Name: in vivo vascular injury readouts in mouse retina to promote reproducibility
Uploaded: 2022-04-21T13:50:00
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Este trabalho foi apoiado pela bolsa do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (para CKCO), o National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (para AMP), o Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (RO1 NS081333, R03 NS099920 para CMT) e o Departamento de Defesa Exército / Força Aérea (DURIP para CMT).

Este protocolo segue a declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftálmicas e de visão. Experimentos com roedores foram aprovados e monitorados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Columbia.
NOTA: A imagem foi feita em camundongos machos C57BL/6J de 2 meses de idade que pesavam aproximadamente 23 g.
1. Preparação de reagentes para imagens da retin...

<ol>
	<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+cerebrovascular+disease+in+the+united+states.">The burden of cerebrovascular disease in the united states.</a> Preventing Chronic Disease. 16, 180411 (2019).</li><li>Nakahara, T., Mori, A., Kurauchi, Y., Sakamoto, K., Ishii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+interactions+in+the+retina:+physiological+and+pathological+roles.">Neurovascular interactions in the retina: physiological and pathological roles.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 123 (2), 79-84 (2013).</li><li>Jaulim, A., Ahmed, B., Khanam, T., Chatziralli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branch+retinal+vein+occlusion:+epidemiology,+pathogenesis,+risk+factors,+clinical+features,+diagnosis,+and+complications.+An+update+of+the+literature.">Branch retinal vein occlusion: epidemiology, pathogenesis, risk factors, clinical features, diagnosis, and complications. An update of the literature.</a> Retina. 33 (5), 901-910 (2013).</li><li>Ho, M., Liu, D. T. L., Lam, D. S. C., Jonas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vein+occlusions,+from+basics+to+the+latest+treatment.">Retinal vein occlusions, from basics to the latest treatment.</a> Retina. 36 (3), 432-448 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+mouse+model+of+branch+retinal+vein+occlusion+and+retinal+neovascularization.">Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).</li><li>Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. 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A imagem não invasiva da retina de roedores apresenta uma via para estudar a patologia e desenvolver intervenções. Estudos prévios desenvolveram e otimizaram um modelo de RVO em camundongos, limitando a variabilidade e permitindo a tradução confiável de patologias clínicas comuns na retina murina 5,7,13. Os desenvolvimentos na tecnologia de imagem oftálmica permitem ainda o uso de técnicas clínicas de imagem in vi...

A doença neurovascular é um importante problema de saúde responsável por acidentes vasculares cerebrais isquêmicos, uma das principais causas de mortalidade e morbidade, e doenças vasculares da retina que levam à perda de visão 1,2. Para modelar a doença neurovascular, empregamos um modelo de camundongo de oclusão da veia retiniana (RVO). Este modelo não é invasivo e utiliza técnicas de imagem in vivo semelhantes àquelas usadas para examinar pessoas com doença vascular da retina em um ambiente clínico. A utilização desse modelo aumenta, assim, o potencial translacional dos estudos que utilizam esse modelo. Tal como acontece com todos os modelos de mouse, é fundamental maximizar a reprodutibilidade do modelo.
As doenças vasculares da retina são uma das principais causas de perda de visão em pessoas com menos de 70 anos. A RVO é a segunda doença vascular retiniana mais comum depois da retinopatia diabética3. As características clínicas características da OVR incluem lesão isquêmica, edema de retina e perda de visão como consequência da perda neuronal 3,4. Modelos de RVO em camundongos utilizando fotocoagulação a laser de vasos importantes foram desenvolvidos e refinados para replicar as principais patologias clínicas observadas no RVO humano 5,6,7. Os avanços na imagem oftálmica também permitem a replicação de ferramentas diagnósticas não invasivas utilizadas em humanos, a saber, a angiografia fluoresceína (AF) e a tomografia de coerência óptica (OCT)6. A Angiografia por Fluoresceína permite a observação de vazamentos devido à quebra da barreira sangue-retina (BRB), bem como a dinâmica do fluxo sanguíneo na retina, incluindo locais de oclusão, utilizando a injeção de fluoresceína, um pequeno corante fluorescente 8,9. A OCT permite a aquisição de imagens transversais de alta resolução da retina e o estudo da espessura e organização das camadas retinianas10. A análise de imagens de AF tem sido historicamente em grande parte qualitativa, o que limita o potencial de comparação direta e reprodutível entre os estudos. Recentemente, vários métodos têm sido desenvolvidos para a quantificação da espessura da camada em imagens de OCT, embora atualmente não exista um protocolo de análise padronizado e o local de aquisição da imagem da OCT varie11. Para aproveitar adequadamente essas ferramentas, é necessária uma metodologia de análise de dados padronizada, quantitativa e replicável. Neste trabalho, apresentamos três dessas leituras vasculares utilizadas para avaliar o dano patológico em um modelo de camundongo de vazamento de RVO-fluoresceína, espessura da camada OCT e desorganização das camadas retinianas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AK-Fluor 10%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC: 17478-253-10</td>
			<td>light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>NADA #141-199</td>
			<td>keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>00658 06401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSight 2D</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>OCT analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine Hydrochloride</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-0702-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDCL174478-201-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron IV</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>Retinal imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron Meridian Module</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>Laser photocoagulator software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>OCT imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron StreamPix Module</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>Fundus imaging and acquisition targeting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh</td>
			<td>Allergan</td>
			<td>94170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC: 174478-102-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDCL 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo vascular injury readouts in mouse retina to promote reproducibility

Os avanços nas ferramentas de imagem oftálmica oferecem um nível sem precedentes de acesso a pesquisadores que trabalham com modelos animais de lesão neurovascular. Para alavancar adequadamente essa maior traduzibilidade, há uma necessidade de conceber métodos reprodutíveis de extrair dados quantitativos dessas imagens. A tomografia de coerência óptica (OCT) pode resolver a histologia da retina na resolução de micrômetros e revelar diferenças funcionais no fluxo sanguíneo vascular. Aqui, delineamos leituras vasculares não invasivas que usamos para caracterizar o dano patológico pós-insulto vascular em um modelo otimizado de oclusão da veia retiniana (RVO) em camundongos. Essas leituras incluem análise de imagens ao vivo da morfologia da retina, desorganização das camadas internas da retina (DRIL) medida de isquemia capilar e medidas de angiografia fluoresceína de edema retiniano e densidade vascular. Essas técnicas correspondem diretamente àquelas usadas para examinar pacientes com doença da retina na clínica. A padronização desses métodos permite a comparação direta e reprodutível de modelos animais com fenótipos clínicos de doença oftálmica, aumentando o poder translacional dos modelos de lesão vascular.

Esses métodos de análise permitem a quantificação da patologia da retina capturada por imagens de AF e OCT. Os experimentos dos quais os dados representativos são extraídos usaram camundongos machos C57BL/6J que serviram como controles não feridos ou foram submetidos ao procedimento RVO e receberam colírios de tratamento Pen1-XBir3 ou colírios de veículo Pen1-Saline. O modelo de lesão RVO envolveu a irradiação a laser (532 nm) das veias principais em cada olho de um rato anestesiado após uma injeção na ve...

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In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Aqui, apresentamos três protocolos de análise de dados para angiografia fluoresceína (AF) e tomografia de coerência óptica (OCT) no estudo da Oclusão da Veia Retiniana (RVO).

In vivo Leituras de lesões vasculares na retina de camundongos para promover a reprodutibilidade

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Este protocolo permite ao usuário medir quantitativamente marcadores clinicamente análogos de danos na imagem da retina de camundongos, o que reforça a traduzibilidade dos achados subsequentes. Esses métodos nos permitem agilizar a análise e nos dão a capacidade de comparar de forma confiável imagens entre animais experimentais. Embora esses métodos tenham sido desenvolvidos para estudar uma visão geral do modelo de camundongo, eles podem facilmente se estender à pesquisa sobre quaisquer doenças da retina que usem as mesmas técnicas de imagem.Ligue a caixa de luz do microscópio de imagem da retina, a máquina de tomografia de coerência óptica e a plataforma aquecida do mouse. Ligue o computador e abra o programa de criação de imagens. Adicione uma gota de fenilefrina e tropicamida a cada olho.Injete 100 microlitros de 1% de fluoresceína intraperitoneal. Acomodem o mouse na plataforma. Ajuste a altura e o ângulo da plataforma até que a visão do fundo retiniano esteja clara e focada.Tire uma foto do fundo. Abra o software de imagem e tomografia de coerência óptica. No programa de tomografia de coerência óptica ajustar o empurrão para 10.Pegue uma imagem de tomografia de coerência óptica, adicione 75 micrômetros distais da queimadura. Repita para os outros três quadrantes da retina. Mude a câmera para um filtro de 488 nanômetros.Aumente o ganho da câmera para 5. Tire uma foto do fundo exatamente 5 minutos após a injeção de fluoresceína. Abra a imagem fluoresceína no software de processamento de imagem.Duplique a imagem. Usando uma ferramenta de seleção, trace cuidadosamente os principais vasos. Ignore quaisquer vasos que se ramificam a partir desses vasos.Na primeira imagem, exclua a seleção, deixando apenas a embarcação. Salve esta imagem mascarada. Mova a seleção para a segunda imagem, inverta a seleção e exclua, isolando o plano de fundo.Salve esta imagem mascarada. Abra a imagem de fundo e meça a densidade integrada. Abra a imagem dos vasos, selecione o contorno dos vasos e, em seguida, meça a intensidade média.Divida a densidade integrada do fundo pela intensidade média dos vasos, gerando a razão de vazamento para o olho. Registre essa razão de vazamento para cada olho em uma coorte experimental. Para maior controle do fundo, normalize os olhos experimentais para a razão média de vazamento dos olhos de controle não lesionados.Abra a imagem da tomografia de coerência óptica no software de processamento de imagem. Trace as bordas da camada de células ganglionares, camada plexiforme interna, camada nuclear interna, camada plexiforme externa, camada fotorreceptora e camada RPE. Exporte os arquivos como CSV.Meça a espessura média de cada camada e repita para cada olho na coorte experimental. Abra a imagem da tomografia de coerência óptica na imagem J.Usando a ferramenta de linha, meça a distância em que a borda superior da camada plexiforme externa é indistinta. Meça horizontalmente, mantendo a latitude onde a desorganização começa.Calcule a soma das distâncias desorganizadas na imagem. Divida o comprimento da desorganização pelo comprimento total da retina para obter a razão de desorganização. Repita a medição e o cálculo para imagens de tomografia de coerência óptica dos outros três quadrantes da retina.Tomemos a média das razões de desorganização das quatro imagens de tomografia de coerência óptica. Este número representa a desorganização média para toda a retina. Repetir para cada olho na coorte experimental.As imagens mascaradas utilizadas para o cálculo da razão de vazamento para cada imagem de retina podem ser comparadas a outras e analisadas, separando a vasculatura maior de outras áreas da retina. A quantificação da fluoresceína permite a comparação da gravidade da lesão e da eficácia do tratamento, bem como o estudo das alterações no vazamento ao longo do curso do tempo da lesão. Observa-se uma delimitação das camadas da retina em uma imagem OCT.A quantificação da espessura para cada camada retiniana mostra que a resposta edematosa inicial tem um efeito mais profundo sobre as camadas internas da retina. A partir de uma análise de um curso temporal de dano de oclusão da veia da retina, o inchaço inflamatório inicial das camadas da retina e o eventual afinamento degenerativo podem ser observados. A camada nuclear interna experimenta uma resposta muito maior à lesão inicial, mas a camada plexiforme interna demonstra um afinamento mais grave após o edema inicial ter sido estabilizado e retornar à linha de base.A desorganização da camada interna da retina se manifesta como um desaparecimento do limite superior da camada plexiforme externa, misturando as camadas plexiformes externas e nucleares internas. A desorganização retiniana de dois grupos experimentais foi comparada para investigar a eficácia de um inibidor na mitigação do dano retiniano. A qualidade da imagem é de vital importância para a qualidade da análise.Ao adquirir imagens da retina, reserve um tempo para garantir que as camadas de fundo e retina sejam o mais claras e focadas possível. Esses métodos não invasivos podem ser usados longitudinalmente e em conjunto com o estudo bioquímico e imuno-histoquímico do tecido para criar perfis mais multifacetados e detalhados da doença. Esta técnica permite a quantificação confiável de dados de imagem retiniana in vivo em modelos de doença neurovascular, de modo que os dados possam ser mais facilmente traduzidos para a doença humana.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neurociência

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome Seccionamento Rato Retina de Preparar culturas Fotorreceptoras

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induzida por laser Lesão Medular modelo para avaliar mecanismos de axonal Degeneration em tempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Um Vivo em Método de dupla-cor de imagem dinâmica Vascular após lesão da medula espinhal Contusive

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...