Name: in vivo vascular injury readouts in mouse retina to promote reproducibility
Uploaded: 2022-04-21T13:50:00
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Ce travail a été soutenu par la subvention DGE-1644869 (à CKCO) du National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) (à CKCO), au National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (à l’AMP), au National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 à CMT) et au Department of Defense Army/Air Force (DURIP à CMT).

Ce protocole suit la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche en ophtalmologie et en vision. Les expériences sur les rongeurs ont été approuvées et surveillées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Columbia.
REMARQUE : L’imagerie a été effectuée sur des souris mâles C57BL/6J âgées de 2 mois qui pesaient environ 23 g.
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<ol>
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An update of the literature.</a> Retina. 33 (5), 901-910 (2013).</li><li>Ho, M., Liu, D. T. L., Lam, D. S. C., Jonas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vein+occlusions,+from+basics+to+the+latest+treatment.">Retinal vein occlusions, from basics to the latest treatment.</a> Retina. 36 (3), 432-448 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+mouse+model+of+branch+retinal+vein+occlusion+and+retinal+neovascularization.">Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).</li><li>Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. 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L’imagerie rétinienne non invasive des rongeurs offre une avenue pour étudier la pathologie et développer des interventions. Des études antérieures ont développé et optimisé un modèle murin d’OVR, limitant la variabilité et permettant une traduction fiable des pathologies cliniques courantes dans la rétine murine 5,7,13. Les progrès de la technologie d’imagerie ophtalmique permettent en outre l’utilisation de...

Les maladies neurovasculaires sont un problème de santé majeur responsable des accidents vasculaires cérébraux ischémiques, l’une des principales causes de mortalité et de morbidité, et des maladies vasculaires rétiniennes entraînant une perte de vision 1,2. Pour modéliser la maladie neurovasculaire, nous utilisons un modèle murin d’occlusion veineuse rétinienne (OVR). Ce modèle est non invasif et utilise des techniques d’imagerie in vivo similaires à celles utilisées pour examiner les personnes atteintes d’une maladie vasculaire rétinienne en milieu clinique. L’utilisation de ce modèle augmente donc le potentiel translationnel des études utilisant ce modèle. Comme pour tous les modèles de souris, il est essentiel de maximiser la reproductibilité du modèle.
Les maladies vasculaires rétiniennes sont une cause majeure de perte de vision chez les personnes de moins de 70 ans. La RVO est la deuxième maladie vasculaire rétinienne la plus fréquente après la rétinopathie diabétique3. Les caractéristiques cliniques caractéristiques de la RVO comprennent une lésion ischémique, un œdème rétinien et une perte de vision à la suite d’une perte neuronale 3,4. Des modèles murins de RVO utilisant la photocoagulation laser des principaux vaisseaux ont été développés et affinés pour reproduire les principales pathologies cliniques observées chez l’homme RVO 5,6,7. Les progrès de l’imagerie ophtalmique permettent également la reproduction d’outils de diagnostic non invasifs utilisés chez l’homme, à savoir l’angiographie à la fluorescéine (AF) et la tomographie par cohérence optique (OCT)6. L’angiographie à la fluorescéine permet d’observer les fuites dues à la rupture de la barrière hémato-rétinienne (BRB) ainsi que la dynamique du flux sanguin dans la rétine, y compris les sites d’occlusion, en utilisant l’injection de fluorescéine, un petit colorant fluorescent 8,9. L’imagerie OCT permet l’acquisition d’images transversales haute résolution de la rétine et l’étude de l’épaisseur et de l’organisation des couches rétiniennes10. L’analyse des images FA a toujours été largement qualitative, ce qui limite le potentiel de comparaison directe et reproductible entre les études. Récemment, un certain nombre de méthodes ont été développées pour la quantification de l’épaisseur de couche en imagerie OCT, bien qu’il n’existe actuellement aucun protocole d’analyse normalisé et que le site d’acquisition d’images OCT varie11. Afin de tirer correctement parti de ces outils, une méthodologie d’analyse des données normalisée, quantitative et reproductible est nécessaire. Dans cet article, nous présentons trois lectures vasculaires utilisées pour évaluer les dommages pathologiques dans un modèle murin de fuite de fluorescéine RVO, d’épaisseur de couche OCT et de désorganisation des couches rétiniennes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AK-Fluor 10%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC: 17478-253-10</td>
			<td>light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>NADA #141-199</td>
			<td>keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>00658 06401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSight 2D</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>OCT analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine Hydrochloride</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-0702-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDCL174478-201-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron IV</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>Retinal imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron Meridian Module</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>Laser photocoagulator software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>OCT imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron StreamPix Module</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>Fundus imaging and acquisition targeting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh</td>
			<td>Allergan</td>
			<td>94170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC: 174478-102-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDCL 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo vascular injury readouts in mouse retina to promote reproducibility

Les progrès réalisés dans les outils d’imagerie ophtalmique offrent un niveau d’accès sans précédent aux chercheurs travaillant avec des modèles animaux de lésions neurovasculaires. Pour tirer correctement parti de cette plus grande traduisibilité, il est nécessaire de concevoir des méthodes reproductibles pour tirer des données quantitatives de ces images. L’imagerie par tomographie par cohérence optique (TCO) peut résoudre l’histologie rétinienne à une résolution micrométrique et révéler des différences fonctionnelles dans le flux sanguin vasculaire. Ici, nous décrivons des lectures vasculaires non invasives que nous utilisons pour caractériser les dommages pathologiques post-agression vasculaire dans un modèle murin optimisé d’occlusion veineuse rétinienne (OVR). Ces lectures comprennent l’analyse par imagerie en direct de la morphologie rétinienne, la désorganisation des couches internes de la rétine (DRIL) mesure de l’ischémie capillaire et les mesures d’angiographie à la fluorescéine de l’œdème rétinien et de la densité vasculaire. Ces techniques correspondent directement à celles utilisées pour examiner les patients atteints de maladie de la rétine en clinique. La normalisation de ces méthodes permet une comparaison directe et reproductible de modèles animaux avec des phénotypes cliniques de maladies ophtalmiques, augmentant ainsi le pouvoir translationnel des modèles de lésions vasculaires.

Ces méthodes d’analyse permettent de quantifier la pathologie rétinienne capturée par imagerie FA et OCT. Les expériences dont les données représentatives sont extraites ont utilisé des souris mâles C57BL / 6J qui ont servi de témoins non blessés ou ont subi la procédure RVO et ont reçu soit des gouttes ophtalmiques de traitement Pen1-XBir3, soit des gouttes ophtalmiques pour véhicules Pen1-Saline. Le modèle de lésion RVO impliquait l’irradiation laser (532 nm) des veines principales de chaque œil d?...

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In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Ici, nous présentons trois protocoles d’analyse de données pour les images d’angiographie à la fluorescéine (AF) et de tomographie par cohérence optique (OCT) dans l’étude de l’occlusion veineuse rétinienne (OVR).

In vivo Lecture des lésions vasculaires dans la rétine de souris pour favoriser la reproductibilité

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Ce protocole permet à l’utilisateur de mesurer quantitativement des marqueurs cliniquement analogues de dommages dans l’imagerie rétinienne de souris, ce qui renforce la traduisibilité des résultats ultérieurs. Ces méthodes nous permettent de rationaliser l’analyse et nous donnent la possibilité de comparer de manière fiable l’imagerie entre les animaux de laboratoire. Bien que ces méthodes aient été développées pour étudier une vue d’ensemble du modèle murin, elles peuvent facilement s’étendre à la recherche sur toutes les maladies de la rétine qui utilisent les mêmes techniques d’imagerie.Allumez le boîtier lumineux du microscope imageur rétinien, l’appareil de tomographie par cohérence optique et la plate-forme de souris chauffée. Allumez l’ordinateur et ouvrez le programme d’imagerie. Ajouter une goutte de phényléphrine et de tropicamide à chaque œil.Injecter 100 microlitres de 1% de fluorescéine intrapéritonéale. Accueillez la souris sur la plate-forme. Ajustez la hauteur et l’angle de la plate-forme jusqu’à ce que la vue du fond d’œil rétinien soit claire et nette.Prenez une photo du fond d’œil. Ouvrez le logiciel d’imagerie et de tomographie par cohérence optique. Dans le programme de tomographie par cohérence optique, ajustez le nudge à 10.Prenez une image de tomographie par cohérence optique, ajoutez 75 micromètres distaux de la brûlure. Répétez l’opération pour les trois autres quadrants de la rétine. Basculez la caméra sur un filtre de 488 nanomètres.Augmentez le gain de la caméra à 5. Prenez une photo du fond d’œil exactement 5 minutes après l’injection de fluorescéine. Ouvrez l’image de fluorescéine sur le logiciel de traitement d’image.Dupliquez l’image. À l’aide d’un outil de sélection, tracez soigneusement les principaux navires. Ignorez tous les navires qui se ramifient à partir de ces navires.Dans la première image, supprimez la sélection, ne laissant que le vaisseau. Enregistrez cette image masquée. Déplacez la sélection vers la deuxième image, inversez la sélection et supprimez-la, isolant l’arrière-plan.Enregistrez cette image masquée. Ouvrez l’image d’arrière-plan et mesurez la densité intégrée. Ouvrez l’image des vaisseaux, sélectionnez le contour des vaisseaux, puis mesurez l’intensité moyenne.Diviser la densité intégrée du bruit de fond par l’intensité moyenne des vaisseaux, générant le rapport de fuite pour l’œil. Notez ce rapport de fuite pour chaque œil dans une cohorte expérimentale. Pour mieux contrôler le bruit de fond, normaliser les yeux expérimentaux au rapport de fuite moyen des yeux témoins non blessés.Ouvrez l’image de tomographie par cohérence optique dans le logiciel de traitement d’image. Tracez les bordures de la couche de cellules ganglionnaires, de la couche plexiforme interne, de la couche nucléaire interne, de la couche plexiforme externe, de la couche photoréceptrice et de la couche RPE. Exportez les fichiers au format CSV.Mesurer l’épaisseur moyenne de chaque couche et répéter pour chaque œil de la cohorte expérimentale. Ouvrez l’image de tomographie par cohérence optique dans l’image J.À l’aide de l’outil de ligne, mesurez la distance où le bord supérieur de la couche plexiforme externe est indistinct. Mesurez horizontalement, en maintenant la latitude où commence la désorganisation.Calculez la somme des distances désorganisées dans l’image. Divisez la durée de désorganisation par la longueur totale de la rétine pour obtenir le rapport de désorganisation. Répétez la mesure et le calcul des images de tomographie par cohérence optique des trois autres quadrants de la rétine.Prenons la moyenne des rapports de désorganisation à partir des quatre images de tomographie par cohérence optique. Ce nombre représente la désorganisation moyenne pour l’ensemble de la rétine. Répéter pour chaque œil de la cohorte expérimentale.Les images masquées utilisées pour le calcul du ratio de fuite pour chaque image de la rétine peuvent être comparées à d’autres et analysées, séparant le système vasculaire majeur des autres zones de la rétine. La quantification de la fluorescéine permet de comparer la gravité des blessures et l’efficacité du traitement, ainsi que d’étudier les changements dans les fuites au cours de la période de la blessure. Une délimitation des couches de la rétine dans une image OCT est observée.La quantification de l’épaisseur pour chaque couche rétinienne montre que la réponse œdémateuse initiale a un effet plus profond sur les couches internes de la rétine. À partir d’une analyse de l’évolution temporelle des lésions de l’occlusion veineuse rétinienne, le gonflement inflammatoire initial des couches rétiniennes et l’amincissement dégénératif éventuel peuvent être observés. La couche nucléaire interne subit une réponse beaucoup plus importante à la blessure initiale, mais la couche plexiforme interne présente un amincissement plus sévère après que l’œdème initial a été stabilisé et revient à la ligne de base.La désorganisation de la couche interne de la rétine se manifeste par une disparition de la limite supérieure de la couche plexiforme externe, mélangeant les couches plexiformes externes et nucléaires internes. La désorganisation rétinienne de deux groupes expérimentaux a été comparée pour étudier l’efficacité d’un inhibiteur dans l’atténuation des dommages rétiniens. La qualité de l’image est d’une importance vitale pour la qualité de l’analyse.Lors de l’acquisition d’images rétiniennes, prenez le temps de vous assurer que le fond d’œil et les couches rétiniennes sont aussi clairs et concentrés que possible. Ces méthodes non invasives peuvent être utilisées longitudinalement et en conjonction avec l’étude biochimique et immunohistochimique des tissus pour créer des profils plus multidimensionnels et détaillés de la maladie. Cette technique permet de quantifier de manière fiable les données d’imagerie rétinienne in vivo dans des modèles de maladies neurovasculaires afin que les données puissent être plus facilement traduites en maladie humaine.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

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La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Recherche

Neurosciences

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

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En électroporation in vivo de la rétine de souris en développement

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Mont entiers immunofluorescence de la rétine de souris néonatal chargé d&#39;enquêter sur l&#39;angiogenèse<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Évaluation de la régénération vasculaire dans le SNC Utilisation de la rétine de souris

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome sectionnement rétine de souris pour préparer des cultures photoréceptrices

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induite par laser Spinal Cord Injury modèle pour évaluer les mécanismes de la dégénérescence axonale dans en temps réel

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultané<em&gt; Ex vivo</em&gt; Tests fonctionnels de deux rétines par<em&gt; In vivo</em&gt; Système Électrorétinogramme

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Un In Vivo Duo-color méthode d’imagerie vasculaire dynamique après contusion médullaire

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...