Name: extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-12-09T12:40:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

D.P.B., K.J.R. och S.M.M. stöds av The Ian Potter Foundation, och J.P.V. är mottagare av ett australiensiskt regeringsforskningsutbildningsprogram, Stipend.

Cyanobakteriearten Merismopedia användes för den aktuella studien38.
1. Beredning av råprov
<ol><li>Samla algskummet från den vattenlevande källan av intresse eller från en cyanobakteriell odlad kolv och placera den i 50 ml centrifugrör38. Anmärkning: Provet måste frysas vid −20 °C för senare extraktioner och tinas före följande steg.</li>
	<li>Centrifugera rören som innehåller provet vid 3 500 x g i 10 minuter vid 25 °C. Dekantera supernatanten i en avfallsbehållare och kasta den i biologiskt avfall. OBS: Supernatanten kan vara reserverad för framtida analys av exosomen.</li>
	<li>Täck röret som innehåller provpelleten ordentligt med en tätningsfilm (se materialtabell) och genomborra några hål i filmen med en vass, lång näspincett. Förvara röret i upprätt läge vid −80 °C i 30 minuter.</li>
	<li>Slå på och jämna ut frystorken vid 0,1 mbar och −80 °C (~30 min). OBS: Parametrarna (steg 1.4) är optimerade för frystorken som används för denna studie (se Materialförteckning). Följ standardrutiner enligt frystorksmodellen som finns i laboratoriet eller ställ in lägsta möjliga temperatur om frystorkmodellen inte går så lågt som −80 °C.<ol><li>Placera centrifugröret eller centrifugrören upprätt i en frystorkglasbehållare och placera det i frysen −80 °C i 5 minuter för att kyla burken.</li>
		<li>Ta bort glasbehållaren från frysen och fäst gummilocket.</li>
		<li>Se till att handtaget på frystorkens gummiventilutlopp ventileras till atmosfären (pekar uppåt) och fäst glasbehållaren ordentligt.</li>
		<li>Vrid handtaget på gummiventilutloppet mycket långsamt till pekläget nedåt för att utsätta burken för vakuumet och tillåt upp till 24 timmars frystorkning för att säkerställa sublimering av all vätska.</li>
		<li>För att släppa vakuumet i burken, vrid handtaget till pekläget uppåt, lossa glasbehållaren och ta bort de frystorkade proverna.</li>
	</ol></li>
	<li>Använd en analysvåg för att väga in 15–50 mg torkade provpellets i ett 15 ml centrifugrör. Anmärkning: Proverna får placeras i −80 °C om de inte bearbetas ytterligare i detta skede.</li>
</ol>2. Celllysering och fraktionering av fria NPAA
<ol><li>Tillsätt 100 μl 100 ng/ml D5-2,4-DAB-standard (se materialförteckning) med hjälp av en mikropipett till provröret (valfritt).</li>
	<li>Tillsätt 300–600 μl 10 % vattenhaltigt triklorättiksyra (TCA, se materialtabell) respektive 300–600 μl 11,7–13,3 % TCA om D5-2,4-DAB-standarden läggs till. OBS: Välj en volym vattenhaltig TCA som helt täcker pelleten.</li>
	<li>Placera provrören i en behållare fylld med krossad is.</li>
	<li>Använd en sondsonicator (se materialtabell) vid medelhög effekt (70%) och lyse provet i 1 min enligt stegen nedan. VARNING: Se till att personlig skyddsutrustning är korrekt med hjälp av brusreducerande hörselkåpor.<ol><li>Följ lämpliga säkerhetsprotokoll som förberedelse för användning av sonden sonicator genom att placera i bruk skyltar på dörren, utföra ultraljudsbehandling i dragskåpet och använda brusreducerande hörselkåpor.</li>
		<li>Slå på sonicator och ange följande parametrar: amplitud, 70%; tid, 1 min.</li>
		<li>Spraya 70 % etanol på en luddfri papperstork (se Materialförteckning) och torka av sonden.</li>
		<li>Sänk ner sondens ände helt i provet och tryck på start.</li>
		<li>När sondsonicator stannar, placera centrifugröret som innehåller provet på is i 1 min.</li>
		<li>För att säkerställa att cellerna lyserar, upprepa steg 2.4.3-2.4.5 en gång till.</li>
	</ol></li>
	<li>Ställ provet i kylskåp vid 4 °C i 12–24 timmar för att möjliggöra proteinutfällning.</li>
	<li>Centrifugera det 10 % vattenhaltiga TCA-provet vid 3 500 x g i 15 minuter vid 8 °C.</li>
	<li>Använd en mikropipett för att överföra supernatanten till ett 2 ml rör märkt "Free Fraction".</li>
	<li>Mikropipettera 400 μl 10% vattenhaltig TCA i centrifugröret som innehåller den återstående provpelleten och bryt upp pelleten antingen genom virvelomrörning eller med mikropipettspetsen.</li>
	<li>Upprepa steg 2.6-2.7 och överför supernatanten till samma 2 ml "Free Fraction" -rör.</li>
	<li>Mikropipettera 400 μl 10% TCA/aceton i centrifugröret med den återstående pelleten och bryt upp pelleten med virvel eller mikropipettspetsen.</li>
	<li>Centrifugera 10 % TCA/acetonprovet vid 3 500 x g i 15 minuter vid 8 °C. Använd en mikropipett för att överföra supernatanten till 2 ml röret märkt "Free Fraction".</li>
	<li>Placera röret "Free Fraction" med locket öppet i en centrifugalindunstare (se materialförteckning) tills alla flyktiga vätskor har tagits bort (minst 1 h).</li>
	<li>När provet är fritt från flyktiga vätskor, täck röret ordentligt med tätningsfilm och genomborra filmen med några hål med en skarp, lång näspincett. Placera provet i en frys på −80 °C.</li>
	<li>Frystorka provet "Free Fraction" genom att upprepa alla steg i steg 1.4.</li>
	<li>Mikropipettera 200 μl 20 mM saltsyra (HCl) i röret "Free Fraction" för att rekonstituera det frystorkade provet och placera det i −80 °C frysförvaring. OBS: Den "fria fraktionen" av provet är klar för filtrering i steg 4. Den återstående pelleten kommer att bearbetas ytterligare i följande steg för proteinfraktionering.</li>
</ol>3. Fraktionering av de proteinbundna NPAA:erna
<ol><li>Använd en glasgraverare för att märka flaskor med glasskal med provdetaljerna för identifiering. OBS: Stark syra kan sprida bläckmärkning; Därför rekommenderas gravering av etiketterna på glas.</li>
	<li>Mikropipett 100 μL 100 ng/ml D5-2,4-DAB-standard på provpelleten (valfritt).</li>
	<li>Mikropipettera 400 μl 100% aceton på provpelleten och bryt upp pelleten med antingen virvelomrörning eller mikropipettspetsen.</li>
	<li>Använd en 1 ml mikropipett inställd på 1 000 μl för att överföra den tvättade och återsuspenderade pelleten till motsvarande injektionsflaska med glasskal. OBS: Ytterligare 400 μl 100% aceton kan tillsättas till den omrörda pelleten för att hjälpa till med fullständig överföring av pelleten till injektionsflaskan med glasskal. Detta kan upprepas en tredje gång om det behövs.</li>
	<li>Centrifugera vid 8 000 x g i 5 minuter vid 25 °C och dekantera vätskan till biologiskt avfall.</li>
	<li>Placera den återstående pelleten i en centrifugalindunstare tills all vätska har tagits bort och pelleten är torr (~ 1 h).</li>
	<li>Bered injektionsflaskan med vakuumhydrolys genom att tillsätta 1 ml 6 M HCl i botten av hydrolysflaskan.</li>
	<li>Använd pincett för att försiktigt föra in de märkta injektionsflaskorna med skal som innehåller de torkade proverna i hydrolysflaskan, vilket säkerställer en upprätt, stabil position. OBS: Injektionsflaskor med tom skal kan användas för att hålla provflaskorna upprätt om antalet prover är mindre än kapaciteten hos hydrolysflaskan.</li>
	<li>Fäst locket på hydrolysflaskan och tryck på den röda ratten på locket för att stänga ventilen.</li>
	<li>Slå på vakuumpumpen, fäst vakuumröret på huvudet på hydrolysflaskans lock och tryck på den gröna ratten på locket för att öppna ventilen.</li>
	<li>Låt vakuumpumpen (se materialförteckningen) ta bort luften från injektionsflaskan i 1 min.</li>
	<li>Stäng injektionsflaskan genom att trycka ner den röda vredet på locket till hydrolysflaskan, stäng av vakuumpumpen och ta bort vakuumröret.</li>
	<li>Fäst ett gummirör på kvävgaskranen på laboratoriebänken och öppna kranen något. Placera tummen vid rörets ände, försegla den och räkna tills gasen börjar fly när trycket byggs upp. Detta kommer att vara tidsramen för nästa steg. Justera gasflödet till en lämplig tidsram.</li>
	<li>Fäst den andra änden av gummiröret på huvudet på hydrolysflaskans lock och tryck sedan omedelbart på lockets gröna vred. Räkna till den tid som bestäms i steg 3.13 och tryck snabbt på den röda ratten på locket och ta bort gummiröret.</li>
	<li>Upprepa steg 3.10-3.14 två gånger för att säkerställa att injektionsflaskan med hydrolys av glas är fri från luft och fylld med kvävgas.</li>
	<li>Placera hydrolysflaskan i en förvärmd ugn inställd på 110 ° C i 16-18 timmar.</li>
	<li>Använd ugnshandskar för att ta bort flaskan med hydrolys av glas från ugnen och låt den svalna inuti dragskåpet i 10 minuter. Inuti dragskåpet, medan du vänder den bort från dig, tryck på den gröna ratten för att släppa ut tryck och gas.</li>
	<li>Använd pincett för att ta bort skalflaskorna från hydrolysflaskan.</li>
	<li>Rekonstituera de hydrolyserade provpelletsen genom mikropipettering av 200 μl 20 mM HCl i injektionsflaskan med skal. Se till att pelleten återsuspenderas genom att antingen virvla eller använda en pipettspets.</li>
	<li>Centrifugera injektionsflaskorna med skalet som innehåller de färdigberedda pelarna i 2 minuter vid 5 300 x g och 25 °C.</li>
</ol>4. Exempel på filtrering
<ol><li>Märk 2 ml filterrör (se materialtabell) som innehåller 0,2 μm pormembranfilter som "Free Fraction" och "Protein Fraction".</li>
	<li>Överför de färdigberedda proverna från steg 2.15 (fri fraktion) och steg 3.20 (proteinfraktion) till motsvarande filterrör.</li>
	<li>Placera dem i centrifugen i 30 minuter vid 5 000 x g och 25 °C.</li>
	<li>Ta bort filtren från filterrören och täck dem. Proverna är nu klara för aminosyraderivatisering i steg 5. OBS: Proverna kan placeras i −80 °C frysen för förvaring för senare derivatisering och analys.</li>
</ol>5. Aminosyra derivatisering
<ol><li>Härled proverna med propylkloroformate (PCF)39 eller 6-aminokinolyl-N-hydrosysuccinimidylkarbamat (AQC)40 enligt tillverkarens anvisningar (se materialförteckning).</li>
</ol>

Författarna har inget att avslöja.

Extraktionsprotokollet som beskrivs här för analys av NPAA gäller för att analysera aminosyror i biologiska prover. För guider om isolering och odling av cyanobakteriella stammar kan man hänvisa till de metoder som presenteras i studien av Violi et al.38. Det första steget i protokollet tar provet till en punkt där normalisering mellan proverna mot torrvikten kan uppnås. Det andra steget är celllys för att frigöra analyterna och kan utföras med hjälp av en rad tekniker, inklusive mekaniska störningar / lyser såsom sondsljudsbehandling som beskrivs i detta protokoll, frysning / tina cykler, slipning och pärlfräsning och icke-mekaniska störningar såsom enzymatisk, tvättmedel och / eller kemisk lys. Mekanisk störning är känd för att vara fördelaktig jämfört med icke-mekanisk eftersom det möjliggör en större kapacitet hos provet att lysera samtidigt som de intracellulära bindningarna och proteinerna kan förbli intakta41, även om provmatrisen kan diktera den optimala metoden för celllysering.
Proteinutfällning är det kritiska tredje steget i detta protokoll vid extraktion av aminosyror för analys. TCA är det vanligaste lösningsmedlet; Perklorsyra, aceton, metyltertbutyleter (MTBE), metanol och/eller acetonitril 8,42 har emellertid också använts, där varje extraktionsmedel är avsett att extrahera och fälla ut olika substrat. Modellen som beskrivs här extraherar NPAA BMAA och dess isomerer från en cyanobakteriell matris, och även om en rad olika lösningsmedel har använts, är de två vanligaste 10% TCA i vatten (vattenhaltigt) och 10% TCA i aceton. I allmänhet används proteinutfällning med TCA vanligtvis för att extrahera aminosyror för att fraktionera fria aminosyror från de proteinbundna aminosyrorna. Dessutom möjliggör TCA-extraktion att bestämma det totala proteininnehållet, minska föroreningar för den fria fraktionen och minska aktiviteten hos proteaser med minimal proteinnedbrytning43. TCA-extraktionen av den fria fraktionen fungerar genom att initialt skölja ut organiskt lösliga ämnen och lämna efter sig proteiner och olösliga föreningar såsom cellväggsrester i fällningen, som sedan följs av termisk hydrolysextraktion av de proteinbundna aminosyrorna (bunden fraktion) med användning av en stark syra.
Fraktioneringen av den fria fraktionen med 10% vattenhaltig TCA plus ultraljudsbehandling ger den mest omfattande proteinutfällningen jämfört med andra organiska lösningsmedel44 och den bästa aminosyran återvinner42. Vissa studier väljer att använda en syra i kombination med ett organiskt lösningsmedel (dvs. 10% -20% TCA i aceton 43) för att fälla ut fler molekyler, inklusive mindre peptider / biomolekyler, minimera proteinnedbrytning och minska föroreningar som salter43. En annan fördel med 10% TCA i aceton är dess snabbare torkningshastighet vid framställning av pelleten för hydrolys, vilket minimerar fuktrester för att förhindra aminosyramodifiering. Emellertid, 10% vattenhaltiga TCA plus ultraljudsbehandling har bättre extraktion effektivitet av fria aminosyror jämfört med 10% TCA i aceton44 ensam. Dessutom har 10% vattenhaltig TCA-utfällning begränsningar som en lång torkningstid, att inte kunna fälla ut alla proteiner eller små peptider / biomolekyler, och beroende på analyten av intresse (dvs. proteiner eller aminosyror), vilket kräver tillsatser och reduktionsmedel för att förhindra oxidation och nedbrytning45,46.
Detta protokoll använder en kombination av 10% vattenhaltig TCA och 10% TCA i aceton för att öka proteinutfällningen, säkerställa att mindre peptider / biomolekyler fälls ut, möjliggöra snabbare pelletstorkningstider och öka extraktionseffektiviteten och dra nytta av båda lösningsmedelsextraktionsegenskaperna. Kombinationen av 10% vattenhaltig TCA och 10% TCA i aceton kan dock fälla ut små peptider/biomolekyler i den fria fraktionen efter att 10% TCA i acetonsupernatant kombineras med den vattenfria fraktionen. I detta fall bör utfällningarna överföras till den bundna fraktionen för hydrolys.
Den andra halvan av detta protokoll involverar frisättning av aminosyror (dvs BMAA) från proteinpelleten via syra-ånghydrolys vid förhöjda temperaturer i en syrefri miljö. Den övervägande begränsande faktorn för hydrolyssteget är att det är tidskrävande och mödosamt att förbereda. Inkubationen över natten förhindrar snabb och tidseffektiv provberedning och analys. Dessutom är den kvantitativa överföringen av pelleten från ett centrifugrör till en skalflaska (steg 3.4) en mödosam process som kräver noggrannhet och tålamod för att säkerställa en korrekt normaliseringspunkt till torrvikten. Möjliga problem som användaren kan möta är den ofullständiga överföringen av pelleten, våtfällda proteiner som fastnar på pipettspetsar och det ursprungliga röret och fasta partiklar av pelleten som blockerar pipettspetsen. Ett praktiskt förslag för att underlätta överföringen av pelleten är att ta bort cirka 0,3-0,5 mm från pipettspetsens ände med en sax, så att större pelletspartiklar kan dras och släppas ut i skalflaskan. Denna överföringsmetod är vanlig för proteinextraktion för alla aminosyraanalyser. Ändringar för att förbättra effektiviteten och noggrannheten vid kvantitativ överföring av pelleten till injektionsflaskan med skal bör dock undersökas.
Två former av hydrolystekniker kan användas för att frigöra aminosyror från deras proteinbundna tillstånd: vätskefashydrolys och syra-ånghydrolys. Vätskefashydrolys, som innebär tillsats av 6 M HCl på provet, som sedan placeras i en ugn på 110 °C över natten, är ett alternativ till den syra-ånghydrolys som beskrivs i detta protokoll. Extraktionstekniker som använder vätskefashydrolys kan kräva ytterligare bearbetning, såsom avsaltning, särskilt om AQC-derivatisering väljs, eftersom det kräver grundläggande villkor för märkningav 40. Syra-ånghydrolys undviker avsaltning och ger användaren friheten att välja derivatiseringsteknik vid rekonstituering av den slutliga pelleten före filtrering. Oberoende av den valda hydrolysmetoden kan proverna dessutom kräva ytterligare bearbetning, såsom SPE för matrisrening och koncentration 29,47,48, beroende på valet av derivatiseringsteknik och/eller analytisk analys (t.ex. omvänd fas LC-MS/MS kontra hydrofil interaktion vätskekromatografi [HILIC] LC-MS/MS 37 ). Rekonstitueringen av den slutliga pelleten i 20 mM HCl i detta protokoll är lämplig för derivatisering med PCF-reagenser48via ett kommersiellt tillgängligt aminosyrahydrolyssats39 (se materialtabell). Både AQC och PCF kommer att derivatisera alla aminosyror, protein och icke-protein i ursprung som finns i provet, och selektiviteten hos analyterna erhålls genom användning av LC-MS / MS och dess kombination av retentionstidsmatchning och noggrant urval av kvantifieraren och kvalificeraren MRM38. 
Nuvarande hydrolysprotokoll är inte optimerade för frisättning av BMAA, 2,4-DAB och AEG utan för de 22 proteinaminosyrorna baserade på befintliga metoder för proteinhydrolys 32, där inkubation längre än 18 timmar resulterar i nedbrytning och modifiering av vissa aminosyror, vilket påverkar LC-MS/MS-analysen och därmed de erhållna koncentrationerna32. Beach et al.49 undersökte hydrolys över tid (0,5-120 h) för att optimera hydrolys för att analysera BMAA och de proteinogena aminosyrorna. De fann att även om det fanns en tidig snabb frisättning av BMAA under de första 0,5 timmarna av hydrolysen, fortsatte BMAA-nivåerna att öka när hydrolystiden ökade, utan nedbrytning, även efter 5 dagar49. Det finns också fortfarande olika åsikter och frågor om den sanna naturen hos bunden BMAA och dess isomerer, med vissa studier som tyder på att snarare än BMAA-bindning 50,51 eller felaktig införlivande i proteiner14, är BMAA-proteinassociation ytlig52. Det nuvarande samförståndet i analysen av "bunden" BMAA kräver emellertid det validerade och allmänt accepterade hydrolyssteget som bryter isär peptider / proteiner för att frigöra aminosyror och därmed BMAA och dess isomerer.
Återvinningsgraden för 20 proteinaminosyror bestämdes i en studie av Sedgwick et al.42 med hjälp av TCA-extraktion, vilket resulterade i cirka 100% återhämtning. När det gäller BMAA och dess isomerer från algmatriser har studier som jämför effektiviteten av BMAA-extraktion med olika extraktionsmedel funnit att 10% TCA är det mest effektiva för gratis BMAA27. Återvinningsgraden för proteinbunden BMAA extraherad med vätskefashydrolys fastställdes i studier av Glover et al.25 och av Faassen et al.53, där noggrannheten bestämdes av spikade återvinningsmetoder, med en genomsnittlig BMAA-återvinningsgrad på 108,6% respektive 70%. beskrev procedurer för spikåtervinningsexperiment och illustrerade hur återhämtningen skiljer sig beroende på skedet i extraktionsprocessen som spetsen gjordes53. bestämde dessutom effektiviteten hos syra-ångprotokollet som presenteras här, med återvinningshastigheter på 83,6% för BMAA-isomererna spikade före extraktion och 68,6% för de som spikades före hydrolys24. Dessa återvinningar, extraktionsmetoder och analyser validerades ytterligare av Banack 26, med återvinningsgrader på 94% -106% för BMAA i en cyanobakteriell matris och en% relativ standardavvikelse (% RSD) mellan 5.6% och20%, som uppfyller FDA: s kriterier för noggrannhet54. Det rekommenderas att varje laboratorium initialt fastställer dess återhämtningshastigheter och noggrannhet innan detta protokoll används via spikåterställningsexperiment. De återvinningsmetoder som presenteras i Faassen et al.53 och Glover et al.25 kan följas som vägledning.
Alternativa former av hydrolystekniker kan utnyttjas istället för ugnshydrolys över natten för snabbare proteinbunden extraktion av analyten. Till exempel kan en mikrovågsugare avsevärt minska hydrolystiden från 24 timmar till så lite som 10 min55. Mikrovågshydrolys för aminosyror använder samma principer som den konventionella termiska metoden, med hjälp av en handskfack för att förbereda och montera mikrovågskärlet i en syrefri miljö och tillsätta 6 M HCl. När det är lufttätt genomgår kärlet som innehåller provet mikrovågsstrålning. Mikrovågshydrolys har använts för att extrahera aminosyror från olika provmatriser56,57,58; mikrovågshydrolys har dock ännu inte utvecklats och validerats för analys av BMAA.
Sammanfattningsvis är 10% vattenhaltig TCA-proteinutfällning den optimala metoden för att extrahera fria icke-proteinaminosyror från cyanobakteriella matriser27, och termisk hydrolys ger en pålitlig och reproducerbar extraktion av den proteinbundna fraktionen. Detta protokoll för att extrahera NPAA BMAA och dess isomerer från cyanobakterier är validerat och allmänt accepterat. Framtida riktningar för att ytterligare optimera extraktionen av BMAA kommer att fokusera på hydrolyssteget, som utförs enligt specifikationerna för de 22 proteinaminosyrorna. Extraktionsprotokollet som presenteras här bör dock fortfarande betraktas som effektivt och effektivt för att analysera BMAA och dess isomerer via LC-MS / MS.

Aminosyror är kemiska föreningar som innehåller minst en amin- och karboxylfunktionell grupp. Vissa aminosyror innehåller också en iminogrupp, en annan funktionell syragrupp än karboxylsyra; Andra aminosyror har amingrupper som inte är bundna till α-kolgrupp1. Det finns över 500 aminosyror2, varav 22 är kända som proteinaminosyror som används för genetisk kodning i ribosomal proteinsyntes3. Dessa 22 aminosyror kan vidare delas in i essentiella och icke-essentiella. Essentiella aminosyror är nödvändiga för att en organism ska fungera korrekt och kan endast förvärvas av externa källor. Icke-essentiella aminosyror kan syntetiseras i organismen. Klassificeringen av de 22 aminosyrorna i essentiella/icke-essentiella är unik för enskilda arter. Alla andra aminosyror är icke-proteinaminosyror (NPAA) som inte kodas för proteinsyntes. Aminosyror, oavsett om de är protein eller icke-protein, kan också spela en signalerande roll i en organism och fungera som metaboliska mellanhänder4. På grund av deras viktiga och varierande roller kan aminosyranivåer ge en inblick i organismens tillstånd, funktionalitet och metaboliska vägar etc. Det finns två huvudmekanismer genom vilka aminosyror kan införlivas i en polypeptidkedja: ribosomal proteinsyntes, som använder de 22 aminosyrorna vid kodning, och icke-ribosomal peptidsyntes, som tillsammans med proteinaminosyror möjliggör användning av vissa NPAA i syntes. Vissa NPAA kan efterlikna proteinaminosyror, vilket kan leda till att de felaktigt införlivas i peptider och proteiner. Misinkorporeringen orsakar en felveckning av proteiner, vilket i sin tur har skadliga effekter5, såsom felaktig införlivande av NPAA L-3,4 dihydroxifenylalanin (L-DOPA) i stället för tyrosin, vilket negativt påverkar cellulär funktion och hälsa 6,7. En ytterligare källa till införlivade NPAA är genom post-translationell modifiering (PTM) av aminosyrarester. Aminosyrarester modifieras av olika skäl, inklusive förändringar i peptid- eller proteinkonformation, stabilitet och funktionalitet. Vid hydrolys av PTM-innehållande protein eller peptider frigörs dessa modifierade aminosyrarester i sin fria NPAA-form 8,9.
NPAA-β-metylamino-L-alanin (BMAA) som produceras av cyanobakterier, kiselalger och dinoflagellater10 är ett misstänkt neurotoxin som är inblandat som en bidragande faktor till olika neurodegenerativa sjukdomar såsom amyotrofisk lateralskleros / parkinsonism-demenskomplex (ALS-PDC) 11,12, amyotrofisk lateralskleros och Alzheimers sjukdom 13 . Det föreslås att BMAA felaktigt införlivas i polypeptidkedjan av proteiner i stället för L-serin14 och/eller andra proteinaminosyror. Misinkorporering av BMAA kan leda till felveckning av proteiner, vilket resulterar i avsättning av proteinaggregat i neuroner14. Under det senaste decenniet har intresset för BMAA ökat avsevärt. Ett brett spektrum av cyanobakteriella arter från sötvatten, marina och bräckta miljöer har upptäckts för att producera BMAA15, vilket leder till deras utbredda utbredning i olika ekosystem16,17. Dessutom har BMAA visat sig biomagnifiera genom livsmedelskedjan till den mänskliga födoväven18,19. På grund av de potentiella hälsoeffekterna, bristen på förståelse och inkongruenser av BMAA-toxicitet är det absolut nödvändigt att fortsätta ytterligare forskning tills antingen toxiciteten hos BMAA slutligen förstås eller BMAA anses vara säker20,21.
Analysen av aminosyror i biologiska prover kan delas in i fyra huvudsteg: provberedning, aminosyraderivatisering, separation och detektion samt identifiering och kvantifiering. Vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS/MS) är den föredragna analysmetoden eftersom den ger en riktad och reproducerbar separation och analys av aminosyror.
Provberedningstekniker för analys av cyanobakteriella och andra algprover involverar huvudsakligen en extraktionsmetod för aminosyror i deras fria och proteinbundna former. Under årens lopp har extraktionsmetoderna förblivit relativt förenliga med vanliga element, inklusive upplösningen av provet för att separera de fria aminosyrorna från deras bundna form, följt av proteinutfällning och frisättning av de bundna aminosyrorna genom hydrolys med saltsyra (HCl) vid förhöjda temperaturer22 . Denna extraktionsform har optimerats för proteinaminosyror och används för NPAA. Detektion och kvantifiering av BMAA och dess isomerer (figur 1), aminoetylglycin (AEG) och 2,4-diaminosmörsyra (2,4-DAB) hos samma art av cyanobakterier har dock visat inkonsekventa resultat i litteraturen, med en möjlig förklaring som ligger i skillnader i tillväxtförhållanden och/eller stam av alger som producerar varierande eller inga mängder BMAA23 . Det har hävdats att en mer sannolik förklaring till inkonsekvenserna i detektionen och kvantifieringen av BMAA och dess isomerer beror på icke-validerade experimentella protokoll, användningen av ett brett spektrum av analystekniker och otillräcklig experimentell detalj i de rapporterade metoderna16,24 som leder till irreproducerbara data mellan laboratorier. Glover et al.25 och Banack 26 har dock nyligen utvecklat och validerat en analytisk teknik för detektion och kvantifiering av BMAA och dess isomerer med hjälp av ultraprestanda vätskekromatografi (UPLC) -MS / MS i enlighet med International Society of Analytical Chemists (AOAC), US Pharmacopeia och FDA-riktlinjer som är nödvändiga för validering av ett laboratorium.
Dessa valideringsexperiment fokuserade på separation och detektion av BMAA och dess isomerer och tog inte upp inkonsekvenserna i provberedningsprotokoll. Lage et al.27 jämförde prestandan hos tre vanliga extraktionsmetoder för kvantifiering av BMAA och dess isomerer i cyanobakteriella prover via LC-MS/MS: fastfasextraktion (SPE) av fria aminosyror28,29; En proteinutfällningsmetod som inbegriper en metanolextraktion och acetonutfällning30. och den vanligaste extraktionsmetoden för BMAA, proteinutfällning med triklorättiksyra (TCA)31. De drog slutsatsen att TCA-proteinutfällningen var det optimala protokollet, vilket gav högre BMAA-koncentrationer i testproverna jämfört med de andra extraktionsmetoderna. Deras studie validerade TCA-extraktion med derivatisering av BMAA med användning av 6-aminokinolyl-N-hydroxisuccinimidylkarbamat (AQC) i en cyanobakteriematris, vilket gav en etablerad guide för att uppnå tillförlitliga och reproducerbara BMAA-data. TCA-aminosyraextraktion är en accepterad och vanlig provberedningsteknik som också kan tillämpas på andra matriser. Aminosyrans stabilitet under hydrolys måste emellertid beaktas för att förhindra nedbrytning eller oxidation, vilket kan övervinnas med användning av kemiska modifierare och reduktionsmedel32. TCA-extraktion används rutinmässigt och lärs ut till nya forskarstudenter, och även om protokollet rapporteras allmänt är ett visuellt hjälpmedel vid tillämpningen av denna metod en värdefull resurs, vilket säkerställer korrekt och konsekvent utförande.
Omvänd faskromatografi används vanligtvis för att separera aminosyror, vilket kräver ett derivatiseringssteg före analyser. Härledningen av aminosyror såsom BMAA möjliggör kromatografisk retention och kan öka upplösningen mellan isomerer. Det ökar också molekylmassan och förbättrar joniseringen i masspektrometern. Flera derivatiserande reagenser har använts för analys av aminosyror via LC-MS/MS, inklusive propylkloroformat (PCF)33, 6-aminokinolyl-N-hydrosysuccinimidylkarbamat (AQC)27, 9-fluorenylmetylkloroformat (FMOC)34 och dansylklorid (DC)35. De enda validerade teknikerna för att analysera BMAA använde dock antingen PCF 36 eller AQC24,26,37 som sitt derivatiserande reagens.
Omfattningen av detta protokoll är inriktat på TCA-extraktion av NPAA från cyanobakteriella matriser. Det är en arbetsintensiv metod som rutinmässigt används och lärs ut i akademiska och industriella forskningslaboratorier baserade på manuskript som kan vara korta på detaljer; Därför ger detta protokoll detaljer om proceduren och teknikerna som är involverade i att förbereda prover för analys av fri och bunden BMAA som modellaminosyra.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL glass shell vials</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>REST-24663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.3% TCA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>BR780546-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mM HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#181;L micropipette</td>
			<td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z740441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 M HCl</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Made from stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.11727</td>
			<td>Dilute 70:1 Ethanol:water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C Freezer</td>
			<td>Martin CHRIST</td>
			<td>102142</td>
			<td>Alpha 2-4 Ldplus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>34967-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale Balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal evaporator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13442549</td>
			<td>DNA120-115 SpeedVac Concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP022620100-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D5-2,4-DAB standard</td>
			<td>CDN Isotopes</td>
			<td>D-7568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>CEO-8492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T2318-500EA</td>
			<td>Greiner centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS8161-100EA</td>
			<td>Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass engraver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrolysis vial &#38; Lid</td>
			<td>Eldex Laboratories/Waters</td>
			<td>WAT007568 &#38; WAT007569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice and container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper wipe</td>
			<td>Kimwipes/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.2 M&#937;.cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen tap with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Micropipette</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>EP3123000055-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette tips</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Z740125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - noise cancelling headphones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE - oven gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td>QSONICA Sonicators</td>
			<td>Q125 Sonicator</td>
			<td>Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample transfer spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump with hose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of non-protein amino acids from cyanobacteria for liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis

Icke-proteinaminosyror (NPAA) är en stor klass av aminosyror (AA) som inte är genetiskt kodade för översättning till proteiner. Analysen av NPAA kan ge viktig information om cellulärt upptag och/eller funktion, metaboliska vägar och potentiell toxicitet. β-metylamino-L-alanin (BMAA) är en neurotoxisk NPAA som produceras av olika algarter och är förknippad med en ökad risk för neurodegenerativa sjukdomar, vilket har lett till betydande forskningsintresse. Det finns många sätt att extrahera AA för analys, med vätskekromatografi-tandemmasspektrometri som den vanligaste, vilket kräver proteinutfällning följt av sur hydrolys av proteinpelleten. Studier av förekomsten av BMAA hos algarter ger motstridiga resultat, med användning av ovaliderad provberedning/extraktion och analys som en primär orsak. Liksom de flesta NPAA är proteinutfällning i 10% vattenhaltig TCA och hydrolys med rökande HCl den mest lämpliga formen av extraktion för BMAA och dess isomerer aminoetylglycin (AEG) och 2,4-diaminosmörsyra (2,4-DAB). Detta protokoll beskriver stegen i en validerad NPAA-extraktionsmetod som vanligtvis används i forsknings- och undervisningslaboratorier.

En illustration av extraktionsprotokollet finns i figur 2 som en sammanfattad referensguide. Resultaten erhållna av Violi et al.38 valdes för att representera ett positivt resultat från detta extraktionsprotokoll för analys av BMAA-isomerer från cyanobakterier. Nitton enskilda arter av cyanobakterier odlades från 11 östra australiensiska sötvattenplatser. Med samma protokoll extraherades BMAA-isomererna till fria och proteinfraktioner, derivatiserades med PCF och analyserades med LC-MS / MS. Sjutton av de cyanobakteriella isolaten var positiva för BMAA, och alla 19 innehöll 2,4-DAB-isomeren. Ett positivt resultat bekräftas genom att använda en validerad LC-MS/MS-metod och observera minst tre övergångar för multipel reaktionsövervakning (MRM), en som kvantifierarjon och två som kvalificerande joner vid den förväntade retentionstiden. Ett representativt MRM-kromatogram av en standard som innehåller BMAA och dess isomerer, som indikeras av de färgkodade linjerna, visas i figur 3. Närvaron och koncentrationen av BMAA och isomerer i alla 19 prover, uppdelade för att visa BMAA- och isomerkoncentrationen i de fria och bundna fraktionerna, sammanfattas i tabell 1. En positiv detektion för alla tre isomererna observerades i den fria fraktionen av Merismopedia-arterna som samlats in från Liddellsjön (NSW, Australien), där den fria fraktionen innehöll en BMAA-koncentration på 68,38 μg/g torrvikt (DW) ± 2,25 μg/g DW, 2,4-DAB med en koncentration på 1 223,98 μg/g DW ± 20,7 μg/g DW, och AEG med en koncentration på 125,27 μg/g DW ± 4,19 μg/g DW. De kromatografiska MRM-värdena visas i figur 4. För att illustrera ett negativt resultat för BMAA och dess isomerer i ett prov presenteras den bundna fraktionen av Microcystis flos-aquae-arterna som samlats in från Walka Water Works (NSW, Australien) kromatografiskt i figur 5. Medan den bundna fraktionen inte innehöll någon BMAA, 2,4-DAB och/eller AEG, innehöll dess fria fraktion alla tre isomererna, med koncentrationer på 79,86 μg/g DW ± 1,59 μg/g DW, 1 156,15 μg/g DW ± 8,46 μg/g DW respektive 433,83 μg/g DW ± 8,92 μg/g DW.
Således, genom användningen av detta protokoll, bekräftade Violi et al.38 närvaron av BMAA-isomerer i östra australiensiska sötvattencyanobakterier och bestämde vilka cyanobakterier som hade toxinproducerande kapacitet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig01.jpg"> Figur 1: Den kemiska strukturen hos BMAA och dess isomerer 2,4-DAB och AEG. Klicka <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig01large.jpg" target="_blank">här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig02.jpg"> Bild 2: Sammanfattat referensdiagram över extraktionsprotokollet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig03.jpg"> Figur 3: LC-MS/MS-kromatogram av en kalibreringsstandard som innehåller D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA och AEG för isomeridentifiering baserad på retention, indikerat av de markerade topparna. Nyckel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z vid 6,4 min (röd), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z vid 6,4 min (grön), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z vid 7,4 min (orange) och BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z vid 7,8 min (blå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig04.jpg"> Figur 4: LC-MS/MS-kromatogram för detektion av D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA och AEG i Merismopedia-arter som samlats in från Liddellsjön (NSW, Australien), indikerat av de markerade topparna. Nyckel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z vid 6,4 min (röd), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z vid 6,4 min (grön), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z vid 7,4 min (orange) och BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z vid 7,8 min (blå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig05.jpg"> Figur 5: LC-MS/MS-kromatogram för en negativ kontroll för 2,4-DAB, BMAA och AEG i en bunden fraktion av Microcystis flos-aquae-arter som samlats in från Walka Water Works (NSW, Australien). Nyckel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z vid 6,4 min (röd - topp markerad), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z vid 6,4 min (grön), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z vid 7,4 min (orange) och BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z vid 7,8 min (blå). De streckade linjerna representerar kvarhållningstiderna för saknade 2,4-DAB, AEG och BMAA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Tabell 1: BMAA-, AEG- och 2,4-DAB-koncentrationer i cyanobakteriella isolat. Koncentrationer ± medelmåttans standardfel (n = 3). ND betecknar inte detekterad. Den högsta koncentrationen av varje isomer som detekteras markeras med grönt. Tabellen är en modifierad version från Violi et al.38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779_Table%201.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Detta protokoll beskriver extraktionen av icke-proteinaminosyror från biologiska matriser via triklorättiksyra (TCA) proteinutfällning och syrahydrolys före analys med vätskekromatografi-tandemmasspektrometri.

Extraktion av icke-proteinaminosyror från cyanobakterier för vätskekromatografi-tandemmasspektrometrianalys

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

Detta protokoll hjälper användare och lär eleverna rätt steg i extraktionen av BMA, AEG och 2, 4-DAB. Därigenom minimerar risken för fel och ger konsekventa resultat. Denna metod är en vanligt förekommande och validerad metod för extraktion av BMA och dess isomerer, AEG och 2, 4-DAB i en bastubakteriematris.Denna metod kan användas för att ytterligare forskning om BMAs toxicitet och ge en större förståelse om BMA och dess associerade hälsoeffekter. Börja med centrifusion cyanobakterieprovet vid 3 500 G i 10 minuter vid 25 grader Celsius. Och kasta supernatanten i biologiskt avfall.Täck centrifugröret som innehåller pelleten med en tätningsfilm och genomborra några hål i filmen med en skarp pincett med lång näsa. Förvara sedan röret upprätt vid minus 80 grader Celsius. Efter 30 minuter, placera röret upprätt i en frystorkglasbehållare och placera behållaren inuti minus 80 grader Celsius frys i fem minuter för kylning.Ta bort glasbehållaren från frysen och fäst gummilocket. Se till att handtaget på frystorkens gummiventilutlopp pekar uppåt och ventileras mot atmosfären. Fäst glasbehållaren ordentligt.Vrid långsamt handtaget på gummiventilutloppet för att rikta det i ett nedåtläge för att utsätta burken för vakuumet. Och låt upp till 24 timmars frystorkning sublimera all vätska. När du är klar, väg 15 till 50 milligram frysta provpellets i ett 15 ml centrifugrör.Använda en analytisk balans. Tillsätt 300 till 600 mikroliter 10% vattenhaltig triklorättiksyra eller TCA till provet. Placera provrören i en behållare fylld med krossad is.Torka av sonicatorsonden med en luddfri pappersservett sprayad med 70% etanol innan du helt nedsänker sondens ände i provet och trycker på start. När du är klar placerar du provet som innehåller centrifugröret på is i en minut. Och upprepa ultraljudsbehandling processen för att säkerställa celllys.Efter kylning av provet vid fyra grader Celsius i 24 timmar. Centrifugera vid 3 500 G i 15 minuter vid åtta grader Celsius. Använd sedan en mikropipett och överför supernatanten till ett två milliliter rör märkt fri fraktion.Tillsätt 400 mikroliter 10% vattenhaltig TCA i provpelleten och bryt upp pelleten antingen genom virvelomrörning eller med mikropipettspetsen. Centrifugera och överför supernatanten till samma två milliliter fria fraktionsrör. Upprepa detta steg en tredje gång med 10% TCA-aceton.Placera det fria fraktionsröret med locket öppet i en centrifugalindunstare tills all flyktig vätska har tagits bort. När provet är fritt från flyktiga vätskor, täck röret ordentligt med takfilmen och genomborra filmen med några hål med en skarp lång näspincett. Efter frystorkning som visats tidigare, rekonstituera provet med 200 mikroliter 20 millimolar saltsyra och placera det i en frys minus 80 grader Celsius.Tillsätt 400 mikroliter 100% aceton på provpelleten med en mikropipett och bryt upp pelleten med antingen virvelomrörning eller mikropipettspetsen. Överför kvantitativt den tvättade och återsuspenderade pelleten till motsvarande injektionsflaska med glasskal. Använd en milliliter mikropipett.Tillsätt ytterligare 400 mikroliter aceton till provröret för att överföra den återstående pelleten. Centrifugera och dekantera supernatantvätskan till biologiskt avfall innan pelleten torkas i en centrifugalindunstare tills vätskan har avlägsnats och pelleten är torr. För att förbereda vakuumhydrolysfilen tillsätt en milliliter sex molar saltsyra till botten av hydrolysfilen.För försiktigt in de märkta skalflaskorna med torkade prover i hydrolysfilen med pincett som säkerställer en upprätt stabil position. Fäst locket på hydrolysfilen och tryck på den röda ratten på locket för att stänga ventilen. När du har slagit på vakuumpumpen, fäst vakuumröret på hydrolysfillocket och tryck på den gröna ratten på locket för att öppna ventilen.Låt sedan vakuumpumpen ta bort luften från injektionsflaskan i en minut. Stäng sedan injektionsflaskan genom att trycka ner den röda vredet på hydrolysflaskans lock. Stäng av vakuumpumpen och ta bort vakuumröret.Fäst ett gummirör på kvävgaskranen på laboratoriebänken. Och öppna kranen något. Placera tummen i slutet av röret, försegla den och räkna tills gasen börjar fly när trycket byggs upp.Fäst sedan den andra änden av gummiröret på huvudet på hydrolysflaskans lock. Och tryck omedelbart på lockets gröna vred. Räkna den tid det tar för gasen att fly.Tryck snabbt på den röda vredet på locket och ta bort gummiröret. Upprepa hela vakuumbehandlingsprocessen två gånger. Se till att flaskan med hydrolys av glas är fri från luft och fylld med kvävgas.Placera hydrolysflaskan i en förvärmd ugn inställd på 110 grader Celsius i 16 till 18 timmar. Ta bort flaskan med glashydrolys från ugnen med ugnshandskar. Låt injektionsflaskan svalna inuti dragskåpet i 10 minuter innan du trycker på den gröna ratten medan du vänder bort den för att släppa ut tryck och gas.Rekonstituera de hydrolyserade provpelletsen med 200 mikroliter 20 molar saltsyra i skalflaskan och återsuspendera pelleten. Centrifugera injektionsflaskorna med skal som innehåller de färdigberedda pelarna i två minuter vid 5, 300 g och 25 grader Celsius. Överför de rekonstituerade fria fraktionsproverna och proteinfraktionen till de två milliliter filterrören som innehåller 0,2 mikron pormembranfilter och märkta som fri fraktion och proteinfraktion.Placera rören för centrifugering i 30 minuter vid 5 000 G och 25 grader Celsius. Kromatogrammet för övervakning av flera reaktioner av en standard innehållande beta-metylamino-L-alanin eller BMAA och dess isomerer som indikeras av de färgkodade linjerna visas här. En positiv detektion för alla tre isomererna, BMAA, DAB och AEG observerades i den fria fraktionen av Merismopedia-arterna som samlats in från Liddelsjön.Medan den bundna fraktionen av Microcystis flos-aquae-arten som samlats in från Waka Waterworks illustrerade ett negativt resultat för BMAA och dess isomerer. Den återsuspenderade pelleten måste överföras kvantitativt till motsvarande skalflaska för att möjliggöra en exakt normaliseringspunkt baserad på cyanobakteriemassa. Patienter och due diligence rekommenderas när du utför detta steg.Efter denna procedur. De extraherade fraktionerna måste genomgå ett devitaliseringssteg för att möjliggöra omvänd fas. Vätskekromatografi, tandemmasspektrometrianalys.Tillämpningen av denna teknik utökar olika vetenskapliga områden. Inklusive miljövetenskap genom analys av cynotoxiner i miljöprover. Och områden som toxikologi och biokemi genom undersökning av Misincorporation-teorin om BMA.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Storskalig Icke-riktad Metabolomic Profilering av serum med Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Oriktade Metabolomics från biologiska källor Använda Ultraperformance vätskekromatografi-högupplösande masspektrometri (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Använda kapillärelektrofores att kvantifiera organiska syror från växtvävnad: ett pilotfall Undersöka<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Frön

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

En HS-MRM analysmetod för kvantifiering av värdcellen proteiner i Protein Biopharmaceuticals genom vätskekromatografi Ion rörlighet QTOF masspektrometri

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

En enkel metod för glukosinolater Extraktion och analys med Högtrycks vätskekromatografi (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

Fizzy Extraction of Volatile Organic Compounds Combined with Atmospheric Pressure Chemical Ionization Quadrupole Mass Spectrometry

Fizzy Extraction av flyktiga organiska föreningar kombinerat med atmosfärstryck Kemisk ionisering Quadrupole Mass Spectrometry

Chemical analysis of volatile and semivolatile compounds dissolved in liquid samples can be challenging. The dissolved components need to be brought to ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Realtid andedräkt analys med hjälp av sekundära Nanoelectrospray jonisering kopplat till hög upplösning masspektrometri

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntes och masspektrometri analys av Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Kapillärelektroforesbaserat väte/deuteriumutbyte för konformationskarakterisering av proteiner med masspektrometri uppifrån och ner

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Curation of Computational Chemical Libraries Demonstrated with Alpha-Amino Acids

Kurering av beräkningskemiska bibliotek demonstrerade med alfa-aminosyror

Exhaustive generation of molecular structures has numerous chemical and biochemical applications such as drug design, molecular database construction, ...