Name: extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-12-09T12:40:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

D.P.B., K.J.R. og S.M.M. støttes av The Ian Potter Foundation, og J.P.V. er mottaker av et australsk regjeringsforskningsprogram, Stipend.

Cyanobakteriearten Merismopedia ble brukt i denne studien38.
1. Forberedelse av rå prøve
<ol><li>Samle algeskummet fra den akvatiske kilden av interesse eller fra en cyanobakteriell dyrket kolbe og legg den i 50 ml sentrifugerør38. MERK: Prøven må fryses ved -20 °C for senere ekstraksjoner og tines før neste trinn.</li>
	<li>Sentrifuge rørene som inneholder prøven ved 3,500 x g i 10 minutter ved 25 °C. Dekanter supernatanten i en avfallsbeholder og kaster den i biologisk avfall. MERK: Supernatanten kan være reservert for fremtidig analyse av eksosomet.</li>
	<li>Dekk røret som inneholder prøvepelleten sikkert med en tetningsfilm (se Materialfortegnelse) og stikk hull i filmen ved hjelp av en skarp, lang nesepinsett. Oppbevar tuben i oppreist stilling ved -80 °C i 30 minutter.</li>
	<li>Slå på og balanser frysetørkeren ved 0,1 mbar og −80 °C (~30 min). MERK: Parametrene (trinn 1.4) er optimalisert for frysetørkeren som ble brukt i denne studien (se Materialfortegnelse). Følg standard driftsprosedyrer i henhold til frysetørkermodellen som er tilgjengelig i laboratoriet, eller still inn lavest mulig temperatur hvis frysetørkermodellen ikke går så lavt som −80 °C.<ol><li>Plasser sentrifugerøret(e) stående i en frysetørkerglassbeholder og plasser dem inne i fryseren på −80 °C i 5 minutter for å avkjøle krukken.</li>
		<li>Fjern glassbeholderen fra fryseren og fest gummilokket.</li>
		<li>Forsikre deg om at håndtaket på gummiventilutløpet til frysetørkeren er ventilert til atmosfæren (peker oppover) og fest glassbeholderen godt.</li>
		<li>Vri håndtaket på gummiventilutløpet veldig sakte til pekeposisjonen for å utsette krukken for vakuumet og la opptil 24 timer frysetørking for å sikre sublimering av all væsken.</li>
		<li>For å frigjøre vakuumet i krukken, vri håndtaket til pekende oppoverposisjon, løsne glassbeholderen og fjern de frysetørkede prøvene.</li>
	</ol></li>
	<li>Bruk en analytisk vekt til å veie 15-50 mg tørkede prøvepellets i et 15 ml sentrifugerør. MERK: Prøvene kan plasseres i −80 °C hvis de ikke behandles videre på dette stadiet.</li>
</ol>2. Cellelysing og fraksjonering av frie NPAAer
<ol><li>Tilsett 100 μL 100 ng / ml D5-2,4-DAB (se materialtabell) standard ved hjelp av en mikropipette til prøverøret (valgfritt).</li>
	<li>Tilsett henholdsvis 300-600 μL 10 % w/v vandig trikloreddik (TCA, se materialfortegnelse) eller 300-600 μL på henholdsvis 11,7 % -13,3 % TCA hvis du legger til D5-2,4-DAB-standarden. MERK: Velg et volum av vandig TCA som dekker pelleten fullt ut.</li>
	<li>Plasser prøverørene i en beholder fylt med knust is.</li>
	<li>Bruk en sondesonikator (se Materialfortegnelse) ved middels høy effekt (70%) og lyse prøven i 1 min ved å følge trinnene nedenfor. FORSIKTIG: Sørg for riktig PPE ved bruk av støyreduserende øreklokker.<ol><li>Følg de riktige sikkerhetsprotokollene som forberedelse til bruk av sondesonens sonikator ved å plassere bruksskilt på døren, utføre sonikering i avtrekkshetten og bruke støyreduserende øreklokker.</li>
		<li>Slå på sonikatoren og skriv inn følgende parametere: amplitude, 70%; gang, 1 min.</li>
		<li>Spray 70 % etanol på en lofri papirserviett (se Materialfortegnelse) og tørk av sonden.</li>
		<li>Senk enden av sonden helt ned i prøven, og trykk på start.</li>
		<li>Når sonden sonikeren stopper, plasser sentrifugerøret som inneholder prøven på is i 1 min.</li>
		<li>For å sikre at cellene lyser, gjenta trinn 2.4.3-2.4.5 en gang til.</li>
	</ol></li>
	<li>Sett prøven i et kjøleskap ved 4 °C i 12-24 timer for å tillate proteinutfelling.</li>
	<li>Sentrifuge den 10 % vandige TCA-prøven ved 3 500 x g i 15 minutter ved 8 °C.</li>
	<li>Bruk en mikropipette til å overføre supernatanten til et 2 ml rør merket "Free Fraction".</li>
	<li>Mikropipette 400 μL 10 % vandig TCA i sentrifugerøret som inneholder den gjenværende prøvepelleten og bryter opp pelleten enten ved virvelomrøring eller med mikropipettespissen.</li>
	<li>Gjenta trinn 2.6-2.7, og overfør supernatanten til det samme 2 ml "Free Fraction" -røret.</li>
	<li>Mikropipette 400 μL 10 % TCA/aceton inn i sentrifugerøret med gjenværende pellets og bryter opp pelleten med virvel eller mikropipettespissen.</li>
	<li>Sentrifuge 10 % TCA/acetonprøve ved 3 500 x g i 15 minutter ved 8 °C. Bruk en mikropipette til å overføre supernatanten til 2 ml røret merket "Free Fraction".</li>
	<li>Plasser "Free Fraction" -røret med lokket åpent i en sentrifugalfordamper (se materialtabell) til alle flyktige væsker er fjernet (minst 1 time).</li>
	<li>Når prøven er fri for flyktige væsker, dekk røret sikkert med tetningsfilm og pierce filmen med noen få hull ved hjelp av en skarp, lang nesepinsett. Sett prøven i en fryser på −80 °C.</li>
	<li>Frys tørk prøven "Free Fraction" ved å gjenta alle trinnene i trinn 1.4.</li>
	<li>Mikropipette 200 μL 20 mM saltsyre (HCl) i "Free Fraction" -røret for å rekonstituere den frysetørkede prøven og plassere den i -80 ° C fryselager. MERK: "Free Fraction" av prøven er klar for filtrering i trinn 4. Den gjenværende pelleten vil bli viderebehandlet i følgende trinn for proteinfraksjonering.</li>
</ol>3. Fraksjonering av proteinbundne NPAA-er
<ol><li>Bruk en glassgravør til å merke hetteglass med glassskall med prøvedetaljene for identifikasjon. MERK: Sterk syre kan spre blekkmerking; Derfor anbefales det å gravere etikettene på glass.</li>
	<li>Mikropipette 100 μL 100 ng/ml D5-2,4-DAB-standard på prøvepelleten (valgfritt).</li>
	<li>Mikropipette 400 μL 100 % aceton på prøvepelletsen og bryter opp pelleten ved hjelp av enten virvelrøring eller mikropipettespissen.</li>
	<li>Bruk et 1 ml mikropipettesett på 1000 μL for å overføre den vaskede og resuspenderte pelleten til det tilsvarende hetteglasset med glassskall. MERK: Ytterligere 400 μL 100 % aceton kan tilsettes den omrørte pelleten for å hjelpe til med fullstendig overføring av pelleten til hetteglasset med glassskall. Dette kan gjentas en tredje gang om nødvendig.</li>
	<li>Sentrifuge ved 8000 x g i 5 minutter ved 25 °C og dekantere væsken til biologisk avfall.</li>
	<li>Plasser den gjenværende pelleten i en sentrifugalfordamper til all væsken er fjernet og pelleten er tørr (~ 1 time).</li>
	<li>Forbered hetteglasset med vakuumhydrolyse ved å tilsette 1 ml 6 M HCl i bunnen av hetteglasset med hydrolyse.</li>
	<li>Bruk pinsett til å sette forsiktig inn hetteglassene med merket skall som inneholder de tørkede prøvene i hetteglasset for hydrolyse, for å sikre en oppreist, stabil stilling. MERK: Hetteglass med tomt skall kan brukes til å holde prøveflaskene oppreist hvis antall prøver er mindre enn kapasiteten til hetteglasset med hydrolyse.</li>
	<li>Fest lokket til hetteglasset med hydrolyse og skyv den røde knappen på lokket for å lukke ventilen.</li>
	<li>Slå på vakuumpumpen, fest vakuumrøret til hodet på hydrolyselokket, og trykk på den grønne knappen på lokket for å åpne ventilen.</li>
	<li>La vakuumpumpen (se Materialfortegnelse) fjerne luften fra hetteglasset i 1 min.</li>
	<li>Lukk hetteglasset ved å trykke den røde knappen på lokket på hydrolysehetteglasset, slå av vakuumpumpen og fjern vakuumrøret.</li>
	<li>Fest et gummirør til nitrogengasskranen på laboratoriebenken og åpne kranen litt. Plasser tommelen på rørets ende, forsegle den og telle til gassen begynner å unnslippe når trykket bygger seg opp. Dette vil være tidsrammen for neste trinn. Juster gasstrømmen til en passende tidsramme.</li>
	<li>Fest den andre enden av gummirøret til hodet på hydrolysehettelokket og skyv deretter umiddelbart den grønne knappen på lokket. Tell til tiden som er bestemt i trinn 3.13, og skyv raskt den røde knappen på lokket og fjern gummirøret.</li>
	<li>Gjenta trinn 3.10-3.14 to ganger for å sikre at hetteglasset med vannhydrolyse er fritt for luft og fylt med nitrogengass.</li>
	<li>Plasser hetteglasset med hydrolyse i en forvarmet ovn satt til 110 °C i 16-18 timer.</li>
	<li>Bruk ovnshansker til å fjerne hetteglasset med glasshydrolyse fra ovnen og la det avkjøles inne i avtrekkshetten i 10 minutter. Inne i avtrekkshetten, mens du vender den bort fra deg, skyver du den grønne knappen for å frigjøre trykk og gass.</li>
	<li>Bruk pinsett for å fjerne hetteglassene fra hydrolysehetteglasset.</li>
	<li>Rekonstituer de hydrolyserte prøvepelletsene ved mikropipettering av 200 μL på 20 mM HCl i hetteglasset. Forsikre deg om at pelleten resuspenderes ved enten å virvle eller bruke en pipettespiss.</li>
	<li>Sentrifuge hetteglassene med rekonstituerte prøvepellets i 2 minutter ved 5 300 x g og 25 °C.</li>
</ol>4. Eksempel filtrering
<ol><li>Merk 2 ml filterrør (se materialfortegnelse) som inneholder 0,2 μm poremembranfiltre som "fri fraksjon" og "proteinfraksjon".</li>
	<li>Overfør de rekonstituerte prøvene fra trinn 2,15 (fri fraksjon) og trinn 3,20 (proteinfraksjon) til de tilsvarende filterrørene.</li>
	<li>Plasser dem i sentrifugen i 30 minutter ved 5000 x g og 25 °C.</li>
	<li>Fjern filtrene fra filterrørene og dekk dem. Prøvene er nå klare for aminosyrederivatisering i trinn 5. MERK: Prøvene kan plasseres i -80 °C fryseren for lagring for senere derivasjon og analyse.</li>
</ol>5. Aminosyre derivatisering
<ol><li>Derifiser prøvene ved bruk av propylkloroformat (PCF)39 eller 6-aminokinoll-N-hydrosysuccinimidylkarbamat (AQC)40 i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse).</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Ekstraksjonsprotokollen som er skissert her for analyse av NPAAer, gjelder for analyse av aminosyrer i biologiske prøver. For veiledninger om isolering og dyrking av cyanobakterielle stammer kan man referere til metodene presentert i studien til Violi et al.38. Det første trinnet i protokollen tar prøven til et punkt der normalisering mellom prøver mot tørrvekten kan oppnås. Det andre trinnet er cellelyse for å frigjøre analyttene og kan utføres ved hjelp av en rekke teknikker, inkludert mekaniske forstyrrelser / lyser som sondesonikering som beskrevet i denne protokollen, fryse / tine sykluser, sliping og perlefresing og ikke-mekaniske forstyrrelser som enzymatisk, vaskemiddel og / eller kjemisk lyse. Mekanisk forstyrrelse er kjent for å være fordelaktig i forhold til ikke-mekanisk, da det muliggjør større kapasitet i prøven til lyse samtidig som de intracellulære bindingene og proteinene forblir intakte41, selv om prøvematrisen kan diktere den optimale metoden for cellelysing.
Proteinutfelling er det kritiske tredje trinnet i denne protokollen når man trekker ut aminosyrer for analyse. TCA er det mest brukte løsningsmidlet; Imidlertid har perklorsyre, aceton, metyl-tert-butyleter (MTBE), metanol og / eller acetonitril 8,42 også blitt brukt, hvor hvert ekstraksjonsløsningsmiddel er ment å trekke ut og utfelle forskjellige substrater. Modellen beskrevet her trekker ut NPAA BMAA og dets isomerer fra en cyanobakteriell matrise, og selv om en rekke forskjellige løsningsmidler har blitt brukt, er de to vanligste 10% TCA i vann (vandig) og 10% TCA i aceton. Generelt brukes proteinutfelling med TCA ofte til å trekke ut aminosyrer for å fraksjonere frie aminosyrer fra proteinbundne aminosyrer. I tillegg tillater TCA-ekstraksjon å bestemme det totale proteininnholdet, redusere forurensninger for den frie fraksjonen og redusere aktiviteten til proteaser med minimal proteinnedbrytning43. TCA-ekstraksjonen av den frie fraksjonen virker ved først å skylle ut organisk løselige stoffer, etterlate proteiner og uoppløselige forbindelser som celleveggrester i bunnfallet, som deretter etterfølges av termisk hydrolyseekstraksjon av proteinbundne aminosyrer (bundet fraksjon) ved bruk av en sterk syre.
Fraksjoneringen av den frie fraksjonen med 10% vandig TCA pluss sonikering gir den mest omfattende proteinutfellingen sammenlignet med andre organiske løsningsmidler44 og de beste aminosyreutvinningene42. Noen studier velger å bruke en syre kombinert med et organisk løsningsmiddel (dvs. 10% -20% TCA i aceton 43) for å utfelle flere molekyler, inkludert mindre peptider / biomolekyler, minimere proteinnedbrytning og redusere forurensninger som salter43. En annen fordel med 10% TCA i aceton er dens raskere tørkehastighet ved fremstilling av pelleten for hydrolyse, og minimerer fuktighetsrester for å forhindre aminosyremodifisering. Imidlertid har 10% vandig TCA pluss sonikering bedre ekstraksjonseffektivitet av frie aminosyrer sammenlignet med 10% TCA i aceton44 alene. I tillegg har 10% vandig TCA-utfelling begrensninger som lang tørketid, ikke å kunne utfelle alle proteiner eller små peptider / biomolekyler, og avhengig av analytten av interesse (dvs. proteiner eller aminosyrer), som krever tilsetningsstoffer og reduksjonsmidler for å forhindre oksidasjon og nedbrytning45,46.
Denne protokollen bruker en kombinasjon av 10% vandig TCA og 10% TCA i aceton for å øke proteinutfelling, sikre at mindre peptider / biomolekyler utfelles, muliggjør raskere pelletstørketider og øker ekstraksjonseffektiviteten, og utnytter begge løsningsmiddelekstraksjonsegenskapene. Kombinasjonen av 10% vandig TCA og 10% TCA i aceton kan imidlertid utfelle små peptider/biomolekyler i fri fraksjon etter at 10% TCA i acetonsupernatant er kombinert med den vandige frie fraksjonen. I dette tilfellet skal bunnfallene overføres til den bundne fraksjonen for hydrolyse.
Den andre halvdelen av denne protokollen innebærer frigjøring av aminosyrer (dvs. BMAA) fra proteinpelleten via syredamphydrolyse ved forhøyede temperaturer i et oksygenfritt miljø. Den overveiende begrensende faktoren for hydrolysetrinnet er at det er tidkrevende og arbeidskrevende å forberede. Inkubasjonen over natten forhindrer rask og tidseffektiv prøvepreparering og analyse. I tillegg er den kvantitative overføringen av pelleten fra et sentrifugerør til et skallhetteglass (trinn 3.4) en vanskelig prosess som krever flid og tålmodighet for å sikre et nøyaktig normaliseringspunkt til tørrvekten. Mulige problemer brukeren kan møte er ufullstendig overføring av pellet, våte utfelte proteiner som fester seg til pipettespisser og det opprinnelige røret, og faste partikler i pelleten som blokkerer pipettespissen. Et praktisk forslag for å hjelpe til med en enklere overføring av pelleten er å fjerne ca. 0,3-0,5 mm av enden av pipettespissen med en saks, slik at større pelletspartikler kan trekkes og slippes ut i hetteglasset. Denne overføringsmetoden er vanlig praksis for proteinekstraksjon for alle aminosyreanalyser. Imidlertid bør modifikasjoner for å forbedre effektiviteten og nøyaktigheten av kvantitativ overføring av pelleten til skallhetteglasset undersøkes.
To former for hydrolyseteknikker kan brukes til å frigjøre aminosyrer fra deres proteinbundne tilstand: væskefasehydrolyse og syredamphydrolyse. Væskefasehydrolyse, som innebærer tilsetning av 6 M HCl på prøven, som deretter plasseres i en 110 ° C ovn over natten, er et alternativ til syredamphydrolysen beskrevet i denne protokollen. Ekstraksjonsteknikker som benytter væskefasehydrolyse kan kreve videre behandling, for eksempel avsalting, spesielt hvis AQC-derivatisering er valgt, da det krever grunnleggende betingelser for merking40. Syredamphydrolyse unngår avsalting og gir brukeren frihet til å velge derivatiseringsteknikk ved rekonstituering av den endelige pelleten før filtrering. Videre, uavhengig av den valgte hydrolysemetoden, kan prøvene kreve videre behandling, for eksempel SPE for matriserensing og konsentrasjon 29,47,48, avhengig av valg av derivatiseringsteknikk og / eller analytisk analyse (f.eks. omvendt fase LC-MS / MS vs. hydrofil interaksjonsvæskekromatografi [HILIC] LC-MS / MS 37 ). Rekonstitueringen av den endelige pelleten i 20 mM HCl i denne protokollen er egnet for derivatisering ved bruk av PCF-reagenser48via et kommersielt tilgjengelig aminosyrehydrolysesett39 (se materialtabell). Både AQC og PCF vil avlede alle aminosyrer, protein og ikke-protein som er tilstede i prøven, og selektiviteten til analyttene oppnås ved bruk av LC-MS / MS og dens kombinasjon av retensjonstidsmatching og nøye utvalg av kvantifikatoren og kvalifiseringen MRM38. 
Nåværende hydrolyseprotokoller er ikke optimalisert for frigjøring av BMAA, 2,4-DAB og AEG, men for de 22 proteinaminosyrene basert på eksisterende metoder for proteinhydrolyse 32, hvor inkubasjon i mer enn 18 timer resulterer i nedbrytning og modifisering av visse aminosyrer, som påvirker LC-MS / MS-analyse og dermed de oppnådde konsentrasjonene32. Beach et al.49 undersøkte hydrolyse over tid (0,5-120 timer) for å optimalisere hydrolyse for å analysere BMAA og proteinogene aminosyrer. De fant at selv om det var en tidlig rask frigjøring av BMAA i løpet av de første 0,5 timene av hydrolysen, fortsatte BMAA-nivåene å øke etter hvert som hydrolysetiden økte, uten nedbrytning, selv etter 5 dager49. Det er også fortsatt forskjellige synspunkter og spørsmål om den sanne naturen til bundet BMAA og dens isomerer, med noen studier som tyder på at i stedet for BMAA-binding50,51 eller feilinkorporering i proteiner14, er BMAA-proteinforening overfladisk52. Imidlertid krever den nåværende konsensus i analysen av "bundet" BMAA det validerte og allment aksepterte hydrolysetrinnet som bryter fra hverandre peptider / proteiner for å frigjøre aminosyrer og dermed BMAA og dets isomerer.
Utvinningsgraden av 20 proteinaminosyrer ble bestemt i en studie av Sedgwick et al.42 ved bruk av TCA-ekstraksjon, noe som resulterte i omtrent 100% utvinning. Når det gjelder BMAA og dets isomerer fra algematriser, har studier som sammenligner effektiviteten av BMAA-ekstraksjon ved bruk av forskjellige ekstraksjonsløsningsmidler, funnet at 10% TCA er den mest effektive for gratis BMAA27. Utvinningsgraden for proteinbundet BMAA ekstrahert ved hjelp av væskefasehydrolyse ble etablert i studier av Glover et al.25 og av Faassen et al.53, hvor nøyaktigheten ble bestemt av spiked utvinningsmetoder, med en gjennomsnittlig BMAA-utvinningsgrad på henholdsvis 108,6% og 70%. Faassen og medarbeidere beskrev prosedyrer for spike-recovery eksperimenter og illustrerte hvordan utvinningen varierer avhengig av stadiet i ekstraksjonsprosessen piggen ble gjort53. Faassen og medarbeidere bestemte i tillegg effektiviteten til syredampprotokollen som presenteres her, med utvinningsgrad på 83,6% for BMAA-isomerer pigget før ekstraksjon og 68,6% for de som ble pigget før hydrolyse24. Disse utvinningene, ekstraksjonsmetodene og analysene ble videre validert av Banack 26, med utvinningsgrad på 94% -106% for BMAA i en cyanobakteriell matrise og et% relativt standardavvik (% RSD) mellom 5,6% og20%, og oppfylte FDA-kriteriene for nøyaktighet54. Det anbefales at hvert laboratorium først etablerer sin utvinningsgrad og nøyaktighet før de bruker denne protokollen via spike-gjenopprettingseksperimenter. Restitusjonsmetodene presentert i Faassen et al.53 og Glover et al.25 kan følges som en veiledning.
Alternative former for hydrolyseteknikker kan benyttes i stedet for ovnhydrolyse over natten for raskere proteinbundet ekstraksjon av analytten. For eksempel kan en mikrobølgeekstraktor redusere hydrolysetiden betydelig fra 24 timer til så lite som 10 min55. Mikrobølgehydrolyse for aminosyrer bruker de samme prinsippene som den konvensjonelle termiske metoden, ved hjelp av et hanskerom for å forberede og montere mikrobølgebeholderen i et oksygenfritt miljø og tilsette 6 M HCl. Når den er lufttett, gjennomgår beholderen som inneholder prøven mikrobølgestråling. Mikrobølgehydrolyse har blitt brukt til å trekke ut aminosyrer fra forskjellige prøvematriser56,57,58; Mikrobølgehydrolyse er imidlertid ennå ikke utviklet og validert for analyse av BMAA.
Avslutningsvis er 10% vandig TCA-proteinutfelling den optimale metoden for å trekke ut frie ikke-proteinaminosyrer fra cyanobakterielle matriser27, og termisk hydrolyse gir en pålitelig og reproduserbar ekstraksjon av den proteinbundne fraksjonen. Denne protokollen for å trekke ut NPAA BMAA og dens isomerer fra cyanobakterier er validert og allment akseptert. Fremtidige retninger for ytterligere å optimalisere ekstraksjonen av BMAA vil fokusere på hydrolysetrinnet, som utføres i henhold til spesifikasjonene til de 22 proteinaminosyrene. Imidlertid bør ekstraksjonsprotokollen som presenteres her, fortsatt betraktes som effektiv og effektiv for å analysere BMAA og dens isomerer via LC-MS / MS.

Aminosyrer er kjemiske forbindelser som inneholder minst en amin- og karboksylfunksjonell gruppe. Noen aminosyrer inneholder også en iminogruppe, en annen funksjonell syregruppe enn karboksylsyre; Andre aminosyrer har amingrupper som ikke er festet til α-karbongruppe1. Det er over 500 aminosyrer2, hvorav 22 er kjent som proteinaminosyrer som brukes til genetisk koding i ribosomal proteinsyntese3. Disse 22 aminosyrene kan videre deles inn i essensielle og ikke-essensielle. Essensielle aminosyrer er nødvendige for at kroppen skal fungere skikkelig og kan bare kjøpes av eksterne kilder. Ikke-essensielle aminosyrer kan syntetiseres i organismen. Klassifiseringen av de 22 aminosyrene i essensielle/ikke-essensielle er unik for enkeltarter. Alle andre aminosyrer er ikke-protein aminosyrer (NPAA) som ikke er kodet for proteinsyntese. Aminosyrer, enten protein eller ikke-protein, kan også spille en signalrolle i en organisme og fungere som metabolske mellommenn4. På grunn av deres viktige og varierende roller kan aminosyrenivåer gi et innblikk i organismens tilstand, funksjonalitet og metabolske veier, etc. Det er to hovedmekanismer ved hvilke aminosyrer kan inkorporeres i en polypeptidkjede: ribosomal proteinsyntese, som benytter de 22 aminosyrene i koding, og ikke-ribosomal peptidsyntese, som sammen med proteinaminosyrer tillater bruk av noen NPAA i syntese. Visse NPAA kan etterligne proteinaminosyrer, noe som potensielt fører til feilinkorporering i peptider og proteiner. Feilinkorporeringen forårsaker en feilfolding av proteiner, som igjen har skadelige effekter5, for eksempel feilinkorporering av NPAA L-3,4 dihydroksyfenylalanin (L-DOPA) i stedet for tyrosin, som negativt påvirker cellulær funksjon og helse 6,7. En ekstra kilde til innlemmede NPAA er gjennom posttranslasjonell modifikasjon (PTM) av aminosyrerester. Aminosyrerester modifiseres av ulike årsaker, inkludert endringer i peptid- eller proteinkonformasjon, stabilitet og funksjonalitet. Ved hydrolyse av PTM-holdig protein eller peptider frigjøres disse modifiserte aminosyrerestene i deres frie NPAA-form 8,9.
NPAA β-metylamino-L-alanin (BMAA) produsert av cyanobakterier, kiselalger og dinoflagellater10 er et mistenkt nevrotoksin som er involvert som en medvirkende faktor til ulike nevrodegenerative sykdommer som amyotrofisk lateral sklerose / parkinsonisme-demenskompleks (ALS-PDC) 11,12, amyotrofisk lateral sklerose og Alzheimers sykdom 13 . Det foreslås at BMAA feilaktig inkorporeres i polypeptidkjeden av proteiner i stedet for L-serin14 og / eller andre proteinaminosyrer. Feilinkorporering av BMAA kan føre til feilfolding av proteiner, noe som resulterer i avsetning av proteinaggregater i nevroner14. I det siste tiåret har interessen for BMAA økt betydelig. Et bredt spekter av cyanobakterielle arter fra ferskvann, marine og brakkvannsmiljøer har blitt oppdaget for å produsere BMAA15, noe som fører til deres utbredte distribusjon i ulike økosystemer16,17. I tillegg har BMAA vist seg å biomagnifisere gjennom næringskjeden til den menneskelige matbanen18,19. På grunn av de potensielle helseeffektene, mangel på forståelse og inkongruenser av BMAA-toksisitet, er det viktig å fortsette videre forskning til enten toksisiteten til BMAA til slutt forstås eller BMAA anses som trygg20,21.
Analysen av aminosyrer i biologiske prøver kan deles inn i fire hovedtrinn: prøvepreparering, aminosyrederivatisering, separasjon og deteksjon, og identifikasjon og kvantifisering. Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) er den foretrukne analysemetoden, da den gir en målrettet og reproduserbar separasjon og analyse av aminosyrer.
Prøveprepareringsteknikker for analyse av cyanobakterielle og andre algeprøver involverer hovedsakelig en ekstraksjonsmetode for aminosyrer i deres frie og proteinbundne former. Gjennom årene har ekstraksjonsmetodene holdt seg relativt konsistente med vanlige elementer, inkludert oppløsning av prøven for å skille de frie aminosyrene fra deres bundne form, etterfulgt av proteinutfelling og frigjøring av de bundne aminosyrene gjennom hydrolyse med saltsyre (HCl) ved forhøyede temperaturer22 . Denne ekstraksjonsformen er optimalisert for proteinaminosyrer og brukes til NPAA. Imidlertid har deteksjon og kvantifisering av BMAA og dets isomerer (figur 1), aminoetylglycin (AEG) og 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB), i samme art av cyanobakterier vist inkonsekvente resultater i litteraturen, med en mulig forklaring som ligger i forskjeller i vekstforholdene og / eller stammen av alger som produserer varierende eller ingen mengder BMAA23 . Det har blitt hevdet at en mer sannsynlig forklaring på inkonsekvensene i deteksjon og kvantifisering av BMAA og dets isomerer skyldes ikke-validerte eksperimentelle protokoller, bruk av et bredt spekter av analytiske teknikker og utilstrekkelig eksperimentell detalj i de rapporterte metodene16,24 som fører til irreproduserbare interlaboratoriedata. Glover et al.25 og Banack 26 har imidlertid nylig utviklet og validert en analytisk teknikk for påvisning og kvantifisering av BMAA og dets isomerer ved bruk av ultra-performance væskekromatografi (UPLC) -MS / MS i samsvar med International Society of Analytical Chemists (AOAC), US Pharmacopeia og FDA-retningslinjer som er nødvendige for enkeltlaboratorievalidering.
Disse valideringseksperimentene fokuserte på separasjon og påvisning av BMAA og dets isomerer og adresserte ikke inkonsekvensene i prøveprepareringsprotokoller. Lage et al.27 sammenlignet ytelsen til tre vanlige ekstraksjonsmetoder for å kvantifisere BMAA og dets isomerer i cyanobakterielle prøver via LC-MS / MS: fastfaseekstraksjon (SPE) av frie aminosyrer28,29; en proteinutfellingsmetode som involverer en metanolekstraksjon og acetonutfelling30; og den mest brukte ekstraksjonsmetoden for BMAA, proteinutfelling med trikloreddiksyre (TCA)31. De konkluderte med at TCA-proteinutfelling var den optimale protokollen, noe som ga høyere BMAA-konsentrasjoner i testprøvene sammenlignet med de andre ekstraksjonsmetodene. Deres studie validerte TCA-ekstraksjon med derivatisering av BMAA ved bruk av 6-aminoquinolyl-N-hydroksysuccinimidylkarbamat (AQC) i en cyanobakteriematrise, og ga en etablert veiledning for å oppnå pålitelige og reproduserbare BMAA-data. TCA-aminosyreekstraksjon er en akseptert og vanlig prøveprepareringsteknikk som også kan brukes på andre matriser. Imidlertid må stabiliteten til aminosyren under hydrolyse vurderes for å forhindre nedbrytning eller oksidasjon, som kan overvinnes ved bruk av kjemiske modifikatorer og reduksjonsmidler32. TCA-ekstraksjon brukes rutinemessig og læres til nye forskerstuderende, og selv om protokollen er mye rapportert, er et visuelt hjelpemiddel i anvendelsen av denne metoden en verdifull ressurs, noe som sikrer riktig og konsekvent utførelse.
Omvendt fasekromatografi brukes ofte til å separere aminosyrer, noe som krever et derivatiseringstrinn før analyser. Derivasjonen av aminosyrer som BMAA tillater kromatografisk retensjon og kan øke oppløsningen mellom isomerer. Det øker også molekylmassen og forbedrer ioniseringen i massespektrometeret. Flere derivatiserende reagenser har blitt brukt til analyse av aminosyrer via LC-MS / MS, inkludert propylkloroformat (PCF) 33, 6-aminoquinolyl-N-hydrosysuccinimidylkarbamat (AQC) 27, 9-fluorenylmetylkloroformat (FMOC) 34 og dansylklorid (DC) 35. Imidlertid brukte de eneste validerte teknikkene for å analysere BMAA enten PCF 36 eller AQC24,26,37 som deres derivatiserende reagens.
Omfanget av denne protokollen er fokusert på TCA-ekstraksjon av NPAAer fra cyanobakterielle matriser. Det er en arbeidsintensiv metode som rutinemessig brukes og undervises i akademiske og industrielle forskningslaboratorier basert på manuskripter som kan være korte på detaljer; Derfor gir denne protokollen detaljer om prosedyren og teknikkene som er involvert i å forberede prøver for analyse av fri og bundet BMAA som modellaminosyre.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL glass shell vials</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>REST-24663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.3% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>BR780546-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mM HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z740441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 M HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.11727</td>
			<td>Dilute 70:1 Ethanol:water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C Freezer</td>
			<td>Martin CHRIST</td>
			<td>102142</td>
			<td>Alpha 2-4 Ldplus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>34967-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale Balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal evaporator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13442549</td>
			<td>DNA120-115 SpeedVac Concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP022620100-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D5-2,4-DAB standard</td>
			<td>CDN Isotopes</td>
			<td>D-7568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>CEO-8492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T2318-500EA</td>
			<td>Greiner centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS8161-100EA</td>
			<td>Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass engraver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrolysis vial &#38; Lid</td>
			<td>Eldex Laboratories/Waters</td>
			<td>WAT007568 &#38; WAT007569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice and container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper wipe</td>
			<td>Kimwipes/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.2 M&#937;.cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen tap with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000055-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - noise cancelling headphones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - oven gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td>QSONICA Sonicators</td>
			<td>Q125 Sonicator</td>
			<td>Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample transfer spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis

Ikke-protein aminosyrer (NPAA) er en stor klasse aminosyrer (AA) som ikke er genetisk kodet for oversettelse til proteiner. Analysen av NPAA kan gi viktig informasjon om cellulært opptak og / eller funksjon, metabolske veier og potensiell toksisitet. β-metylamino-L-alanin (BMAA) er en nevrotoksisk NPAA produsert av ulike algerarter og er forbundet med økt risiko for nevrodegenerative sykdommer, noe som har ført til betydelig forskningsinteresse. Det er mange måter å trekke ut AA for analyse, med væskekromatografi-tandem massespektrometri som den vanligste, og krever proteinutfelling etterfulgt av syrehydrolyse av proteinpelleten. Studier av tilstedeværelsen av BMAA hos algearter gir motstridende resultater, med bruk av ikke-validert prøvepreparering / ekstraksjon og analyse som en primær årsak. Som de fleste NPAAer er proteinutfelling i 10% vandig TCA og hydrolyse med fuming HCl den mest hensiktsmessige form for ekstraksjon for BMAA og dets isomerer aminoetylglycin (AEG) og 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). Denne protokollen beskriver trinnene i en validert NPAA-ekstraksjonsmetode som vanligvis brukes i forsknings- og undervisningslaboratorier.

En illustrasjon av ekstraksjonsprotokollen er gitt i figur 2 som en oppsummert referanseveiledning. Resultatene oppnådd av Violi et al.38 ble valgt for å representere et positivt resultat fra denne ekstraksjonsprotokollen for analyse av BMAA-isomerer fra cyanobakterier. Nitten enkeltarter av cyanobakterier ble dyrket fra 11 østlige australske ferskvannssteder. Ved bruk av samme protokoll ble BMAA-isomerer ekstrahert i frie og proteinfraksjoner, derivatisert med PCF og analysert ved bruk av LC-MS / MS. Sytten av de cyanobakterielle isolatene var positive for BMAA, og alle 19 inneholdt 2,4-DAB-isomeren. Et positivt resultat bekreftes ved å bruke en validert LC-MS/MS-metode og observere minst tre MRM-overganger (multiple reaction monitoring), en som kvantifikatorion og to som kvalifikatorioner ved forventet retensjonstid. Et representativt MRM-kromatogram av en standard som inneholder BMAA og dets isomerer, indikert med de fargekodede linjene, er vist i figur 3. Tilstedeværelse og konsentrasjon av BMAA og isomerer i alle 19 prøver, snittet for å vise BMAA- og isomerkonsentrasjonen i frie og bundne fraksjoner, er oppsummert i tabell 1. En positiv påvisning for alle tre isomerer ble observert i den frie fraksjonen av Merismopedia-artene samlet fra Lake Liddell (NSW, Australia), hvor den frie fraksjonen inneholdt en BMAA-konsentrasjon på 68,38 μg / g tørrvekt (DW) ± 2,25 μg / g DW, 2,4-DAB med en konsentrasjon på 1 223,98 μg / g DW ± 20,7 μg / g DW, og AEG med en konsentrasjon på 125,27 μg/g DW ± 4,19 μg/g DW. De kromatografiske MRM-ene er vist i figur 4. For å illustrere et negativt resultat for BMAA og dets isomerer i en prøve, er den bundne fraksjonen av Microcystis flos-aquae-artene samlet inn fra Walka Water Works (NSW, Australia) kromatografisk presentert i figur 5. Mens den bundne fraksjonen ikke inneholdt BMAA, 2,4-DAB og/eller AEG, inneholdt den frie fraksjonen alle tre isomerer, med konsentrasjoner på henholdsvis 79,86 μg/g DW ± 1,59 μg/g DW, 1 156,15 μg/g DW ± 8,46 μg/g DW og 433,83 μg/g DW ± 8,92 μg/g DW.
Gjennom bruk av denne protokollen bekreftet Violi et al.38 tilstedeværelsen av BMAA-isomerer i østlige australske ferskvannscyanobakterier og bestemte hvilke cyanobakterier som hadde toksinproduserende evner.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig01.jpg"> Figur 1: Den kjemiske strukturen til BMAA og dens isomerer 2,4-DAB og AEG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig02.jpg"> Figur 2: Oppsummert referansediagram for ekstraksjonsprotokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig03.jpg"> Figur 3: LC-MS/MS-kromatogram av en kalibreringsstandard som inneholder D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA og AEG for isomeridentifikasjon basert på retensjon, indikert av de uthevede toppene. Nøkkel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z ved 6,4 min (rød), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z ved 6,4 min (grønn), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z ved 7,4 min (oransje) og BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z ved 7,8 min (blå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig04.jpg"> Figur 4: LC-MS/MS-kromatogram for påvisning av D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA og AEG i Merismopedia-arter samlet inn fra Lake Liddell (NSW, Australia), indikert av de uthevede toppene. Nøkkel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z ved 6,4 min (rød), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z ved 6,4 min (grønn), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z ved 7,4 min (oransje) og BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z ved 7,8 min (blå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig05.jpg"> Figur 5: LC-MS/MS-kromatogram av negativ kontroll for 2,4-DAB, BMAA og AEG i en bundet fraksjon av Microcystis flos-aquae arter samlet inn fra Walka Water Works (NSW, Australia). Nøkkel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z ved 6,4 min (rød - topp uthevet), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z ved 6,4 min (grønn), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z ved 7,4 min (oransje) og BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z ved 7,8 min (blå). De stiplede linjene representerer oppbevaringstidene for manglende 2,4-DAB, AEG og BMAA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Tabell 1: BMAA-, AEG- og 2,4-DAB-konsentrasjoner i cyanobakterielle isolater. Konsentrasjoner ± standardfeil av gjennomsnittet (n = 3). ND angir ikke oppdaget. Den høyeste konsentrasjonen av hver isomer som oppdages, er uthevet i grønt. Tabellen er en modifisert versjon fra Violi et al.38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779_Table%201.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Denne protokollen beskriver ekstraksjon av ikke-proteinaminosyrer fra biologiske matriser via trikloreddiksyre (TCA) proteinutfelling og syrehydrolyse før analyse ved bruk av væskekromatografi-tandem massespektrometri.

Ekstraksjon av ikke-protein aminosyrer fra cyanobakterier for væskekromatografi-tandem massespektrometri analyse

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

Denne protokollen vil hjelpe brukere og lære studentene de riktige trinnene i utvinningen av BMA, AEG og 2, 4-DAB. Dermed minimerer sjansene for feil og gir konsistente resultater. Denne metoden er en vanlig og validert metode for ekstraksjon av BMA og dens isomerer, AEG og 2, 4-DAB i en badstue bakteriell matrise.Denne metoden kan brukes til videre forskning om BMAs toksisitet og gi en større forståelse om BMA og tilhørende helseeffekter. Begynn med sentrifusjon cyanobakterieprøven ved 3.500 G i 10 minutter ved 25 grader Celsius. Og kaste supernatanten i biologisk avfall.Dekk sentrifugerrøret som inneholder pelleten med en tetningsfilm og pierce noen hull i filmen ved hjelp av en skarp lang nesepincett. Oppbevar deretter røret oppreist ved minus 80 grader Celsius. Etter 30 minutter, plasser røret oppreist i en frysetørkerbeholder og plasser beholderen inne i fryseren minus 80 grader Celsius i fem minutter for avkjøling.Fjern glassbeholderen fra fryseren og fest gummilokket. Forsikre deg om at håndtaket på gummiventilutløpet til frysetørkeren peker oppover og ventileres til atmosfæren. Fest glassbeholderen godt.Vri håndtaket på gummiventilutløpet sakte for å peke det i en nedstilling for å eksponere krukken for vakuumet. Og la opptil 24 timers frysetørking sublimere all væsken. Når du er ferdig, veier du 15 til 50 milligram frosne prøvepellets i et 15 milliliter sentrifugerør.Ved hjelp av en analytisk balanse. Til prøven, tilsett 300 til 600 mikroliter 10% vandig trikloreddiksyre eller TCA. Plasser prøverørene i en beholder fylt med knust is.Tørk sondesonden med en lofri papirserviett sprayet med 70% etanol før du senker enden av sonden helt inn i prøven og trykker på start. Når du er ferdig, legg prøven som inneholder sentrifugerøret på is i ett minutt. Og gjenta sonikeringsprosessen for å sikre cellelyse.Etter avkjøling av prøven ved fire grader Celsius i 24 timer. Sentrifuge ved 3.500 G i 15 minutter ved åtte grader Celsius. Bruk deretter en mikropipette, overfør supernatanten til et to milliliter rør merket fri fraksjon.Tilsett 400 mikroliter 10% vandig TCA i prøvepelleten, og bryt opp pelleten enten ved virvelomrøring eller med mikropipettespissen. Sentrifuge og overfør supernatanten til det samme to milliliter frie fraksjonsrøret. Gjenta dette trinnet en tredje gang med 10% TCA aceton.Plasser det frie fraksjonsrøret med lokket åpent i en sentrifugalfordamper til all flyktig væske er fjernet. Når prøven er fri for flyktige væsker, dekk røret sikkert med takfilmen og pierce filmen med noen hull ved hjelp av en skarp lang nesepincett. Etter frysetørking demonstrert før, rekonstituer prøven med 200 mikroliter 20 millimolær saltsyre og legg den i en minus 80 grader Celsius fryser.Tilsett 400 mikroliter 100% aceton på prøvepelleten ved hjelp av en mikropipette og bryt opp pelleten ved hjelp av enten virvelomrøring eller mikropipettespissen. Overfør kvantitativt den vaskede og resuspenderte pelleten til det tilsvarende hetteglasset med glassskall. Ved hjelp av en milliliter mikropipette.Tilsett ytterligere 400 mikroliter aceton til prøverøret for å overføre den gjenværende pelleten. Sentrifuge og dekanter supernatantvæsken i biologisk avfall før pelleten tørkes i en sentrifugalfordamper til væsken er fjernet og pelleten er tørr. For å forberede vakuumhydrolysefilen, legg til en milliliter seks molar saltsyre til bunnen av hydrolysefilen.Sett forsiktig inn de merkede hetteglassene med tørkede prøver i hydrolysefilen ved hjelp av pinsett for å sikre en oppreist stabil stilling. Fest lokket til hydrolysefilen og trykk den røde knappen på lokket for å lukke ventilen. Etter at du har slått på vakuumpumpen, fest vakuumrøret til hodet på hydrolysefillokket og trykk på den grønne knappen på lokket for å åpne ventilen.La deretter vakuumpumpen fjerne luften fra hetteglasset i ett minutt. Lukk deretter hetteglasset ved å trykke ned den røde knappen på hydrolyseflaskelokket. Slå av vakuumpumpen og fjern vakuumrøret.Fest et gummirør til nitrogengasskranen på laboratoriebenken. Og åpne kranen litt. Plasser tommelen på enden av røret, forsegl den og tell til gassen begynner å unnslippe når trykket bygger seg opp.Fest deretter den andre enden av gummirøret til hodet på hydrolyseflaskelokket. Og trykk umiddelbart på den grønne knappen på lokket. Tell tiden det tar for gassen å rømme.Skyv den røde knappen raskt på lokket og fjern gummirøret. Gjenta hele vakuumbehandlingsprosessen to ganger. Sørg for at hetteglasset med hydrolyse er fritt for luft og fylt med nitrogengass.Plasser hydrolyseflasken i en forvarmet ovn satt til 110 grader Celsius i 16 til 18 timer. Bruk ovnshansker til å fjerne hetteglasset med hydrolyse i glass fra ovnen. La hetteglasset avkjøles inne i avtrekkshetten i 10 minutter før du skyver den grønne knappen mens du vender den bort for å frigjøre trykk og gass.Rekonstituer de hydrolyserte prøvepelletsene med 200 mikroliter 20 molar saltsyre i skallhetteglasset og resuspendere pelleten. Sentrifuger skallhetteglassene som inneholder de rekonstituerte prøvepelletsene i to minutter ved 5, 300 g og 25 grader Celsius. Overfør de rekonstituerte frie fraksjonsprøvene og proteinfraksjonen til de to milliliterfilterrørene som inneholder 0,2 mikron poremembranfiltre og merket som fri fraksjon og proteinfraksjon.Plasser rørene for sentrifugering i 30 minutter ved 5.000 G og 25 grader Celsius. Kromatogrammet for overvåking av flere reaksjoner av en standard som inneholder beta-metylamino-L-alanin eller BMAA og dets isomerer indikert med de fargekodede linjene, vises her. En positiv påvisning for alle tre isomerene, BMAA, DAB og AEG ble observert i den frie fraksjonen av Merismopedia-artene samlet inn fra Innsjøen Liddel.Mens den bundne fraksjonen av Microcystis flos-aquae-artene samlet fra Waka Waterworks illustrerte et negativt resultat for BMAA og dets isomerer. Den resuspenderte pelleten må kvantitativt overføres til det tilsvarende hetteglasset for å tillate et nøyaktig normaliseringspunkt basert på Cyanobacteria-masse. Pasienter og due diligence anbefales mens du utfører dette trinnet.Følg denne fremgangsmåten. De ekstraherte fraksjonene må gjennomgå et devitaliseringstrinn for å tillate omvendt fase. Væskekromatografi, tandem massespektrometri analyse.Anvendelsen av denne teknikken utvider ulike vitenskapelige felt. Inkludert miljøvitenskap gjennom analyse av cynotoksiner i miljøprøver. Og felt som toksikologi og biokjemi gjennom undersøkelsen av Misincorporation-teorien om BMA.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Storskala Non-målrettet metabolomic Profilering av serum ved Ultra Performance Liquid Kromatografi-massespektrometri (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Vilkårlige Metabolomics fra biologiske kilder Bruke UltraPerformance væskekromatografi-High Resolution massespektrometri (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Bruke Kapillær elektroforese å kvantifisere organiske syrer fra Plant Tissue: En Test Case Undersøke<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

HS-MRM analysen for kvantifisering av verten celle proteiner i Protein Biopharmaceuticals av flytende kromatografi Ion mobilitet QTOF massespektrometri

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

En grei metode for glucosinolate Utvinning og analyse med høyt trykk væskekromatografi (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

Fizzy Extraction of Volatile Organic Compounds Combined with Atmospheric Pressure Chemical Ionization Quadrupole Mass Spectrometry

Fizzy Ekstraksjon av flyktige organiske forbindelser kombinert med atmosfærisk trykk kjemisk ionisering Quadrupole massespektrometri

Chemical analysis of volatile and semivolatile compounds dissolved in liquid samples can be challenging. The dissolved components need to be brought to ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Sanntid pusten analyse ved hjelp av sekundære Nanoelectrospray Ionization koblet til høy oppløsning massespektrometri

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntese og massespektrometri analyse av Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Kapillær elektroforesebasert hydrogen/deuteriumutveksling for konformasjonskarakterisering av proteiner med massespektrometri ovenfra og ned

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Curation of Computational Chemical Libraries Demonstrated with Alpha-Amino Acids

Kurasjon av beregningskjemiske biblioteker demonstrert med alfa-aminosyrer

Exhaustive generation of molecular structures has numerous chemical and biochemical applications such as drug design, molecular database construction, ...