Name: extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-12-09T12:40:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

D.P.B., K.J.R. и S.M.M. поддерживаются Фондом Яна Поттера, а J.P.V. является получателем австралийской правительственной исследовательской учебной программы Stipend.

Вид цианобактерий Merismopedia был использован для настоящего исследования38.
1. Необработанная пробоподготовка
<ol><li>Соберите накипь водорослей из интересующего водного источника или из колбы, культивируемой цианобактериями, и поместите ее в 50 мл центрифужной трубки38. ПРИМЕЧАНИЕ: Образец должен быть заморожен при температуре −20°С для последующей экстракции и разморожен до следующего этапа.</li>
	<li>Центрифугирование пробирок, содержащих образец при 3 500 х г, в течение 10 мин при 25 °С. Декантируйте супернатант в контейнер для отходов и выбрасывайте его в биологические отходы. ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант может быть зарезервирован для будущего анализа экзосомы.</li>
	<li>Плотно накройте трубку, содержащую гранулу образца, уплотнительной пленкой (см. Таблицу материалов) и проткните несколько отверстий в пленке с помощью острого длинного носового пинцета. Храните трубку в вертикальном положении при температуре −80 °C в течение 30 мин.</li>
	<li>Включите и уравновешивайте сублимационную сушилку при 0,1 мбар и −80 °C (~30 мин). ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры (этап 1.4) оптимизированы для сублимационной сушилки, используемой для настоящего исследования (см. Таблицу материалов). Следуйте стандартным рабочим процедурам в соответствии с моделью сублимационной сушилки, доступной в лаборатории, или установите минимально возможную температуру, если модель сублимационной сушилки не опускается до -80 ° C.<ol><li>Поместите трубку (трубки) центрифуги вертикально в стеклянный контейнер сублимационной сушилки и поместите ее в морозильную камеру при температуре −80 °C на 5 минут, чтобы охладить банку.</li>
		<li>Извлеките стеклянную емкость из морозильной камеры и прикрепите резиновую крышку.</li>
		<li>Убедитесь, что ручка на выходе резинового клапана сублимационной сушилки выветривается в атмосферу (направлена вверх) и прочно прикрепите стеклянную емкость.</li>
		<li>Поверните ручку выходного отверстия резинового клапана очень медленно в положение, направленное вниз, чтобы подвергнуть банку вакууму и дать до 24 часов сублимационной сушки, чтобы обеспечить сублимацию всей жидкости.</li>
		<li>Чтобы освободить вакуум в банке, поверните ручку в положение, направленное вверх, отсоедините стеклянную емкость и удалите сублимированные образцы.</li>
	</ol></li>
	<li>Используйте аналитические весы для взвешивания 15-50 мг высушенных гранул образца в центрифужной трубке объемом 15 мл. ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть помещены в хранилище при температуре −80°С, если они не будут обработаны далее на данном этапе.</li>
</ol>2. Лизирование клеток и фракционирование свободных НПА
<ol><li>Добавьте 100 мкл стандарта D5-2,4-DAB (см. Таблицу материалов) с помощью микропипетки в пробирку (необязательно).</li>
	<li>Добавьте 300-600 мкл 10% мас./v водного трихлоруксуса (ТЦА, см. Таблицу материалов) или 300-600 мкл 11,7%-13,3% ТЦА, соответственно, если добавляется стандарт D5-2,4-DAB. ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите объем водного ТЦА, который полностью покрывает гранулу.</li>
	<li>Поместите пробоотборники в контейнер, наполненный измельченным льдом.</li>
	<li>Используйте зондовый ультразвуковой аппарат (см. Таблицу материалов) со средней и высокой мощностью (70%) и разрисуйте образец в течение 1 мин, следуя приведенным ниже шагам. ВНИМАНИЕ: Обеспечьте надлежащие СИЗ с использованием шумоподавляющих наушников.<ol><li>Следуйте соответствующим протоколам безопасности при подготовке к использованию зондового ультразвукового устройства, размещая на двери используемые вывески, выполняя обработку ультразвуком в вытяжном шкафу и используя шумоподавляющие наушники.</li>
		<li>Включите ультразвуковой аппарат и введите следующие параметры: амплитуда, 70%; время, 1 мин.</li>
		<li>Распылите 70% этанола на безворсовую бумажную салфетку (см. Таблицу материалов) и протрите зонд.</li>
		<li>Полностью погрузите конец зонда в образец и нажмите кнопку пуск.</li>
		<li>Когда зондовый ультразвуковой аппарат остановится, поместите трубку центрифуги, содержащую образец, на лед на 1 мин.</li>
		<li>Чтобы обеспечить лизирование клеток, повторите шаги 2.4.3-2.4.5 еще раз.</li>
	</ol></li>
	<li>Поместите образец в холодильник при температуре 4 °C в течение 12-24 ч, чтобы обеспечить осаждение белка.</li>
	<li>Центрифугировать 10% водный образец TCA при 3 500 х г в течение 15 мин при 8 °C.</li>
	<li>Используйте микропипетку для переноса супернатанта в трубку объемом 2 мл с надписью «Свободная фракция».</li>
	<li>Микропипетка 400 мкл 10% водного ТЦА попадает в центрифужную трубку, содержащую оставшуюся гранулу образца, и разбивает гранулу либо вихревым перемешиванием, либо наконечником микропипетки.</li>
	<li>Повторите шаги 2.6-2.7, перенеся супернатант в ту же 2 мл пробирку «Свободной фракции».</li>
	<li>Микропипетка 400 мкл 10% TCA/ацетона попадает в центрифужную трубку с оставшейся гранулой и разбивает гранулу вихрем или наконечником микропипетки.</li>
	<li>Центрифугировать 10% пробу TCA/ацетона при 3 500 х г в течение 15 мин при 8 °C. Используйте микропипетку для переноса супернатанта в трубку объемом 2 мл с надписью «Свободная фракция».</li>
	<li>Поместите трубку «Свободная фракция» с открытой крышкой в центробежный испаритель (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока все летучие жидкости не будут удалены (не менее 1 ч).</li>
	<li>Как только образец освободится от летучих жидкостей, надежно накройте трубку герметизирующей пленкой и проткните пленку несколькими отверстиями с помощью острого длинного носового пинцета. Поместите образец в морозильную камеру с температурой −80 °C.</li>
	<li>Сублимационная сушка образца "Свободная фракция", повторив все шаги на шаге 1.4.</li>
	<li>Микропипетка 200 мкл соляной кислоты (HCl) 20 мМ в пробирку «Свободной фракции» для восстановления лиофилизированного образца и помещения его в морозильную камеру с температурой −80 °C. ПРИМЕЧАНИЕ: "Свободная фракция" образца готова к фильтрации на этапе 4. Оставшаяся гранула будет дополнительно обработана на следующих этапах для фракционирования белка.</li>
</ol>3. Фракционирование связанных с белком НППА
<ol><li>Используйте стеклянный гравер для маркировки флаконов со стеклянной оболочкой с деталями образца для идентификации. ПРИМЕЧАНИЕ: Сильная кислота может рассеивать чернильную маркировку; поэтому рекомендуется гравировать этикетки на стекле.</li>
	<li>Микропипетка 100 мкл 100 нг/мл стандарта D5-2,4-DAB на гранулу образца (опционально).</li>
	<li>Микропипетка 400 мкл 100% ацетона на гранулу образца и разбить гранулу с помощью либо вихревого перемешивания, либо наконечника микропипетки.</li>
	<li>Используйте микропипетку объемом 1 мл на 1000 мкл для переноса промытой и повторно суспендированной гранулы в соответствующий флакон со стеклянной оболочкой. ПРИМЕЧАНИЕ: Еще 400 мкл 100% ацетона могут быть добавлены к перемешиваемой грануле, чтобы помочь в полном переносе гранулы во флакон со стеклянной оболочкой. При необходимости это можно повторить в третий раз.</li>
	<li>Центрифуга при 8 000 х г в течение 5 мин при 25 °C и декантирование жидкости в биологические отходы.</li>
	<li>Поместите оставшуюся гранулу в центробежный испаритель до тех пор, пока вся жидкость не будет удалена и гранула не высохнет (~1 ч).</li>
	<li>Подготовьте флакон для вакуумного гидролиза, добавив 1 мл 6 M HCl на дно флакона для гидролиза.</li>
	<li>Используйте пинцет, чтобы аккуратно вставить меченые флаконы с оболочкой, содержащие высушенные образцы, во флакон для гидролиза, обеспечивая вертикальное, стабильное положение. ПРИМЕЧАНИЕ: Пустые флаконы с оболочкой могут использоваться для поддержания флаконов с образцами в вертикальном положении, если количество образцов меньше емкости флакона для гидролиза.</li>
	<li>Прикрепите крышку к флакону для гидролиза и нажмите красную ручку на крышку, чтобы закрыть клапан.</li>
	<li>Включите вакуумный насос, прикрепите вакуумную трубку к головке крышки флакона для гидролиза и нажмите зеленую ручку на крышке, чтобы открыть клапан.</li>
	<li>Дайте вакуумному насосу (см. Таблицу материалов) удалить воздух из флакона в течение 1 мин.</li>
	<li>Закройте флакон, нажав на красную ручку на крышке флакона для гидролиза, выключите вакуумный насос и извлеките вакуумную трубку.</li>
	<li>Прикрепите резиновую трубку к крану газообразного азота на лабораторном стенде и слегка приоткройте кран. Поместите большой палец на конец трубки, запечатайте его и считайте, пока газ не начнет выходить по мере повышения давления. Это будут временные рамки для следующего шага. Отрегулируйте расход газа до подходящего таймфрейма.</li>
	<li>Прикрепите другой конец резиновой трубки к головке крышки флакона для гидролиза, а затем немедленно нажмите зеленую ручку крышки. Отсчитайте время, определенное на шаге 3.13, и быстро нажмите красную ручку на крышку и снимите резиновую трубку.</li>
	<li>Повторите шаги 3.10-3.14 дважды, чтобы убедиться, что стеклянный гидролизный флакон свободен от воздуха и заполнен газообразным азотом.</li>
	<li>Поместите флакон с гидролизом в разогретую духовку при 110 °C в течение 16-18 ч.</li>
	<li>Используйте перчатки для духовки, чтобы извлечь флакон с гидролизом стекла из духовки и дать ему остыть внутри вытяжного шкафа в течение 10 минут. Внутри вытяжного капота, лицом к нему, нажмите зеленую ручку, чтобы выпустить давление и газ.</li>
	<li>Используйте пинцет, чтобы удалить флаконы оболочки из флакона гидролиза.</li>
	<li>Восстановите гидролизованные гранулы образца путем микропипетки 200 мкл 20 мМ HCl во флакон оболочки. Убедитесь, что гранула повторно суспендирована либо вихрем, либо с помощью наконечника пипетки.</li>
	<li>Центрифугируйте оболочку флаконов, содержащих восстановленный образец гранул, в течение 2 мин при 5,300 х г и 25 °C.</li>
</ol>4. Фильтрация образцов
<ol><li>Этикетка 2 мл фильтрующих трубок (см. Таблицу материалов), содержащая 0,2 мкм поровых мембранных фильтров как "Свободная фракция" и "Белковая фракция".</li>
	<li>Перенесите восстановленные образцы со стадии 2.15 (свободная фракция) и стадии 3.20 (белковая фракция) в соответствующие фильтрующие трубки.</li>
	<li>Поместите их в центрифугу на 30 мин при 5 000 х г и 25 °C.</li>
	<li>Извлеките фильтры из фильтрующих трубок и закройте их крышкой. Образцы теперь готовы к дериватизации аминокислот на этапе 5. ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть помещены в морозильную камеру с температурой −80 °C для хранения для последующей дериватизации и анализа.</li>
</ol>5. Выведение аминокислот
<ol><li>Выводите образцы с использованием пропилхлорформиата (PCF)39 или 6-аминохинолил-N-гидросисукцинимидилкарбамата (AQC)40 в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать.

Аминокислоты представляют собой химические соединения, которые содержат, по меньшей мере, один амин и карбоновую функциональную группу. Некоторые аминокислоты также содержат иминогруппу, функциональную кислотную группу, отличную от карбоновой; другие аминокислоты имеют аминные группы, которые не присоединены к α-углеродной группе1. Существует более 500 аминокислот2, 22 из которых известны как белковые аминокислоты, используемые для генетического кодирования в синтезе рибосомного белка3. Эти 22 аминокислоты могут быть далее подразделены на незаменимые и несущественные. Незаменимые аминокислоты необходимы для правильного функционирования организма и могут быть приобретены только внешними источниками. Заменимые аминокислоты могут синтезироваться в организме. Классификация 22 аминокислот на незаменимые / несущественные является уникальной для отдельных видов. Все остальные аминокислоты являются небелковыми аминокислотами (НПДА), которые не кодируются для синтеза белка. Аминокислоты, будь то белковые или небелковые, также могут играть сигнальную роль в организме и выступать в качестве метаболических посредников4. Из-за их важных и различных ролей, уровни аминокислот могут дать представление о состоянии организма, функциональности и метаболических путях и т. Д. Существует два основных механизма, с помощью которых аминокислоты могут быть включены в полипептидную цепь: синтез рибосомного белка, который использует 22 аминокислоты в кодировании, и синтез нерибосомных пептидов, который, наряду с белковыми аминокислотами, позволяет использовать некоторые НПДА в синтезе. Некоторые NPAA могут имитировать белковые аминокислоты, что потенциально приводит к их неправильному включению в пептиды и белки. Неправильная инкорпорация вызывает неправильное сворачивание белков, что, в свою очередь, оказывает пагубное воздействие5, такое как неправильное включение NPAA L-3,4 дигидроксифенилаланина (L-DOPA) вместо тирозина, негативно влияя на клеточную функцию и здоровье 6,7. Дополнительным источником инкорпорированных НПДА является посттрансляционная модификация (ПТМ) аминокислотных остатков. Аминокислотные остатки модифицируются по различным причинам, включая изменения пептидной или белковой конформации, стабильности и функциональности. При гидролизе ПТМ-содержащего белка или пептидов эти модифицированные аминокислотные остатки высвобождаются в их свободную NPAA-форму 8,9.
NPAA β-метиламино-L-аланин (BMAA), продуцируемый цианобактериями, диатомовыми водорослями и динофлагеллятами10, является подозреваемым нейротоксином, который участвует в качестве фактора, способствующего различным нейродегенеративным заболеваниям, таким как боковой амиотрофический склероз / паркинсонизм-деменция (ALS-PDC) 11,12, боковой амиотрофический склероз и болезнь Альцгеймера 13 . Предполагается, что BMAA ошибочно включается в полипептидную цепь белков вместо L-серина14 и/или других белковых аминокислот. Неправильное включение BMAA может привести к неправильному сворачиванию белков, что приводит к отложению белковых агрегатов в нейронах14. В последнее десятилетие интерес к BMAA значительно возрос. Было обнаружено, что широкий спектр видов цианобактерий из пресноводных, морских и солоноватых сред производит BMAA15, что приводит к их широкому распространению в различных экосистемах 16,17. Кроме того, было показано, что BMAA биоусиляет через пищевую цепь человека18,19. Из-за потенциальных последствий для здоровья, отсутствия понимания и несоответствия токсичности BMAA крайне важно продолжать дальнейшие исследования до тех пор, пока токсичность BMAA не будет в конечном итоге понята или BMAA не будет признана безопасной20,21.
Анализ аминокислот в биологических образцах можно разделить на четыре основных этапа: подготовка образца, дериватизация аминокислот, разделение и обнаружение, а также идентификация и количественная оценка. Жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (LC-MS/MS) является предпочтительным методом анализа, поскольку она обеспечивает целенаправленное и воспроизводимое разделение и анализ аминокислот.
Методы пробоподготовки для анализа цианобактериальных и других образцов водорослей преимущественно включают метод экстракции аминокислот в их свободной и связанной с белком формах. На протяжении многих лет методы экстракции оставались относительно совместимыми с общими элементами, включая растворение образца для отделения свободных аминокислот от их связанной формы, с последующим осаждением белка и высвобождением связанных аминокислот путем гидролиза соляной кислотой (HCl) при повышенных температурах22 . Эта экстракционная форма была оптимизирована для белковых аминокислот и использована для NPAA. Однако обнаружение и количественная оценка BMAA и его изомеров (рисунок 1), аминоэтилглицина (AEG) и 2,4-диаминомасляной кислоты (2,4-DAB) у одних и тех же видов цианобактерий показали противоречивые результаты в литературе, с возможным объяснением, лежащим в различиях в условиях роста и / или штамме водорослей, производящих различные или отсутствующие количества BMAA23 . Утверждалось, что более вероятное объяснение несоответствий в обнаружении и количественной оценке BMAA и его изомеров связано с непроверенными экспериментальными протоколами, использованием широкого спектра аналитических методов и недостаточной экспериментальной детализацией в представленных методах 16,24, что приводит к невоспроизводимым межлабораторным данным. Тем не менее, Glover et al.25 и Banack26 недавно разработали и проверили аналитический метод обнаружения и количественной оценки BMAA и его изомеров с использованием сверхэффективной жидкостной хроматографии (UPLC)-MS / MS в соответствии с Международным обществом химиков-аналитиков (AOAC), Фармакопеей США и руководящими принципами FDA, необходимыми для однолабораторной валидации.
Эти валидационные эксперименты были сосредоточены на разделении и обнаружении BMAA и его изомеров и не были направлены на устранение несоответствий в протоколах подготовки образцов. Lage et al.27 сравнили эффективность трех распространенных методов экстракции для количественной оценки BMAA и его изомеров в цианобактериальных образцах с помощью LC-MS/MS: твердофазная экстракция (SPE) свободных аминокислот28,29; метод осаждения белка, включающий экстракцию метанола и осаждение ацетона30; и наиболее часто используемый метод экстракции для BMAA, осаждение белка трихлоруксусной кислотой (TCA)31. Они пришли к выводу, что осаждение белка TCA является оптимальным протоколом, дающим более высокие концентрации BMAA в тестовых образцах по сравнению с другими методами экстракции. Их исследование подтвердило экстракцию TCA с дериватизацией BMAA с использованием 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбамата (AQC) в матрице цианобактерий, обеспечивая установленное руководство для достижения надежных и воспроизводимых данных BMAA. Экстракция аминокислот TCA является общепринятым и распространенным методом подготовки образцов, который также может быть применен к другим матрицам. Однако стабильность аминокислоты во время гидролиза необходимо учитывать для предотвращения деградации или окисления, которое может быть преодолено с использованием химических модификаторов и восстановителей32. Извлечение TCA регулярно используется и преподается новым студентам-исследователям, и хотя протокол широко освещается, визуальное пособие в применении этого метода является ценным ресурсом, обеспечивающим правильное и последовательное выполнение.
Обратная фазовая хроматография обычно используется для разделения аминокислот, требуя этапа дериватизации перед анализами. Дериватизация аминокислот, таких как BMAA, обеспечивает хроматографическое удержание и может увеличить разрешение между изомерами. Он также увеличивает молекулярную массу и улучшает ионизацию в масс-спектрометре. Несколько производных реагентов были использованы для анализа аминокислот через LC-MS/MS, включая пропилхлорформиат (PCF)33, 6-аминохинолил-N-гидросукцинимидилкарбамат (AQC)27, 9-фторфенилметилхлорформиат (FMOC)34 и дансилхлорид (DC)35. Однако единственными проверенными методами анализа BMAA в качестве дериватизирующего реагента использовались либо PCF36, либо AQC 24,26,37.
Сфера применения этого протокола сосредоточена на извлечении TCA NPAA из цианобактериальных матриц. Это трудоемкий метод, который обычно используется и преподается в академических и отраслевых исследовательских лабораториях на основе рукописей, которые могут быть короткими в деталях; поэтому этот протокол содержит подробную информацию о процедуре и методах, используемых при подготовке образцов для анализа свободного и связанного BMAA в качестве модельной аминокислоты.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL glass shell vials</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>REST-24663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.3% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>BR780546-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mM HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z740441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 M HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.11727</td>
			<td>Dilute 70:1 Ethanol:water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C Freezer</td>
			<td>Martin CHRIST</td>
			<td>102142</td>
			<td>Alpha 2-4 Ldplus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>34967-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale Balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal evaporator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13442549</td>
			<td>DNA120-115 SpeedVac Concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP022620100-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D5-2,4-DAB standard</td>
			<td>CDN Isotopes</td>
			<td>D-7568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>CEO-8492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T2318-500EA</td>
			<td>Greiner centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS8161-100EA</td>
			<td>Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass engraver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrolysis vial &#38; Lid</td>
			<td>Eldex Laboratories/Waters</td>
			<td>WAT007568 &#38; WAT007569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice and container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper wipe</td>
			<td>Kimwipes/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.2 M&#937;.cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen tap with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000055-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - noise cancelling headphones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - oven gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td>QSONICA Sonicators</td>
			<td>Q125 Sonicator</td>
			<td>Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample transfer spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis

Небелковые аминокислоты (NPAA) представляют собой большой класс аминокислот (AAs), которые генетически не кодируются для трансляции в белки. Анализ NPAA может предоставить важную информацию о поглощении и/или функции клеток, метаболических путях и потенциальной токсичности. β-метиламино-L-аланин (BMAA) является нейротоксичным NPAA, продуцируемым различными видами водорослей и связанным с повышенным риском нейродегенеративных заболеваний, что привело к значительному исследовательскому интересу. Существует множество способов извлечения АА для анализа, причем жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия является наиболее распространенной, требующей осаждения белка с последующим кислотным гидролизом белковой гранулы. Исследования присутствия BMAA у видов водорослей дают противоречивые результаты, при этом основной причиной является использование непроверенной пробоподготовки/экстракции и анализа. Как и большинство НПДА, осаждение белка в 10% водном ТЦА и гидролиз с дымящимся HCl является наиболее подходящей формой экстракции для BMAA и его изомеров аминоэтилглицина (AEG) и 2,4-диаминомасляной кислоты (2,4-DAB). Настоящий протокол описывает этапы валидированного метода экстракции NPAA, обычно используемого в исследовательских и учебных лабораториях.

Иллюстрация протокола извлечения приведена на рисунке 2 в виде сводного справочного руководства. Результаты, полученные Violi et al.38 , были выбраны для представления положительного результата этого протокола экстракции для анализа изомеров BMAA из цианобактерий. Девятнадцать видов цианобактерий были культивированы из 11 пресноводных участков восточной австралии. Используя тот же протокол, изомеры BMAA экстрагировали в свободные и белковые фракции, дериватизировали с PCF и анализировали с использованием LC-MS / MS. Семнадцать цианобактериальных изолятов были положительными для BMAA, и все 19 содержали изомер 2,4-DAB. Положительный результат подтверждается использованием валидированного метода LC-MS/MS и наблюдением по меньшей мере трех переходов множественного мониторинга реакций (MRM), один в качестве иона квантора и два в качестве ионов-квалификаторов в ожидаемое время удержания. Репрезентативная Хроматограмма МРМ стандарта, содержащего BMAA и его изомеры, обозначенная цветными линиями, показана на рисунке 3. Наличие и концентрация BMAA и изомеров во всех 19 образцах, разделенных для демонстрации концентрации BMAA и изомеров в свободных и связанных фракциях, обобщены в таблице 1. Положительное обнаружение всех трех изомеров наблюдалось в свободной фракции видов Merismopedia , собранных в озере Лидделл (Новый Южный Уэльс, Австралия), где свободная фракция содержала концентрацию BMAA 68,38 мкг/г сухого веса (DW) ± 2,25 мкг/г DW, 2,4-DAB с концентрацией 1 223,98 мкг/г DW ± 20,7 мкг/г DW, и ЭЭГ с концентрацией 125,27 мкг/г DW ± 4,19 мкг/г DW. Хроматографические МРТ показаны на рисунке 4. Чтобы проиллюстрировать отрицательный результат для BMAA и его изомеров в образце, связанная фракция видов Microcystis flos-aquae , собранная с Walka Water Works (Новый Южный Уэльс, Австралия), хроматографически представлена на рисунке 5. В то время как связанная фракция не содержала BMAA, 2,4-DAB и/или AEG, ее свободная фракция содержала все три изомера с концентрациями 79,86 мкг/г DW ± 1,59 мкг/г DW, 1 156,15 мкг/г DW ± 8,46 мкг/г DW и 433,83 мкг/г DW ± 8,92 мкг/г DW соответственно.
Таким образом, используя этот протокол, Violi et al.38 подтвердили наличие изомеров BMAA в пресноводных цианобактериях восточной Австралии и определили, какие цианобактерии обладают токсин-продуцирующей способностью.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig01.jpg"> Рисунок 1: Химическая структура BMAA и его изомеров 2,4-DAB и AEG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig02.jpg"> Рисунок 2: Сводная справочная схема протокола извлечения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig03.jpg"> Рисунок 3: Хроматограмма LC-MS/MS калибровочного стандарта, содержащего D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA и AEG для идентификации изомеров на основе удержания, обозначенного выделенными пиками. Ключ: D5-2,4-DAB 338,01 м/з > 278,10 м/з при 6,4 мин (красный), 2,4-DAB 333,01 м/з > 273,10 м/з при 6,4 мин (зеленый), AEG 333,01 м/з > 88,00 м/з при 7,4 мин (оранжевый) и BMAA 333,01 м/з > 187,10 м/з при 7,8 мин (синий). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig04.jpg"> Рисунок 4: Хроматограмма LC-MS/MS для обнаружения D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA и AEG у видов Merismopedia , собранных в озере Лидделл (Новый Южный Уэльс, Австралия), на которые указывают выделенные пики. Ключ: D5-2,4-DAB 338,01 м/з > 278,10 м/з при 6,4 мин (красный), 2,4-DAB 333,01 м/з > 273,10 м/з при 6,4 мин (зеленый), AEG 333,01 м/з > 88,00 м/з при 7,4 мин (оранжевый) и BMAA 333,01 м/з > 187,10 м/з при 7,8 мин (синий). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig05.jpg"> Рисунок 5: Хроматограмма LC-MS/MS отрицательного контроля для 2,4-DAB, BMAA и AEG в связанной фракции видов Microcystis flos-aquae, собранных на Walka Water Works (Новый Южный Уэльс, Австралия). Ключ: D5-2,4-DAB 338,01 м/з > 278,10 м/з при 6,4 мин (красный - пик выделен), 2,4-DAB 333,01 м/з > 273,10 м/з при 6,4 мин (зеленый), AEG 333,01 м/з > 88,00 м/з при 7,4 мин (оранжевый) и BMAA 333,01 м/з > 187,10 м/з при 7,8 мин (синий). Пунктирные линии представляют время удержания отсутствующих 2,4-DAB, AEG и BMAA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Таблица 1: Концентрации BMAA, AEG и 2,4-DAB в цианобактериальных изолятах. Концентрации ± стандартной погрешности среднего значения (n = 3). ND обозначает не обнаруженный. Самая высокая концентрация каждого обнаруженного изомера выделена зеленым цветом. Таблица является модифицированной версией из Violi et al.38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779_Table%201.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Настоящий протокол описывает экстракцию небелковых аминокислот из биологических матриц посредством осаждения белка трихлоруксусной кислотой (ТЦА) и кислотного гидролиза перед анализом с использованием жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии.

Экстракция небелковых аминокислот из цианобактерий для жидкостной хроматографии-тандемного масс-спектрометрического анализа

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

Этот протокол поможет пользователям и научит студентов правильным шагам в извлечении BMA, AEG и 2, 4-DAB. Тем самым сводя к минимуму вероятность ошибки и получая последовательные результаты. Этот метод является широко используемым и проверенным методом экстракции BMA и его изомеров, AEG и 2, 4-DAB в бактериальной матрице сауны.Этот метод может быть использован для дальнейших исследований токсичности BMA и обеспечения лучшего понимания BMA и связанных с ним последствий для здоровья. Начните с центрифузии образца цианобактерий с 3 500 г в течение 10 минут при 25 градусах Цельсия. И выбрасывание супернатанта в биологические отходы.Накройте трубку центрифуги, содержащую гранулу, уплотнительной пленкой и проткните несколько отверстий в пленке с помощью острого длинного носового пинцета. Затем храните трубку в вертикальном положении при минус 80 градусах Цельсия. Через 30 минут поместите трубку вертикально в стеклянный контейнер сублимационной сушилки и поместите контейнер в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов Цельсия на пять минут для охлаждения.Извлеките стеклянную емкость из морозильной камеры и прикрепите резиновую крышку. Убедитесь, что ручка на выходе резинового клапана сублимационной сушилки направлена вверх и вышла в атмосферу. Плотно прикрепите стеклянную емкость.Медленно поверните ручку выходного отверстия резинового клапана, чтобы направить его в положение вниз, чтобы подвергнуть банку воздействию вакуума. И дайте до 24 часов сублимационной сушки, чтобы сублимировать всю жидкость. Когда это будет сделано, взвесьте от 15 до 50 миллиграммов замороженных гранул образца в 15-миллилитровую центрифужную трубку.Использование аналитического баланса. К образцу добавляют от 300 до 600 микролитров 10% водной трихлоруксусной кислоты или ТЦА. Поместите пробоотборники в контейнер, наполненный измельченным льдом.Протрите зонд ультразвуковика безворсовой бумажной салфеткой, распыленной 70% этанолом, прежде чем полностью погрузить конец зонда в образец и нажать на начало. После этого поместите образец, содержащий трубку центрифуги, на лед на одну минуту. И повторите процесс обработки ультразвуком, чтобы обеспечить лизис клеток.После охлаждения образца при четырех градусах Цельсия в течение 24 часов. Центрифуга при 3, 500 G в течение 15 минут при восьми градусах Цельсия. Затем, используя микропипетку, переведите супернатант в двухмиллилитровую трубку, помеченную свободной фракцией.Добавьте 400 микролитров 10% водного ТЦА в гранулу образца и разбейте гранулу либо вихревым перемешиванием, либо наконечником микропипетки. Центрифугируйте и перенесите супернатант в ту же двухмиллилитровую трубку свободной фракции. Повторите этот шаг в третий раз, используя 10%TCA ацетон.Поместите трубку со свободной фракцией с открытой крышкой в центробежный испаритель до тех пор, пока вся летучая жидкость не будет удалена. Как только образец освободится от летучих жидкостей, надежно накройте трубку потолочной пленкой и проткните пленку несколькими отверстиями, используя острый длинный носовой пинцет. После сублимационной сушки, продемонстрированной ранее, восстановите образец с 200 микролитрами 20-миллиметровой соляной кислоты и поместите его в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов цельсия.Добавьте 400 микролитров 100% ацетона на гранулу образца с помощью микропипетки и разбейте гранулу с помощью либо вихревого перемешивания, либо наконечника микропипетки. Количественно переложить промытую и повторно суспендированную гранулу в соответствующий стеклянный флакон оболочки. Используя одну миллилитровую микропипетку.Добавьте еще 400 микролитров ацетона в пробирку, чтобы помочь перенести оставшуюся гранулу. Центрифугируйте и декантируйте жидкость супернатанта в биологические отходы перед сушкой гранулы в центробежном испарителе до тех пор, пока жидкость не будет удалена и гранула не высохнет. Для приготовления вакуумного гидролизного файла добавляют один миллилитр шести молярных соляных кислот на дно файла гидролиза.Аккуратно вставьте меченые флаконы с высушенными образцами в гидролизный файл с помощью пинцета, обеспечивающего вертикальное устойчивое положение. Прикрепите крышку к файлу гидролиза и нажмите красную ручку на крышке, чтобы закрыть клапан. После включения вакуумного насоса прикрепите вакуумную трубку к головке крышки гидролизного файла и нажмите зеленую ручку на крышке, чтобы открыть клапан.Затем позвольте вакуумному насосу удалить воздух из флакона в течение одной минуты. Затем закройте флакон, нажав красной ручкой на крышку флакона для гидролиза. Выключите вакуумный насос и снимите вакуумную трубку.Прикрепите резиновую трубку к крану газообразного азота на лабораторном стенде. И слегка откройте кран. Поместите большой палец на конец трубки, запечатайте его и считайте, пока газ не начнет выходить по мере повышения давления.Затем прикрепите другой конец резиновой трубки к головке крышки флакона для гидролиза. И сразу же нажмите зеленую ручку крышки. Подсчитайте время, необходимое для выхода газа.Быстро нажмите красную ручку на крышку и снимите резиновую трубку. Повторите весь процесс вакуумной обработки дважды. Обеспечение того, чтобы флакон для гидролиза стекла был свободен от воздуха и заполнен газообразным азотом.Поместите флакон с гидролизом в предварительно нагретую духовку, установленную при температуре 110 градусов Цельсия, на 16-18 часов. С помощью перчаток для духовки извлеките флакон с гидролизом стекла из духовки. Дайте флакону остыть внутри вытяжного шкафа в течение 10 минут, прежде чем толкать зеленую ручку, отклоняясь от нее, чтобы выпустить давление и газ.Восстановите гидролизованные гранулы образца с 200 микролитрами 20 молярной соляной кислоты во флакон оболочки и повторно суспендируйте гранулу. Центрифугируйте оболочку флаконов, содержащих восстановленный образец гранул, в течение двух минут при 5, 300 г и 25 градусах Цельсия. Перенесите восстановленные образцы свободной фракции и белковой фракции в две миллилитровые фильтрующие трубки, содержащие мембранные фильтры длиной 0,2 микрона и помеченные как свободная фракция и белковая фракция.Поместите трубки для центрифугирования на 30 минут при 5 000 G и 25 градусах Цельсия. Здесь показана множественная хроматограмма мониторинга реакций стандарта, содержащего бета-метиламино-L-аланин или BMAA и его изомеры, обозначенные цветовыми кодированными линиями. Положительное обнаружение всех трех изомеров, BMAA, DAB и AEG наблюдалось в свободной части видов Merismopedia, собранных из озера Лиддел.Принимая во внимание, что связанная фракция видов Microcystis flos-aquae, собранная с гидротехнического сооружения Вака, проиллюстрировала отрицательный результат для BMAA и его изомеров. Повторно суспендированная гранула должна быть количественно перенесена в соответствующий флакон оболочки, чтобы обеспечить точную точку нормализации на основе массы цианобактерий. Пациенты и должная осмотрительность рекомендуются при выполнении этого шага.Следуйте этой процедуре. Извлеченные фракции должны будут пройти стадию девитализации, чтобы обеспечить обратную фазу. Жидкостная хроматография, тандемный масс-спектрометрический анализ.Применение данной методики расширяет различные научные области. В том числе науки об окружающей среде через анализ цинотоксинов в образцах окружающей среды. И такие области, как токсикология и биохимия через исследование теории Misincorporation BMA.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Крупномасштабная Нецелевые Metabolomic профилирование сыворотки Ultra Performance жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Нецелевые Метаболомики из биологических источников Использование UltraPerformance жидкостной хроматографии высокого разрешения масс-спектрометрии (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Использование капиллярный электрофорез для Количественно органических кислот из растительных тканей: Случай испытания экспертизы<em&gt; Арабика</em&gt; Семена

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

HS-мно Assay для количественного определения белков клетки хозяина в области биофармацевтики белка по жидкостной хроматографии ионной подвижности QTOF масс-спектрометрии

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Прямолинейный метод глюкозинолатов экстракции и анализа с высоким давлением жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

Fizzy Extraction of Volatile Organic Compounds Combined with Atmospheric Pressure Chemical Ionization Quadrupole Mass Spectrometry

Физзи-экстракция летучих органических соединений в сочетании с химическим ионизацией при атмосферном давлении. Квадрупольная масс-спектрометрия

Chemical analysis of volatile and semivolatile compounds dissolved in liquid samples can be challenging. The dissolved components need to be brought to ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Анализ реального времени дыхание с помощью вторичных Nanoelectrospray ионизации в сочетании с масс-спектрометрии высокого разрешения

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Синтез и анализ масс-спектрометрии Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Водородно-дейтериевый обмен на основе капиллярного электрофореза для конформационной характеристики белков с помощью масс-спектрометрии сверху вниз

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Curation of Computational Chemical Libraries Demonstrated with Alpha-Amino Acids

Курирование вычислительных химических библиотек, демонстрируемых с помощью альфа-аминокислот

Exhaustive generation of molecular structures has numerous chemical and biochemical applications such as drug design, molecular database construction, ...