरे छोर को हाइड्रोलिसिस शीशी ढक्कन के सिर से जोड़ें। और तुरंत ढक्कन के हरे घुंडी को धक्का दें। गैस के निकलने में लगने वाले समय की गणना करें।जल्दी से ढक्कन पर लाल घुंडी को धक्का दें और रबर ट्यूब को हटा दें। पूरी वैक्यूम उपचार प्रक्रिया को दो बार दोहराएं। यह सुनिश्चित करना कि ग्लास हाइड्रोलिसिस शीशी हवा से मुक्त है और नाइट्रोजन गैस से भरी हुई है।हाइड्रोलिसिस शीशी को 16 से 18 घंटे के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट ओवन सेट में रखें। ओवन दस्ताने का उपयोग करके, ओवन से ग्लास हाइड्रोलिसिस शीशी को हटा दें। दबाव और गैस छोड़ने के लिए हरी घुंडी को धक्का देने से पहले शीशी को फ्यूम हुड के अंदर 10 मिनट तक ठंडा होने दें।शेल शीशी में 20 मोलर हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 200 माइक्रोलीटर के साथ हाइड्रोलाइज्ड नमूना छर्रों का पुनर्गठन करें और गोली को फिर से निलंबित करें। 5, 300 ग्राम और 25 डिग्री सेल्सियस पर दो मिनट के लिए पुनर्गठित नमूना छर्रों वाले शेल शीशियों को सेंट्रीफ्यूज करें। पुनर्गठित मुक्त अंश नमूने और प्रोटीन अंश को दो मिलीलीटर फिल्टर ट्यूबों में स्थानांतरित करें जिसमें 0.2 माइक्रोन छिद्र झिल्ली फिल्टर होते हैं और मुक्त अंश और प्रोटीन अंश के रूप में लेबल किए जाते हैं।सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए ट्यूबों को 5,000 जी और 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए रखें। बीटा-मिथाइलमिनो-एल-एलानिन या बीएमएए युक्त मानक के कई प्रतिक्रिया निगरानी क्रोमैटोग्राम और रंग कोडित लाइनों द्वारा इंगित इसके आइसोमर्स यहां दिखाए गए हैं। लिडेल झील से एकत्र किए गए मेरिस्मोपेडिया प्रजातियों के मुक्त अंश में सभी तीन आइसोमर्स, बीएमएए, डीएबी और एईजी के लिए एक सकारात्मक पहचान देखी गई थी।जबकि वाका वाटरवर्क्स से एकत्र किए गए माइक्रोसिस्टिस फ्लोस-एक्वा प्रजातियों के बाध्य अंश ने बीएमएए और इसके आइसोमर्स के लिए एक नकारात्मक परिणाम दिखाया। साइनोबैक्टीरिया द्रव्यमान के आधार पर सामान्यीकरण के सटीक बिंदु की अनुमति देने के लिए पुन: निलंबित गोली को मात्रात्मक रूप से संबंधित शेल शीशी में स्थानांतरित किया जाना चाहिए। इस चरण को करते समय रोगियों और उचित परिश्रम की सलाह दी जाती है।इस प्रक्रिया का पालन करें। निकाले गए अंशों को रिवर्स चरण की अनुमति देने के लिए एक विरूपण चरण से गुजरना होगा। तरल क्रोमैटोग्राफी, अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण।इस तकनीक का अनुप्रयोग विभिन्न वैज्ञानिक क्षेत्रों का विस्तार करता है। पर्यावरण के नमूनों में साइनोटॉक्सिन के विश्लेषण के माध्यम से पर्यावरण विज्ञान सहित। और बीएमए के मिसइनकॉर्पोरेशन सिद्धांत की जांच के माध्यम से विष विज्ञान और जैव रसायन जैसे क्षेत्र।

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

बड़े पैमाने पर गैर - लक्षित अल्ट्रा प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-एमएस) द्वारा सीरम की metabolomic प्रोफाइलिंग

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Ultraperformance लिक्विड क्रोमैटोग्राफी उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-HRMS) का उपयोग जैविक स्रोतों से अलक्षित Metabolomics

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

प्लांट टिश्यू से कार्बनिक अम्ल यों केशिका वैद्युतकणसंचलन का उपयोग: एक परीक्षण के मामले की जांच<em&gt; Coffea अरेबिका</em&gt; बीज

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

एक एच एस-MRM परख के ठहराव के लिए मेजबान कोशिका प्रोटीन में प्रोटीन क्रोमैटोग्राफी आयन गतिशीलता द्वारा QTOF जन स्पेक्ट्रोमेट्री

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Glucosinolate निष्कर्षण और विश्लेषण उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी साथ के लिए एक सरल विधि (एचपीएलसी)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

Fizzy Extraction of Volatile Organic Compounds Combined with Atmospheric Pressure Chemical Ionization Quadrupole Mass Spectrometry

वायुमंडलीय दबाव रासायनिक आयनकरण क्वाड्रुपोल मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों के फैज़ी एक्सट्रैक्शन

Chemical analysis of volatile and semivolatile compounds dissolved in liquid samples can be challenging. The dissolved components need to be brought to ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित माध्यमिक Nanoelectrospray Ionization का उपयोग करके वास्तविक समय सांस विश्लेषण

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Oligo-peptoids का संश्लेषण एवं मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

केशिका वैद्युतकणसंचलन-आधारित हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज टॉप-डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ प्रोटीन के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Curation of Computational Chemical Libraries Demonstrated with Alpha-Amino Acids

अल्फा-अमीनो एसिड के साथ प्रदर्शित कम्प्यूटेशनल रासायनिक पुस्तकालयों का क्यूरेशन

Exhaustive generation of molecular structures has numerous chemical and biochemical applications such as drug design, molecular database construction, ...