Name: in vivo vascular injury readouts in mouse retina to promote reproducibility
Uploaded: 2022-04-21T13:50:00
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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (a CKCO), el Instituto Nacional del Ojo (NEI) 5T32EY013933 (a AMP), el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (RO1 NS081333, R03 NS099920 a CMT) y el Departamento de Defensa del Ejército / Fuerza Aérea (DURIP a CMT).

Este protocolo sigue la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Los experimentos con roedores fueron aprobados y monitoreados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Columbia.
NOTA: Las imágenes se realizaron en ratones machos C57BL / 6J de 2 meses de edad que pesaban aproximadamente 23 g.
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<ol>
	<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+cerebrovascular+disease+in+the+united+states.">The burden of cerebrovascular disease in the united states.</a> Preventing Chronic Disease. 16, 180411 (2019).</li><li>Nakahara, T., Mori, A., Kurauchi, Y., Sakamoto, K., Ishii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+interactions+in+the+retina:+physiological+and+pathological+roles.">Neurovascular interactions in the retina: physiological and pathological roles.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 123 (2), 79-84 (2013).</li><li>Jaulim, A., Ahmed, B., Khanam, T., Chatziralli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branch+retinal+vein+occlusion:+epidemiology,+pathogenesis,+risk+factors,+clinical+features,+diagnosis,+and+complications.+An+update+of+the+literature.">Branch retinal vein occlusion: epidemiology, pathogenesis, risk factors, clinical features, diagnosis, and complications. An update of the literature.</a> Retina. 33 (5), 901-910 (2013).</li><li>Ho, M., Liu, D. T. L., Lam, D. S. C., Jonas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vein+occlusions,+from+basics+to+the+latest+treatment.">Retinal vein occlusions, from basics to the latest treatment.</a> Retina. 36 (3), 432-448 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+mouse+model+of+branch+retinal+vein+occlusion+and+retinal+neovascularization.">Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).</li><li>Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. 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Las imágenes no invasivas de la retina de roedores presentan una vía para estudiar la patología y desarrollar intervenciones. Estudios previos han desarrollado y optimizado un modelo de ratón de OVR, limitando la variabilidad y permitiendo la traducción fiable de patologías clínicas comunes en la retina murina 5,7,13. Los desarrollos en la tecnología de imagen oftálmica permiten además el uso de técnicas clínicas de ...

La enfermedad neurovascular es un importante problema de salud responsable de accidentes cerebrovasculares isquémicos, una de las principales causas de mortalidad y morbilidad, y enfermedades vasculares retinianas que conducen a la pérdida de visión 1,2. Para modelar la enfermedad neurovascular, empleamos un modelo de ratón de oclusión de la vena retiniana (OVR). Este modelo no es invasivo y utiliza técnicas de imagen in vivo similares a las utilizadas para examinar a las personas con enfermedad vascular retiniana en un entorno clínico. Por lo tanto, el uso de este modelo aumenta el potencial traslacional de los estudios que utilizan este modelo. Al igual que con todos los modelos de ratón, es fundamental maximizar la reproducibilidad del modelo.
Las enfermedades vasculares de la retina son una causa importante de pérdida de visión en personas menores de 70 años. La OVR es la segunda enfermedad vascular retiniana más frecuente después de la retinopatía diabética3. Las características clínicas características de la OVR incluyen lesión isquémica, edema retiniano y pérdida de visión como consecuencia de la pérdida neuronal 3,4. Se han desarrollado y refinado modelos de ratón de OVR utilizando fotocoagulación con láser de los principales vasos para replicar patologías clínicas clave observadas en la OVR humana 5,6,7. Los avances en imágenes oftálmicas también permiten la replicación de herramientas de diagnóstico no invasivas utilizadas en humanos, a saber, la angiografía fluoresceínica (AF) y la tomografía de coherencia óptica (OCT)6. La angiografía fluoresceínica permite observar la fuga debida a la ruptura de la barrera hematoretiniana (BRB), así como la dinámica del flujo sanguíneo en la retina, incluidos los sitios de oclusión, utilizando la inyección de fluoresceína, un pequeño colorante fluorescente 8,9. La imagen de OCT permite la adquisición de imágenes transversales de alta resolución de la retina y el estudio del grosor y la organización de las capas retinianas10. Históricamente, el análisis de las imágenes de AF ha sido en gran medida cualitativo, lo que limita el potencial de comparación directa y reproducible entre los estudios. Recientemente, se han desarrollado varios métodos para la cuantificación del espesor de la capa en imágenes OCT, aunque actualmente no existe un protocolo de análisis estandarizado y el sitio de adquisición de imágenes OCT varía11. Para aprovechar adecuadamente estas herramientas, se necesita una metodología de análisis de datos estandarizada, cuantitativa y replicable. En este artículo, presentamos tres lecturas vasculares utilizadas para evaluar el daño patológico en un modelo de ratón de fuga de RVO-fluoresceína, grosor de la capa de OCT y desorganización de las capas de retina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AK-Fluor 10%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC: 17478-253-10</td>
			<td>light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>NADA #141-199</td>
			<td>keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>00658 06401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSight 2D</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>OCT analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine Hydrochloride</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-0702-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDCL174478-201-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron IV</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>Retinal imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron Meridian Module</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>Laser photocoagulator software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>OCT imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Micron StreamPix Module</td>
			<td>Phoenix Technology Group</td>
			<td></td>
			<td>Fundus imaging and acquisition targeting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh</td>
			<td>Allergan</td>
			<td>94170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC: 174478-102-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDCL 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo vascular injury readouts in mouse retina to promote reproducibility

Los avances en las herramientas de imágenes oftálmicas ofrecen un nivel de acceso sin precedentes a los investigadores que trabajan con modelos animales de lesión neurovascular. Para aprovechar adecuadamente esta mayor traducción, es necesario idear métodos reproducibles para extraer datos cuantitativos de estas imágenes. La tomografía de coherencia óptica (OCT) puede resolver la histología de la retina a una resolución micrométrica y revelar diferencias funcionales en el flujo sanguíneo vascular. Aquí, delineamos lecturas vasculares no invasivas que utilizamos para caracterizar el daño patológico después del insulto vascular en un modelo de ratón optimizado de oclusión de la vena retiniana (OVR). Estas lecturas incluyen análisis de imágenes en vivo de la morfología de la retina, desorganización de las capas internas de la retina (DRIL) medida de isquemia capilar y medidas de angiografía fluoresceínica del edema retiniano y la densidad vascular. Estas técnicas corresponden directamente a las utilizadas para examinar a los pacientes con enfermedad retiniana en la clínica. La estandarización de estos métodos permite la comparación directa y reproducible de modelos animales con fenotipos clínicos de enfermedad oftálmica, aumentando el poder de traducción de los modelos de lesión vascular.

Estos métodos de análisis permiten la cuantificación de la patología retiniana capturada por imágenes de AF y OCT. Los experimentos de los que se extraen los datos representativos utilizaron ratones machos C57BL / 6J que sirvieron como controles no lesionados o se sometieron al procedimiento RVO y recibieron gotas para los ojos de tratamiento Pen1-XBir3 o gotas para vehículos Pen1-Saline para vehículos. El modelo de lesión RVO involucró la irradiación láser (532 nm) de las venas principales en cada ojo de un r...

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In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Aquí, presentamos tres protocolos de análisis de datos para imágenes de angiografía fluoresceínica (AF) y tomografía de coherencia óptica (OCT) en el estudio de la oclusión de la vena retiniana (OVR).

In vivo Lecturas de lesiones vasculares en la retina del ratón para promover la reproducibilidad

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Este protocolo permite al usuario medir cuantitativamente marcadores clínicamente análogos de daño en imágenes de retina de ratón, lo que refuerza la traducibilidad de los hallazgos posteriores. Estos métodos nos permiten agilizar el análisis y nos dan la capacidad de comparar de manera confiable las imágenes entre animales de experimentación. Si bien estos métodos se desarrollaron para estudiar una visión general del modelo de ratón, pueden extenderse fácilmente a la investigación sobre cualquier enfermedad de la retina que utilice las mismas técnicas de imagen.Encienda la caja de luz del microscopio de imágenes de retina, la máquina de tomografía de coherencia óptica y la plataforma de ratón calentado. Encienda el equipo y abra el programa de imágenes. Agregue una gota de fenilefrina y tropicamida a cada ojo.Inyectar 100 microlitros de fluoresceína al 1% intraperitoneal. Coloque el ratón en la plataforma. Ajuste la altura y el ángulo de la plataforma hasta que la vista del fondo de ojo de la retina sea clara y enfocada.Tome una foto del fondo de ojo. Abra el software de imagen y tomografía de coherencia óptica. En el programa de tomografía de coherencia óptica ajustar el empujón a 10.Tome una imagen de tomografía de coherencia óptica, agregue 75 micrómetros distales de la quemadura. Repita para los otros tres cuadrantes de la retina. Cambie la cámara a un filtro de 488 nanómetros.Aumente la ganancia de la cámara a 5. Tome una foto del fondo de ojo exactamente 5 minutos después de la inyección de fluoresceína. Abra la imagen de fluoresceína en el software de procesamiento de imágenes.Duplique la imagen. Usando una herramienta de selección, rastree cuidadosamente los vasos principales. Ignore cualquier vaso que se ramifique de estos recipientes.En la primera imagen, elimine la selección, dejando solo el recipiente. Guarde esta imagen enmascarada. Mueva la selección a la segunda imagen, invierta la selección y elimine, aislando el fondo.Guarde esta imagen enmascarada. Abra la imagen de fondo y mida la densidad integrada. Abra la imagen de los vasos, seleccione el contorno de los vasos y, a continuación, mida la intensidad media.Divida la densidad integrada del fondo por la intensidad media de los vasos, generando la relación de fuga para el ojo. Registre esta relación de fuga para cada ojo en una cohorte experimental. Para controlar aún más el fondo, normalice los ojos experimentales a la proporción media de fugas de los ojos de control no lesionados.Abra la imagen de tomografía de coherencia óptica en el software de procesamiento de imágenes. Trazar los bordes de la capa de células ganglionares, la capa plexiforme interna, la capa nuclear interna, la capa plexiforme externa, la capa fotorreceptora y la capa de EPR. Exporte los archivos como CSV.Mida el grosor medio de cada capa y repita para cada ojo en la cohorte experimental. Abra la imagen de tomografía de coherencia óptica en la imagen J.Con la herramienta de línea, mida la distancia donde el borde superior de la capa plexiforme externa es indistinto. Mide horizontalmente, manteniendo la latitud donde comienza la desorganización.Calcula la suma de las distancias desorganizadas en la imagen. Divide la duración de la desorganización por la longitud total de la retina para obtener la proporción de desorganización. Repita la medición y el cálculo de las imágenes de tomografía de coherencia óptica de los otros tres cuadrantes de la retina.Tomemos la media de las proporciones de desorganización de las cuatro imágenes de tomografía de coherencia óptica. Este número representa la desorganización promedio para toda la retina. Repita para cada ojo en la cohorte experimental.Las imágenes enmascaradas utilizadas para el cálculo de la relación de fuga para cada imagen de retina se pueden comparar con otras y analizar, separando la vasculatura principal de otras áreas de la retina. La cuantificación de fluoresceína permite la comparación de la gravedad de la lesión y la eficacia del tratamiento, así como el estudio de los cambios en la fuga a lo largo del curso de la lesión. Se observa una delineación de las capas de la retina en una imagen de OCT.La cuantificación del grosor de cada capa retiniana muestra que la respuesta edematosa inicial tiene un efecto más profundo en las capas internas de la retina. A partir de un análisis de un curso de tiempo de daño de oclusión de la vena retiniana, se puede observar la hinchazón inflamatoria inicial de las capas retinianas y el eventual adelgazamiento degenerativo. La capa nuclear interna experimenta una respuesta mucho mayor a la lesión inicial, pero la capa plexiforme interna demuestra un adelgazamiento más severo después de que el edema inicial se ha estabilizado y regresa a la línea de base.La desorganización de la capa interna de la retina se manifiesta como una desaparición del límite superior de la capa plexiforme externa, mezclando las capas plexiforme externa y nuclear interna. La desorganización retiniana de dos grupos experimentales se comparó para investigar la eficacia de un inhibidor en la mitigación del daño retiniano. La calidad de imagen es de vital importancia para la calidad del análisis.Al adquirir imágenes de la retina, tómese el tiempo para asegurarse de que el fondo de ojo y las capas de la retina estén lo más claras y enfocadas posible. Estos métodos no invasivos se pueden utilizar longitudinalmente y junto con el estudio bioquímico e inmunohistoquímico del tejido para crear perfiles más multifacéticos y detallados de la enfermedad. Esta técnica permite la cuantificación fiable de datos de imágenes retinianas in vivo en modelos de enfermedad neurovascular para que los datos puedan traducirse más fácilmente a la enfermedad humana.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

En electroporación in vivo de la retina del ratón en desarrollo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome Seccionamiento retina del ratón para preparar cultivos de fotorreceptores

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Un en Vivo Dúo color método de proyección de imagen dinámica Vascular tras lesión medular contundente

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...