Name: in vivo vascular injury readouts in mouse retina to promote reproducibility
Uploaded: 2022-04-21T13:50:00
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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione del National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (a CKCO), dal National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (all'AMP), dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 a CMT) e dal Department of Defense Army / Air Force (DURIP a CMT).

Questo protocollo segue la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. Gli esperimenti sui roditori sono stati approvati e monitorati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Columbia University.
NOTA: L'imaging è stato eseguito su topi maschi C57BL / 6J di 2 mesi che pesavano circa 23 g.
1. Preparazione di reagenti per l'imaging retinico<...

<ol>
	<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+cerebrovascular+disease+in+the+united+states.">The burden of cerebrovascular disease in the united states.</a> Preventing Chronic Disease. 16, 180411 (2019).</li><li>Nakahara, T., Mori, A., Kurauchi, Y., Sakamoto, K., Ishii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+interactions+in+the+retina:+physiological+and+pathological+roles.">Neurovascular interactions in the retina: physiological and pathological roles.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 123 (2), 79-84 (2013).</li><li>Jaulim, A., Ahmed, B., Khanam, T., Chatziralli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branch+retinal+vein+occlusion:+epidemiology,+pathogenesis,+risk+factors,+clinical+features,+diagnosis,+and+complications.+An+update+of+the+literature.">Branch retinal vein occlusion: epidemiology, pathogenesis, risk factors, clinical features, diagnosis, and complications. An update of the literature.</a> Retina. 33 (5), 901-910 (2013).</li><li>Ho, M., Liu, D. T. L., Lam, D. S. C., Jonas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vein+occlusions,+from+basics+to+the+latest+treatment.">Retinal vein occlusions, from basics to the latest treatment.</a> Retina. 36 (3), 432-448 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+mouse+model+of+branch+retinal+vein+occlusion+and+retinal+neovascularization.">Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).</li><li>Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. 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L'imaging retinico non invasivo dei roditori rappresenta una strada per studiare la patologia e sviluppare interventi. Studi precedenti hanno sviluppato e ottimizzato un modello murino di RVO, limitando la variabilità e consentendo una traduzione affidabile delle patologie cliniche comuni nella retina murina 5,7,13. Gli sviluppi nella tecnologia di imaging oftalmico consentono inoltre l'uso di tecniche di imaging clinico in...

La malattia neurovascolare è un grave problema sanitario responsabile dell'ictus ischemico, una delle principali cause di mortalità e morbilità, e delle malattie vascolari retiniche che portano alla perdita della vista 1,2. Per modellare la malattia neurovascolare, utilizziamo un modello murino di occlusione venosa retinica (RVO). Questo modello non è invasivo e utilizza tecniche di imaging in vivo simili a quelle utilizzate per esaminare le persone con malattia vascolare retinica in un contesto clinico. L'uso di questo modello aumenta quindi il potenziale traslazionale degli studi che utilizzano questo modello. Come per tutti i modelli di mouse, è fondamentale massimizzare la riproducibilità del modello.
Le malattie vascolari retiniche sono una delle principali cause di perdita della vista nelle persone di età inferiore ai 70 anni. RVO è la seconda malattia vascolare retinica più comune dopo la retinopatia diabetica3. Le caratteristiche cliniche della RVO includono lesioni ischemiche, edema retinico e perdita della vista come conseguenza della perdita neuronale 3,4. Modelli murini di RVO che utilizzano la fotocoagulazione laser dei vasi principali sono stati sviluppati e perfezionati per replicare le principali patologie cliniche osservate nella RVO umana 5,6,7. I progressi nell'imaging oftalmico consentono anche la replicazione di strumenti diagnostici non invasivi utilizzati negli esseri umani, vale a dire l'angiografia con fluoresceina (FA) e la tomografia a coerenza ottica (OCT)6. La fluorangiografia consente l'osservazione delle perdite dovute alla rottura della barriera emato-retinica (BRB) e della dinamica del flusso sanguigno nella retina, compresi i siti di occlusione, utilizzando l'iniezione di fluoresceina, un piccolo colorante fluorescente 8,9. L'imaging OCT consente l'acquisizione di immagini in sezione trasversale ad alta risoluzione della retina e lo studio dello spessore e dell'organizzazione degli strati retinici10. L'analisi delle immagini FA è stata storicamente in gran parte qualitativa, il che limita il potenziale di confronto diretto e riproducibile tra gli studi. Recentemente, sono stati sviluppati diversi metodi per la quantificazione dello spessore dello strato nell'imaging OCT, sebbene attualmente non esista un protocollo di analisi standardizzato e il sito di acquisizione delle immagini OCT varia11. Per sfruttare correttamente questi strumenti, è necessaria una metodologia di analisi dei dati standardizzata, quantitativa e replicabile. In questo articolo, presentiamo tre di queste letture vascolari utilizzate per valutare il danno patologico in un modello murino di perdita di RVO-fluoresceina, spessore dello strato OCT e disorganizzazione degli strati retinici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AK-Fluor 10%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC: 17478-253-10</td>
			<td>light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>NADA #141-199</td>
			<td>keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>00658 06401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSight 2D</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>OCT analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine Hydrochloride</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-0702-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDCL174478-201-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron IV</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>Retinal imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron Meridian Module</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>Laser photocoagulator software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>OCT imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron StreamPix Module</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>Fundus imaging and acquisition targeting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh</td>
			<td>Allergan</td>
			<td>94170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC: 174478-102-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDCL 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo vascular injury readouts in mouse retina to promote reproducibility

I progressi negli strumenti di imaging oftalmico offrono un livello senza precedenti di accesso ai ricercatori che lavorano con modelli animali di lesioni neurovascolari. Per sfruttare correttamente questa maggiore traducibilità, è necessario escogitare metodi riproducibili per estrarre dati quantitativi da queste immagini. La tomografia a coerenza ottica (OCT) può risolvere l'istologia retinica con risoluzione micrometrica e rivelare differenze funzionali nel flusso sanguigno vascolare. Qui, delineiamo letture vascolari non invasive che utilizziamo per caratterizzare il danno patologico post insulto vascolare in un modello murino ottimizzato di occlusione venosa retinica (RVO). Queste letture includono l'analisi di imaging dal vivo della morfologia retinica, la disorganizzazione degli strati interni della retina (DRIL) misura dell'ischemia capillare e misure di fluorangiografia dell'edema retinico e della densità vascolare. Queste tecniche corrispondono direttamente a quelle utilizzate per esaminare i pazienti con malattia retinica nella clinica. La standardizzazione di questi metodi consente il confronto diretto e riproducibile di modelli animali con fenotipi clinici di malattia oftalmica, aumentando il potere traslazionale dei modelli di danno vascolare.

Questi metodi di analisi consentono la quantificazione della patologia retinica catturata dall'imaging FA e OCT. Gli esperimenti da cui vengono estratti i dati rappresentativi hanno utilizzato topi maschi C57BL / 6J che sono serviti come controlli illesi o sono stati sottoposti alla procedura RVO e hanno ricevuto colliri di trattamento Pen1-XBir3 o colliri di veicoli Pen1-Saline. Il modello di lesione RVO ha coinvolto l'irradiazione laser (532 nm) delle vene principali in ciascun occhio di un topo anestetizzato a seguito...

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In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Qui, presentiamo tre protocolli di analisi dei dati per l'angiografia fluoresceina (FA) e le immagini di tomografia a coerenza ottica (OCT) nello studio dell'occlusione venosa retinica (RVO).

In vivo Letture di lesioni vascolari nella retina del topo per promuovere la riproducibilità

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Questo protocollo consente all'utente di misurare quantitativamente marcatori clinicamente analoghi di danno nell'imaging retinico del topo, il che rafforza la traducibilità dei risultati successivi. Questi metodi ci consentono di semplificare l'analisi e ci danno la possibilità di confrontare in modo affidabile l'imaging tra animali da esperimento. Mentre questi metodi sono stati sviluppati per studiare una panoramica del modello murino, possono facilmente estendersi alla ricerca su qualsiasi malattia della retina che utilizza le stesse tecniche di imaging.Accendere la scatola luminosa del microscopio per l'imaging retinico, la macchina per la tomografia a coerenza ottica e la piattaforma riscaldata del mouse. Accendere il computer e aprire il programma di imaging. Aggiungere una goccia di fenilefrina e tropicamide a ciascun occhio.Iniettare 100 microlitri di fluoresceina all'1% per via intraperitoneale. Posizionare il mouse sulla piattaforma. Regolare l'altezza e l'angolazione della piattaforma fino a quando la vista del fondo retinico è chiara e focalizzata.Scatta una foto del fondo. Aprire il software di imaging e tomografia a coerenza ottica. Nel programma di tomografia a coerenza ottica regolare nudge a 10.Prendere un'immagine di tomografia a coerenza ottica, aggiungere 75 micrometri distali dalla bruciatura. Ripetere per gli altri tre quadranti della retina. Passare la fotocamera a un filtro a 488 nanometri.Aumentare il guadagno della fotocamera a 5. Scatta una foto del fondo esattamente 5 minuti dopo l'iniezione di fluoresceina. Aprire l'immagine della fluoresceina sul software di elaborazione delle immagini.Duplicare l'immagine. Utilizzando uno strumento di selezione, tracciare attentamente le navi principali. Ignorare tutte le navi che si diramano da queste navi.Nella prima immagine, eliminare la selezione, lasciando solo il vaso. Salva questa immagine mascherata. Spostate la selezione sulla seconda immagine, invertite la selezione ed eliminate, isolando lo sfondo.Salva questa immagine mascherata. Aprire l'immagine di sfondo e misurare la densità integrata. Apri l'immagine dei vasi, seleziona il contorno dei vasi e quindi misura l'intensità media.Dividere la densità integrata dello sfondo per l'intensità media dei vasi, generando il rapporto di perdita per l'occhio. Registrare questo rapporto di perdita per ciascun occhio in una coorte sperimentale. Per controllare ulteriormente lo sfondo, normalizzare gli occhi sperimentali al rapporto medio di perdita degli occhi di controllo illesi.Aprire l'immagine della tomografia a coerenza ottica nel software di elaborazione delle immagini. Traccia i bordi dello strato di cellule ganglionari, dello strato plessiforme interno, dello strato nucleare interno, dello strato plessiforme esterno, dello strato fotorecettore e dello strato RPE. Esporta i file come CSV.Misurare lo spessore medio di ogni strato e ripetere per ciascun occhio nella coorte sperimentale. Aprire l'immagine della tomografia a coerenza ottica nell'immagine J.Utilizzando lo strumento linea, misurare la distanza in cui il bordo superiore dello strato plessiforme esterno è indistinto. Misurare orizzontalmente, mantenendo la latitudine in cui inizia la disorganizzazione.Calcola la somma delle distanze disorganizzate nell'immagine. Dividere la lunghezza della disorganizzazione per la lunghezza totale della retina per ottenere il rapporto di disorganizzazione. Ripetere la misurazione e il calcolo per le immagini di tomografia a coerenza ottica dagli altri tre quadranti della retina.Prendi la media dei rapporti di disorganizzazione dalle quattro immagini di tomografia a coerenza ottica. Questo numero rappresenta la disorganizzazione media per l'intera retina. Ripetere l'operazione per ciascun occhio nella coorte sperimentale.Le immagini mascherate utilizzate per il calcolo del rapporto di perdita per ogni immagine retinica possono essere confrontate con altre e analizzate, separando la vascolarizzazione maggiore da altre aree della retina. La quantificazione della fluoresceina consente il confronto della gravità della lesione e dell'efficacia del trattamento, nonché lo studio dei cambiamenti nelle perdite nel corso del tempo della lesione. Si osserva una delineazione degli strati della retina in un'immagine OCT.La quantificazione dello spessore per ogni strato retinico mostra che la risposta edematosa iniziale ha un effetto più profondo sugli strati retinici interni. Dall'analisi di un decorso temporale del danno occlusivo venoso retinico, si può osservare l'iniziale gonfiore infiammatorio degli strati retinici e l'eventuale assottigliamento degenerativo. Lo strato nucleare interno sperimenta una risposta molto maggiore alla lesione iniziale, ma lo strato plessiforme interno mostra un assottigliamento più grave dopo che l'edema iniziale è stato stabilizzato e ritorna al basale.La disorganizzazione dello strato retinico interno si manifesta come una scomparsa del limite superiore dello strato plessiforme esterno, fondendo insieme gli strati plessiformi esterni e nucleari interni. La disorganizzazione retinica di due gruppi sperimentali è stata confrontata per studiare l'efficacia di un inibitore nel mitigare il danno retinico. La qualità dell'immagine è di vitale importanza per la qualità dell'analisi.Quando acquisisci immagini retiniche, prenditi il tempo necessario per assicurarti che il fondo oculare e gli strati retinici siano il più chiari e focalizzati possibile. Questi metodi non invasivi possono essere utilizzati longitudinalmente e in combinazione con lo studio biochimico e immunoistochimico del tessuto per creare profili di malattia più sfaccettati e dettagliati. Questa tecnica consente la quantificazione affidabile dei dati di imaging retinico in vivo in modelli di malattia neurovascolare in modo che i dati possano essere più facilmente tradotti in malattie umane.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Ricerca

Neuroscienze

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Assessment of Vascular rigenerazione nel SNC Utilizzo del Retina mouse

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome sezionamento mouse Retina preparare Culture fotorecettori

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Test funzionale di due retine per<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Elettroretinogramma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

In Vivo Duo-colore metodo di Imaging vascolare dinamica dopo la lesione del midollo spinale contusivi

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...