Name: a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19
Uploaded: 2022-07-05T13:00:00
Duration: 6 min 46 s
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该研究得到了JDRF拨款2-SRA-2019-695-S-B，2-SRA-2020-965-S-B，1-SRA-2017-564-M_N，NIH拨款DK32083和糖尿病研究中心（DRC）拨款P30 DK116073的支持。

该研究方案得到了科罗拉多州多个机构审查委员会的批准。
1. 缓冲液制备
<ol><li>制备标记缓冲液（2x PBS，pH 7.9）：将100 mL 10x PBS加入400 mL蒸馏水中，并使用NaOH调节pH至7.9。</li>
	<li>制作 3 mM 生物素和 Ru 磺基-NHS：将 1 mg 生物素溶解在 588 μL 标记缓冲液中，并将 150 nmol Ru 磺基-NHS 溶解在 50 μL 标记缓冲液中。</li>
	<li>准备抗原缓冲液（1%BSA）：将5g牛血清白蛋白（BSA）溶解在500mL的1x PBS中。</li>
	<li>制备包衣缓冲液（3%阻断剂A）：将15g阻断剂A溶解在500mL的1x PBS中。</li>
	<li>准备第一个洗涤缓冲液（0.05%吐温20，PBST）：将2.5 mL吐温20与5，000 mL 1x PBS混合。</li>
	<li>准备第二个洗涤缓冲液（0.4 M NaCl）：将 50 mL 的 5 M NaCl 与 575 mL 蒸馏水混合，制成 0.4 M NaCl 溶液。 注意：为了有效标记，请始终使用新鲜制备的生物素和Ru Sulfo-NHS溶液，而不是以前储存的溶液。</li>
</ol>2. 分别用生物素和茹磺基-NHS标记抗原蛋白
注意：建议使用更高浓度的抗原蛋白≥0.5 mg / mL以获得更高的标记效率。
<ol><li>制备六种靶向抗原蛋白溶液，包括胰岛素原、GAD-65、IA-2、ZnT8、TG 和 SARS-CoV-2 刺突蛋白的受体结合域 （RBD）。根据其分子量计算每种抗原蛋白的摩尔数，并制作适当的生物素或Ru磺基-NHS的摩尔比。对于小分子抗原（分子量≤10 kd），抗原与生物素或Ru Sulfo-NHS的总和的比例为1：5。对于中等分子抗原（分子量10-50 kd），例如ZnT8，比例将调整为1：10。对于大分子量抗原（分子量>50kd），例如GAD，摩尔比将为1：20。</li>
	<li>将抗原蛋白分成两个相等的部分，并使用步骤2.1中计算的摩尔比将其与生物素和Ru磺基-NHS分别混合。将混合物在室温（RT）下孵育1.5小时，避免光照。 注意：抗原蛋白缓冲液中的所有还原性化学物质（如Tris或甘氨酸）都需要通过涂有2x PBS（pH 7.9）缓冲液的上浆离心柱去除。</li>
	<li>用2x PBS灌注离心柱（离心柱的大小，2 mL或5 mL，取决于标记抗原蛋白的体积）：向离心柱中加入1ml 2x PBS缓冲液，以1，000 x g 离心2分钟，然后重复步骤2x。</li>
	<li>让抗原蛋白-生物素或-Ru磺基-NHS混合物通过引资离心柱1x（将柱以1，000× g 离心2分钟）纯化并停止标记反应。</li>
	<li>测量从离心柱洗脱的标记抗原蛋白的最终体积，计算生物素或Ru磺基-NHS标记的抗原蛋白的浓度。制作较小的标记抗原蛋白等分试样（50μL/管），并将其储存在-80°C下以供长期使用。 注意：每个离心柱后蛋白质的覆盖率约为90%-95%。</li>
</ol>3. 确定用于 6 重 ECL 测定（棋盘测定）的生物素和 Ru 磺基-NHS 标记抗原的最佳浓度和比例
注意：在整合到多重测定之前，每种抗原的棋盘检测是必要的。
<ol><li>分别对每种抗原应用棋盘测定。 注意：步骤 3.2.-3.7。将使用 TGA 作为简短的示例。TGA棋盘格测定过程是模拟测定过程，但只有一种抗原。</li>
	<li>连续稀释生物素化的tTG和Ru磺基-NHS标记的tTG。对于生物素化和Ru磺基-NHS标记的tTG，第一种混合物溶液的推荐工作浓度从240 ng/mL开始。假设原始生物素化和Ru磺基-NHS标记的tTG的浓度均为1.0μg/ μL.对原始Ru磺基-NHS标记的tTG进行10倍稀释，并用5%BSA稀释原始生物素化的tTG。</li>
	<li>将 4 μL 生物素化的 tTG 蛋白与 156 μL 5% BSA（抗原缓冲液）和 240 μL 链霉亲和素偶联接头混合在一个管中，并将溶液在室温下孵育 30 分钟。然后，加入 160 μL 终止液，并在室温下再孵育 30 分钟。取 400 μL 混合物，与 2 mL 终止液混合。混合物中生物素化的tTG浓度为240ng/mL。</li>
	<li>为了对生物素标记的ZnT8抗原进行连续稀释，请准备另外五个新管，在步骤3.3中从混合物中取出1mL等分试样。并在新管中与 1 mL 终止液混合，得到浓度为 120 ng/mL 的混合物。重复此步骤，进行连续 1：1 稀释，并获得 60 ng/mL、30 ng/mL、15 ng/mL 和 7.5 ng/mL 的生物素标记的 tTG。</li>
	<li>将 4 μL Ru 磺基-NHS 标记的 tTG 与 1.6 mL 终止液一起，并获得浓度为 240 ng/mL 的 Ru 磺基-NHS 标记的 tTG 混合物。使用与 3.4. 相同的步骤，进行连续 1：1 稀释，并在 60 ng/mL、30 ng/mL、15 ng/mL、7.5 ng/mL 和 3.75 ng/mL 下获得 Ru 磺基-NHS 标记的 ZnT8 抗原。最后浓度为0 ng/mL，只有终止溶液，没有Ru磺基-NHS标记的抗原。</li>
	<li>制备 tTG 阳性对照和阴性对照血清样品（通过单次 ECL tTG 测定进行预审和标准化）和 96 孔 PCR 板。将阳性和阴性对照血清样品分别分装到板的左半部分和右半部分，每个孔中各含 7 μL。向板中加入 1x PBS，每孔 33 μL。</li>
	<li>在PCR板的左半部分，向每个孔中加入24μL连续稀释的生物素标记的tTG接头溶液，一根色谱柱的浓度按从高到低的顺序排列。以同样的方式，向每个孔中加入 16 μL 连续稀释的 Ru Sulfo-NHS 标记的 tTG 抗原，一行浓度，然后彻底混合。重复PCR板右半部分的步骤。</li>
	<li>继续步骤5.3.-9.1中描述的其余测定步骤。直到获得原始计数数据。</li>
	<li>计算阳性控制信号与相应负控制信号的比率。确定生物素标记抗原和Ru Sulfo-NHS标记抗原的最佳浓度，具有较高的比率值和阴性对照样品的背景。生物素和Ru磺基-NHS标记抗原蛋白的最佳工作浓度如下所示：GAD65为16.0 ng/mL和8.0 ng/mL，SARS-CoV-2 RBD为18.8 ng/mL和9.4 ng/mL，IA-2为42.0 ng/mL和42.0 ng/mL，tTG为60.0 ng/mL和60.0 ng/mL，ZnT8为4.2 ng/mL和4.2 ng/mL， 胰岛素原分别为 31.3 ng/mL 和 31.3 ng/mL。</li>
</ol>4. 创建接头偶联抗原溶液
<ol><li>按照步骤3.9，用5%BSA稀释生物素和Ru磺基-NHS标记的抗原至最佳工作浓度。</li>
	<li>将预选接头与每种生物素化的抗原蛋白结合。对于一项 96 孔板测定，将 4 μL 生物素化的 GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8 和胰岛素原抗原蛋白加入含有 156 μL 1% BSA 的单独管中，并与 240 μL 相应的链霉亲和素偶联接头 1、2、3、8、9 和 10 混合（图 1）。将混合物在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>在每个试管中等分 160 μL 终止溶液，并将混合物在室温下孵育 30 分钟。从每个试管中取出 400 μL 的混合物溶液并将它们混合在一起。</li>
	<li>向上述混合物中加入 4 μL 标记的 GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8 和胰岛素原抗原的 Ru 磺基-NHS，然后加入 1.6 mL 终止液和 3.2 mL 1x PBS 并混合。现在抗原溶液已准备好用于测定。</li>
</ol>5. 用标记的抗原孵育血清样品
<ol><li>将每孔 7 μL 血清分装到 96 孔 PCR 板中，并用密封膜覆盖。在PCR机上将血清在56°C预热30分钟。将板以100 x g 短暂离心1分钟。</li>
	<li>每孔加入 63 μL 抗原溶液（在步骤 4.4 中制备），并与血清混合。用密封箔覆盖PCR板以避免光线照射。</li>
	<li>在室温下以450rpm摇动板2小时，然后将板在4°C孵育18-24小时。</li>
</ol>6. 准备 6 重板
<ol><li>从4°C冰箱中取出6-Plex板，使板进入室温。 向6-Plex板的每个孔中加入150μL的3%阻断剂A。</li>
	<li>将板放回4°C冰箱中，用箔纸盖住板避光，孵育过夜。 注意：第 1 天的检测步骤包括第 4.-6 节。</li>
</ol>7. 将血清/抗原转入 6-Plex 板中孵育
<ol><li>第二天，从冰箱中取出孵育的 6-Plex 板，将所有缓冲液从盘子中倒出。将盘子拍在纸巾上晾干。</li>
	<li>每次用 150 μL 洗涤缓冲液洗涤 6-Plex 板 3 次。在纸巾上干燥板，将等分血清/抗原从过夜孵育PCR板的每个孔中孵育到6-Plex板的两个孔中（重复每孔30μL）。</li>
	<li>用箔纸盖住板，然后将板放在摇板器上，在室温下以450rpm的速度摇晃1小时。</li>
</ol>8.清洗6-Plex板并添加读数缓冲液
<ol><li>将溶液倒入 6-Plex 板中，每次用 150 μL 0.4 M NaCl 洗涤缓冲液每孔洗涤板 3 次。</li>
	<li>第三次洗涤完成后，将板用纸巾擦干，并向每个孔中加入 150 μL 读数缓冲液。 注意：孔中的气泡会影响读板机的准确性，应不惜一切代价避免。</li>
</ol>9.读取板并分析数据
<ol><li>在电化学发光分析仪上计数板。读数结果将以每秒计数 （CPS） 为单位显示值。使用从读取机获得的原始CPS与每种特异性抗体的内标阳性和阴性对照的CPS计算每个样品的相对抗体指数（指数值= [CPS（样品）-CPS（阴性标准）]/[CPS（阳性标准）-CPS（阴性标准）]）。</li>
	<li>使用ASK研究中555个阴性对照样本（所有抗体阴性样本没有糖尿病或任何其他类型自身免疫性疾病病史或家族史）的第99.5至99.8百分位数处确定阴性或阳性抗体结果。 注意：第 2 天的检测步骤包括第 7-9 节。</li>
</ol>

<ol>
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(159), e61160 (2020).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

T1D的干预已经进入前T1D时代，正在进行的国家和国际T1D大规模筛查计划以及蓬勃发展的临床试验正在1期T1D中应用，以消除或减缓向临床T1D 12，13的进展。使用具有单一IAb检测格式的当前标准RBA测量四个IAb对于质量筛选计划来说既费力又低效。随着对高通量多重IAbs检测的迫切需求，多重ECL检测、3屏幕ICA ELISA和凝集PCR抗体检测（ADAP）已成为当前具有竞争力的技术。在德国幼儿群体中筛查T1D的Fr1da研究中，结合3种IAb（GADA，IA-2A和ZnT8A）的3屏幕ICA ELISA被用作主要测试14。3 屏幕 ICA ELISA 的一个主要限制是缺乏 IAA，IAA 主要是第一个在 T1D 幼儿中患病率较高的 IAb。此外，该测定无法区分三个IAb中的哪一个是阳性和阳性信号，并且每个阳性样品都需要用三个单一测定重复进行确认。ADAP15结合了GADA、IA-2A和IAA，并在IASP研讨会上说明了高检测灵敏度和特异性，但缺乏关于其在基于人群的T1D研究筛查中的预测性的数据，IASP研讨会无法确定这些数据。本研究中的多重ECL检测建立在单一ECL检测平台上，该平台已在TrailNet9，16，DAISY17，18，19和ASK4，20，21等多项临床试验中根据当前标准RBA进行了验证。 研究。本测定已使用来自ASK研究参与者的880个血清样本针对RBA和单一ECL测定进行了验证。如图2和图3所示，6-Plex和单个ECL之间或6-Plex和RBA之间的抗体水平在抗体阳性方面大多一致。RBA和6-Plex测试的IAbs符合率为91.7%-97.8%，单ECL和6-Plex测试的IAbs符合率为95.3%-99.2%。ECL测定和RBA之间的不一致主要来自单一IAb的测定。6-Plex和Single ECL（r = 0.6431-0.9434，所有p < 0.0001）以及6-Plex和RBA（r = 0.5775-0.8576，所有p < 0.0001）测试的IAb水平也具有良好的相关性。通过6-Plex测定测试的TGA与RBA（99.4%）和单次ECL测定（99.4%）的结果高度相关。此外，通过 6-Plex 测试的 COVID-19A 与单次 ECL 检测结果的符合性达到 99.8%。
因此，6-Plex ECL检测已被正式接受为正在进行的ASK研究的主要筛选方法，并取代了标准的RBA22。与标准RBA相比，该测定证明了其出色的灵敏度和特异性，具有更高的通量、更低的成本和更小的血清体积。
据记载，在 T1D 筛查研究中，由 RBA 检测到的单个 IAb 占 IAb 阳性的很大一部分，亲和力低，疾病风险低，导致总体预测值低19，21，23，24，25，26。这种低风险预测导致随访的巨大额外成本，并导致T1D预防研究的困难。已建立的ECL检测平台已在多项临床试验中得到证明，可以区分高亲和力IAb和RBA生成的低亲和力IAb，并显着提高所有四种IAb的预测值，尤其是单个IAb阳性16，17，18，21.多重ECL检测技术建立在单一ECL检测平台上，具有检测高亲和力Abs的明显优势。在本研究中，6-Plex ECL测定说明了其在灵敏度和特异性方面与相应的单一ECL测定的相似性。
使用多个Plex板的多重ECL测定的一些局限性和技术问题已经在以前的出版物27，28中进行了介绍。在一个孔中有六个标记的抗原，不同抗原之间可能存在一些影响，并且在同一孔中添加每个抗体检测进行多重检测时，检测背景可能会增加。调整检测条件需要大量的检测优化工作，特别是基于棋盘检测对每种抗原的测定来调整每种标记抗原蛋白的最终浓度，以保持每种抗体检测的灵敏度和特异性。如先前的研究27，28所述，少量样本（<1%）在没有明确根本原因的情况下导致多个Plex板上的假阳性。所有阳性结果应重复并通过单次ECL测定进行确认，作为常规实验室质量保证;通常，误报将被删除。由先前的7-Plex ECL测定27，28中观察到的“前列腺效应”引起的假阴性结果在本研究中未观察到。在这里描述的测定中，我们从先前的方案中删除了血清样品的酸处理步骤;相反，我们将血清样品在56°C下预热30分钟（步骤5.1）。在板洗涤的第二天，我们使用含有0.4M NaCl的洗涤缓冲液代替常规洗涤缓冲液，以更严格地洗涤板。这些修改使多重ECL检测更简单，背景更低，而不会失去检测灵敏度。
总之，该测定在同时检测四种IAb、TGA和COVID-19A方面具有出色的性能。多重功能，以及高通量、低成本和小血清容量要求，使得在一般人群中大规模筛查T1D和伴随疾病变得更加可行。患有T1D或任何自身免疫性疾病的患者患其他自身免疫性疾病的风险要高得多。多重ECL检测为同时筛查T1D和多种自身免疫性疾病提供了一个极好的平台。

全球大型流行病学研究表明，1型糖尿病（T1D）的发病率每年以3%-5%的速度迅速增加，T1D的患病率在过去20年中翻了一番，特别是在幼儿中1，2。胰岛自身抗体（IAbs）通常在临床症状出现前几年出现，是目前T1D3最可靠的预测和诊断生物标志物。筛查 T1D 自身抗体可以识别有进展为临床 T1D 风险的人，教育公众，在很大程度上减少酮症酸中毒危及生命的并发症，并有益于预防治疗的临床试验。全球范围内对T1D的预防工作正在进行中，并且正在IAbs阳性的受试者中进行多项干预试验，以延缓向临床T1D的进展，芭芭拉戴维斯糖尿病中心于2016年启动了美国首个针对普通人群筛查T1D和乳糜泻的临床试验，儿童自身免疫筛查（ASK）4.乳糜泻（CD）是一种与免疫和遗传因素有关的慢性肠道炎症性疾病。T1D 患儿中克罗恩病的患病率可高达 24.5%5。超过一半的克罗恩病患者在第6次就诊时可能没有典型症状，因此乳糜泻的血清学筛查是非常必要的。
自 2019 年冠状病毒病 （COVID-19） 大流行开始以来，全球已报告了超过 2 亿例病例，儿童占实验室确诊病例的 16%7.许多研究表明，现有 T1D 对 COVID-19 感染的严重程度和死亡率的影响8，而 COVID-19 感染对 T1D 发展的影响尚不清楚。通过确定严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 （SARS-COV-2） 抗体来调查普通人群中的 COVID-19 感染总率，以及研究 COVID-19 感染与触发 T1D 自身免疫或加速 T1D 进展之间的关联是迫切需要且非常重要的，而正在进行的 ASK 研究是一个很好的平台。由于单一的检测形式和产生大比例的低亲和力抗体阳性，标准放射性结合检测（RBA）遇到了低效率和低疾病特异性的瓶颈9。在本文中，我们提出了一种新颖的 6 重电化学发光 （ECL） 测定，该测定基于我们之前的多重 ECL 测定平台，使用多重板，在一个孔中结合六种自身抗体测定，包括胰岛素 （IAA）、谷氨酸脱羧酶-65 （GADA）、胰岛素瘤抗原-2 （IA-2A） 和锌转运-8 （ZnT8A），用于乳糜泻的谷氨酰胺转氨酶 （TGA） 自身抗体， 和 SARS-CoV-2 受体结合域 （RBD） 抗体 （COVID-19A）。这是第一个招募了四个主要IAb的完整小组并将其与TGA和COVID-19A相结合的多重检测。它已被验证并正式接受为取代ASK研究中标准RBA的主要筛选工具。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mM NaCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1070832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PI21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker A</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R93AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top 500 ml-Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974064A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAD65 protein</td>
			<td>Diamyd Medical</td>
			<td>10-65702-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IA-2 protein (aa 605-979)</td>
			<td>Creative BioMart</td>
			<td>283309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MESO QuickPlex SQ120</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R31QQ-3</td>
			<td>Electrochemiluminescence analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proinsulin protein</td>
			<td>AmideBio</td>
			<td>20160118B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer B</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0800019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 RBD protein</td>
			<td>Creative Biomart</td>
			<td>Spike-190V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0090019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-TAG</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tTG protein</td>
			<td>Diarect AG</td>
			<td>15201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Plex 6-Assay SECTOR plate</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Z00U0142E</td>
			<td>6-plex plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 1</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 10</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 2</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0020015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 3</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0030018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 8</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0080018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 9</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0090014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeBa Column</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89892</td>
			<td>Spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnT8 protein</td>
			<td>Research Laboratory</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19

一项正在进行的临床试验，儿童自身免疫筛查（ASK），是美国第一个针对普通人群的1型糖尿病（T1D）和乳糜泻筛查研究。随着 2019 年冠状病毒病 （COVID-19） 大流行，迫切需要在普通人群中了解 COVID-19 的流行病学以及有关 COVID-19 感染与 T1D 发展之间关联的知识。目前放射性结合测定（RBA）的标准筛选方法遇到了两大挑战：单一测定形式的低效率以及筛选中产生大量低亲和力抗体的低疾病特异性。利用我们之前建立的多重电化学发光 （ECL） 检测平台，开发了一种新型 6-Plex ECL 检测方法，该检测方法将所有四种胰岛自身抗体 （IAb） 结合在一个孔中，用于胰岛素、谷氨酸脱羧酶 （GAD65）、胰岛素瘤抗原 2 （IA-2） 和锌转运蛋白 8 （ZnT8） 用于 T1D，谷氨酰胺转移酶自身抗体 （TGA） 用于乳糜泻，以及严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） 受体结合域 （RBD） 抗体 新冠肺炎 （COVID-19）。使用来自ASK研究的880个样本（包括325个阳性样本和555个全抗体阴性样本）盲验证了该测定，并与标准RBA和单个ECL测定进行了比较。凭借高效、低成本和低血清量的优点，该测定已被接受为 ASK 研究的主要筛选工具。

表1、表2和表3说明了代表性结果。从读取机获得的原始CPS如表1所示。在表2中，原始CPS按6种接头和相应的抗体进行排列和分类。表3显示了测定方案中描述的CPS计算的指数值。应检查所有原始计数值，以避免因错误重复而导致错误的最终索引结果。在表 1 中，给出了错误重复的示例，这导致了表 3 中最终索引计算的错误。
该测定使用ASK研究中的880个选定样品以盲法验证，其中325个IAbs阳性样品和555个全Abs阴性样品。将880个样品的6-Plex ECL测定的自身抗体水平与相应的单次ECL测定水平（图2）和相应的单一标准RBA（图3）逐点比较。每种抗体的临界值、灵敏度和特异性列于 表4中。 该ECL-COVID-19A测定的灵敏度和特异性已分别确定为100%和99.9%10。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig01.jpg"> 图 1：6 重 ECL 测定的示意图。 血清自身抗体使Ru Sulfo-NHS标记的抗原与生物素化抗原连接，生物素化抗原与特异性接头偶联并形成抗原-抗体-抗原-接头的复合物。复合物通过每个特定的接头捕获到6-Plex板中的特定点上。对于每种抗原，分配特定的接头编号：GAD-接头-1、Covid-19-接头-2、IA-2-接头-3、tTG-接头-8、ZnT8-接头-9和Proinslulin-接头-10。该图经He等人许可进行了修改11。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig02.jpg"> 图 2：来自 ASK 研究的 880 个样品中 6 种抗体水平的比较，即单次 ECL 测定和 6 重 ECL 测定。 该面板分别显示了GADA，IAA，IA-2A，ZnT8A，TGA和COVID-19A的抗体水平比较（COVID-19A的指数显示为（100 x计算的指数值））。虚线表示每种抗体测定的测定截止值。该图经He等人许可进行了修改11。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig03.jpg"> 图 3：来自 ASK 研究的 880 个样品中 RBA 和 6-Plex ECL 测定的五种抗体水平的比较。 这些面板分别显示了GADA，IAA，IA-2A，ZnT8A和TGA的抗体水平比较。虚线表示每种抗体测定的测定截止值。该图经He等人许可进行了修改11。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
表1：原始CPS计数（板的左半部分）。 从检测板的左半部分获得的原始CPS计数。每个样本一式两份。同一列（A1、A2、A3 等）中的每个 CPS 计数表示来自同一孔中 10 个点的读数数据（标记了相应的接头编号）。错误重复的示例以灰色突出显示，如第 D 链接器 3 行第 5 列和第 6 列所示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%201.zip" target="_blank">请按此下载此表格。</a>
表 2：表 1 数据的排列，使用六个链接器排序。 重新排列表1中的CPS值，计算CPS重复读数的平均值并删除接头4-7的未使用值。每种自身抗体测定的内标高阳性、低阳性和阴性对照的值以深粗体标记。PC，阳性对照。NC，阴性对照。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%202.zip" target="_blank">请按此下载此表格。</a>
表 3：指数值的结果。 根据相应的阳性和阴性对照计算所有六种抗体的每个样品的指数值。大于截止值的指数值定义为正值，以深色粗体标记。 表 1 第 D 行接头第 3 行第 5 列和第 6 行中的错误重复 CPS 值导致样本 11 的 IA-2A 指数值为正值（以灰色突出显示），这可能是假阳性结果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table_3.xlsx" target="_blank">请按此下载此表格。</a>
表 4：880 个 ASK 样品中 GADA、IA-2A、ZnT8A、IAA 和 TGA 的检测截止值、灵敏度和特异性，包括 325 个 IAbs 阳性样品和 555 个全抗体阴性样品。 GADA、IA-2A、ZnT8A、IAA 和 TGA 测定的最佳临界指数值至少设置为 555 个正常对照样品的第 99 个百分位数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%204.zip" target="_blank">请按此下载此表格。</a>

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A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19

根据2019年筛查1型糖尿病、乳糜泻和冠状病毒病的迫切需要，我们开发了一种高通量6-Plex电化学发光测定法，可同时检测所有四种胰岛自身抗体、组织谷氨酰胺转移酶自身抗体和针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2受体结合域的抗体。

针对 1 型糖尿病、乳糜泻和 COVID-19 的高通量多重筛查

An ongoing clinical trial, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), is the first screening study in the general population for type 1 diabetes (T1D) and ...

新型 6-Plex ECL 检测是第一个经过验证的多重检测，现已应用于一般人群筛查的临床试验。它同时结合了六种自身抗体检测方法，适用于在大量人群中筛查 1 型糖尿病、乳糜泻和 COVID-19。与目前的标准自身抗体检测相比，该技术可以更有效地同时筛选多种自身免疫性疾病的多种自身抗体。该技术的意义将使大规模筛查更加可行和具有疾病特异性，从而为预防提供早期疾病预测和更精确的治疗诊断。首先，将四微升生物素化的 GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8 和胰岛素原抗原蛋白加入含有 156 微升 1%BSA 的试管中，并与 240 微升相应的链霉亲和素偶联接头 1、2、3、8、9 和 10 混合。然后，将混合物在室温下孵育30分钟。将160微升终止溶液分装到每个管中，并将混合物在室温下孵育30分钟。现在，从每个管中取出400微升的混合物溶液并将它们混合在一起。向混合物中加入四微升钌标记的 GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8 和胰岛素原抗原。然后，加入1.6毫升停止溶液和3.2毫升PBS。彻底混合所有成分。现在，抗原溶液已准备好用于测定。对于 96 孔 PCR 板，每孔等分试样 7 微升血清，并用密封膜覆盖板。接下来，在PCR机上将血清在56摄氏度下预热30分钟，并以100倍G短暂离心板一分钟。每孔加入63微升制备的抗原溶液，与血清混合，并用密封箔覆盖PCR板以避免光照。在室温下以 450 rpm 的速度在摇床上摇晃板两个小时。然后，将板在 4 摄氏度下孵育 18 至 24 小时。从四摄氏度的冰箱中取出一个 6 重盘子，让盘子达到室温。然后，向6-Plex板的每个孔中加入150微升3%阻断剂A。用箔纸盖住盘子以避免光线。将盘子放回四摄氏度的冰箱中，孵育过夜。在孵育结束时，一旦将板从冰箱中取出，从培养皿中取出所有缓冲液。将盘子拍在纸巾上晾干，每次用每孔150微升洗涤缓冲液洗涤三次。在纸巾上干燥板，并从过夜孵育PCR板的每个孔中等分试样30微升血清抗原孵育到6-Plex板的两个孔中。用箔纸盖住板，然后将板放在摇盘器上，在室温下以 450 rpm 的速度摇晃一小时。倾倒存在于6-Plex板中的溶液，并用每孔150微升0.4M氯化钠洗涤缓冲液洗涤板三次。第三次洗涤完成后，用纸巾擦干板，并向每个孔中加入150微升读数缓冲液。来自 6-Plex ECL 测定的 GADA、IAA、IA-2A、ZnT8A、TGA 和 COVID-19A 的六种自身抗体水平与其相应的 6 种单 ECL 测定以及当前的标准放射性结合测定密切相关。根据相应的阳性和阴性对照计算所有六种抗体的每个样品的指数值。观察到指数值大于截止值，这表明结果为阳性。血清中的自身抗体将钌标记的抗原破坏为生物素化抗原，形成具有特异性接头的复合物，构建多重平台。这种策略使在普通人群中对一型糖尿病及其伴随疾病的大规模筛查更加可行和有效，从而对疾病进行早期预测和预防。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

加速1型糖尿病感应在小鼠体内的过继转移致糖尿病的CD4 + T细胞

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

科研

免疫与感染

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

用于适应高通量/高含量筛查的细胞内分枝杆菌定量的微观表型检测

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

高通量筛选RNA病毒的广谱化学抑制剂

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

高通量设置的建立筛选小分子能调节C-二GMP信令<em&gt;绿脓杆菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

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基于荧光的淋巴细胞检测适用于小分子的高通量筛选

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Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

无细胞生化荧光酶法测定高密度脂蛋白脂质过氧化的高通量测定

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A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

高通量的高效液氧活化病毒膜融合检测 HIV-1 病毒膜融合抑制剂的研究

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

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Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

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一种高通量志贺氏菌特异性杀菌试验

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

非酒精性脂肪性肝炎合并2型糖尿病的一种先进的小鼠模型

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...