Name: a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19
Uploaded: 2022-07-05T13:00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19 at JoVE.com

Undersøgelsen blev støttet af JDRF-tilskud 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, NIH-tilskud DK32083 og Diabetes Research Center (DRC) tilskud P30 DK116073.

Forskningsprotokollen blev godkendt af Colorado Multiple Institutional Review Board.
1. Forberedelse af buffer
<ol><li>Forbered mærkningsbufferen (2x PBS, pH 7,9): Tilsæt 100 ml 10x PBS til 400 ml destilleret vand, og juster pH ved hjælp af NaOH til 7,9.</li>
	<li>Lav 3 mM biotin og Ru Sulfo-NHS: Opløs 1 mg biotin i 588 μL mærkningsbuffer og opløs 150 nmol Ru Sulfo-NHS i 50 μL mærkningsbuffer.</li>
	<li>Antigenbufferen (1% BSA): 5 g bovint serumalbumin (BSA) opløses i 500 ml 1x PBS.</li>
	<li>Forbered belægningsbufferen (3% blokker A): Opløs 15 g blokker A i 500 ml 1x PBS.</li>
	<li>Forbered den første vaskebuffer (0,05 % Tween 20, PBST): Bland 2,5 ml Tween 20 i 5.000 ml 1x PBS.</li>
	<li>Forbered den anden vaskebuffer (0,4 M NaCl): Bland 50 ml 5 M NaCl i 575 ml destilleret vand for at fremstille 0,4 M NaCl-opløsningen. BEMÆRK: For effektiv mærkning skal du altid bruge frisklavede biotin- og Ru Sulfo-NHS-opløsninger og ikke opbevarede dem, der er fremstillet tidligere.</li>
</ol>2. Antigenproteinmærkning med biotin og Ru Sulfo-NHS separat
BEMÆRK: En højere koncentration af antigenprotein ≥0,5 mg / ml anbefales til højere mærkningseffektivitet.
<ol><li>Forbered seks målrettede antigenproteinopløsninger, herunder proinsulin, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG og receptorbindende domæne (RBD) af spike-proteinet af SARS-CoV-2. Beregn mol af hvert antigenprotein i henhold til dets molekylvægt og lav passende molære forhold mellem biotin eller Ru Sulfo-NHS. Forholdet mellem antigen og summen af biotin eller Ru Sulfo-NHS vil være 1: 5 for små molekylære antigener (molekylvægt ≤10 kd), såsom proinsulinprotein. For mellemmolekylære antigener (molekylvægt 10-50 kd), såsom ZnT8, justeres forholdet til 1:10. For antigener med stor molekylvægt (molekylvægt >50 kd), såsom GAD, vil molforholdet være 1:20.</li>
	<li>Andel antigenproteinet i to lige store dele og bland det separat med biotin og Ru Sulfo-NHS ved hjælp af det beregnede molære forhold i trin 2.1. Inkuber blandingen ved stuetemperatur (RT) i 1,5 timer, undgå lys. BEMÆRK: Alle reducerende kemikalier som Tris eller glycin i bufferen af antigenprotein skal fjernes ved hjælp af en størrelsesspinkolonne grundet med en buffer på 2x PBS (pH 7,9).</li>
	<li>Prime spinkolonnerne med 2x PBS (størrelsen på spinkolonnen, 2 ml eller 5 ml, afhænger af volumenet af mærkningsantigenproteinet): Tilsæt 1 ml 2x PBS-buffer til spinkolonnen, centrifuger den ved 1.000 x g i 2 minutter, og gentag trinnet 2x mere.</li>
	<li>Lad antigenprotein-biotin- eller -Ru Sulfo-NHS-blandingen gå gennem den grundede spinkolonne 1x (centrifuge søjlen ved 1.000 x g i 2 minutter) til oprensning og stoppe mærkningsreaktionen.</li>
	<li>Mål det endelige volumen af det mærkede antigenprotein elueret fra spinkolonnerne, og beregn koncentrationerne af biotin- eller Ru Sulfo-NHS-mærket antigenprotein. Lav mindre alikvoter af mærket antigenprotein (50 μL / rør) og opbevar dem ved -80 ° C til langvarig brug. BEMÆRK: Dækningen af protein efter hver spinkolonne vil være en ca. 90% -95% retentionsrate.</li>
</ol>3. Definer den bedste koncentration og forhold for biotin- og Ru Sulfo-NHS-mærkede antigener til 6-Plex ECL-assay (skakbrætassay)
BEMÆRK: Skakbrætassayet for hvert antigen er nødvendigt før integration i det multipleksede assay.
<ol><li>Påfør skakbrætassayet for hvert antigen separat. BEMÆRK: Trin 3.2.-3.7. vil bruge TGA som et kort eksempel. TGA-skakbrætanalyseprocessen er at simulere analyseprocessen, men med kun en slags antigen.</li>
	<li>Lav seriel fortynding af den biotinylerede tTG og Ru Sulfo-NHS-mærkede tTG. De anbefalede arbejdskoncentrationer af den første blandingsopløsning starter fra 240 ng/ml for både biotinyleret og Ru Sulfo-NHS-mærket tTG. Antag, at koncentrationerne af både original biotinyleret og Ru Sulfo-NHS-mærket tTG er 1,0 μg / μL. Lav en 10x fortynding af den oprindelige Ru Sulfo-NHS-mærkede tTG og en 5x fortynding af den oprindelige biotinylerede tTG med 5% BSA.</li>
	<li>Bland 4 μL biotinyleret tTG-protein med 156 μL 5% BSA (antigenbuffer) og 240 μL af den streptavidinkonjugerede linker i et rør, og opløsningen inkuberes ved RT i 30 min. Tilsæt derefter 160 μL stopopløsning, og inkuber ved RT i yderligere 30 minutter. Tag 400 μL af blandingen og bland med 2 ml stopopløsning. Koncentrationen af det biotinylerede tTG i blandingen er 240 ng/ml.</li>
	<li>For at fremstille en seriel fortynding for biotinmærket ZnT8-antigen skal du forberede yderligere fem nye rør, tage 1 ml af en aliquot fra blandingen i trin 3.3. og bland med 1 ml stopopløsning i et nyt rør, og få blandingen med en koncentration på 120 ng/ml. Gentag dette trin, lav serielle 1: 1 fortyndinger, og få den biotinmærkede tTG ved 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml og 7,5 ng / ml.</li>
	<li>Tilsæt 4 μL Ru Sulfo-NHS-mærket tTG med 1,6 ml stopopløsning, og få en blanding af Ru Sulfo-NHS-mærket tTG i en koncentration på 240 ng / ml. Med de samme trin på 3.4. foretages serielle 1: 1 fortyndinger og får Ru Sulfo-NHS-mærket ZnT8-antigen ved 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml, 7,5 ng / ml og 3,75 ng / ml. Den sidste koncentration er 0 ng/ml, med kun stopopløsning og intet Ru Sulfo-NHS-mærket antigen.</li>
	<li>Forbered tTG-positive kontrol- og negative kontrolserumprøver (prækvalificeret og standardiseret ved et enkelt ECL tTG-assay) og en 96-brønds PCR-plade. Aliquot de positive og negative kontrolserumprøver til henholdsvis venstre halvdel og højre halvdel af pladen med 7 μL i hver brønd. Tilsæt 1x PBS til pladen med 33 μL pr. Brønd.</li>
	<li>På venstre halvdel af PCR-pladen tilsættes 24 μL af den serielle fortyndede biotinmærkede tTG-linkeropløsning til hver brønd, en kolonne med en koncentration i rækkefølge fra højeste til laveste. På samme måde tilsættes 16 μL af det serielle fortyndede Ru Sulfo-NHS-mærkede tTG-antigen til hver brønd, en række med en koncentration, og blandes derefter grundigt. Gentag trinnet på højre halvdel af PCR-pladen.</li>
	<li>Fortsæt resten af analysetrinnene beskrevet i trin 5.3.-9.1. indtil de rå tælledata er opnået.</li>
	<li>Beregn forholdet mellem positive styresignaler og tilsvarende negative styresignaler. Bestem den bedste koncentration for det biotinmærkede antigen og det Ru Sulfo-NHS-mærkede antigen med højere forholdsværdier og lavere baggrund for den negative kontrolprøve. De optimale arbejdskoncentrationer af biotin- og Ru Sulfo-NHS-mærket antigenprotein er vist nedenfor: 16,0 ng/ml og 8,0 ng/ml for GAD65, 18,8 ng/ml og 9,4 ng/ml for SARS-CoV-2 RBD, 42,0 ng/ml og 42,0 ng/ml for IA-2, 60,0 ng/ml og 60,0 ng/ml for tTG, 4,2 ng/ml og 4,2 ng/ml for ZnT8, og 31,3 ng/ml og 31,3 ng/ml for proinsulin.</li>
</ol>4. Opret linkerkoblet antigenopløsning
<ol><li>Fortynd de biotin- og Ru Sulfo-NHS-mærkede antigener med 5% BSA til de optimale arbejdskoncentrationer i henhold til trin 3.9.</li>
	<li>Bind forudvalgte linkere til hvert biotinyleret antigenprotein. For et 96-brønds pladeassay tilsættes 4 μL biotinyleret GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 og proinsulinantigenprotein i et separat rør indeholdende 156 μL 1% BSA og blandes med 240 μL af tilsvarende streptavidinkonjugerede linkere 1, 2, 3, 8, 9 og 10 (figur 1). Inkuber blandingen i 30 minutter ved RT.</li>
	<li>Aliquot 160 μL stopopløsning i hvert rør og inkuberes blandingen ved RT i 30 min. Tag 400 μL af blandingsopløsningen ud af hvert rør og kombiner dem sammen.</li>
	<li>Tilsæt 4 μL Ru Sulfo-NHS mærket GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 og proinsulinantigen til blandingen ovenfor, og tilsæt derefter 1,6 ml stopopløsning og 3,2 ml 1x PBS og bland. Nu er antigenopløsningen klar til brug i analysen.</li>
</ol>5. Inkuber serumprøver med det mærkede antigen
<ol><li>Aliquot 7 μL serum pr. brønd til en 96-brønds PCR-plade og dæksel med tætningsfilm. Forvarm seraen ved 56 °C i 30 minutter på en PCR-maskine. Centrifuger pladen kortvarigt ved 100 x g i 1 min.</li>
	<li>Der tilsættes 63 μL antigenopløsning (fremstillet i trin 4.4) pr. boring, og blandes med seraen. Dæk PCR-pladen med tætningsfolie for at undgå lys.</li>
	<li>Ryst pladen på en ryster ved 450 o / min ved RT i 2 timer, og inkuber derefter pladen ved 4 ° C i 18-24 timer.</li>
</ol>6. Forbered 6-Plex-pladen
<ol><li>Tag en 6-Plex plade fra 4 °C køleskabet, så pladen kan komme til RT. Tilsæt 150 μL 3% Blocker A til hver brønd af 6-Plex pladen.</li>
	<li>Sæt pladen tilbage i 4 °C køleskab, dæk pladen med folie for at undgå lys, og inkuber natten over. BEMÆRK: Analysetrin i dag 1 omfatter afsnit 4.-6.</li>
</ol>7. Overfør serum/antigen inkuberer til 6-Plex-pladen
<ol><li>Den næste dag skal du tage den inkuberende 6-Plex-plade fra køleskabet og dumpe al bufferen ud af pladen. Klap tallerkenen på køkkenrulle for at tørre ud.</li>
	<li>Vask 6-Plex pladen 3x med 150 μL vaskebuffer pr. brønd hver gang. Tallerkenen tørres på køkkenrulle, og aliquotserum/antigen inkuberes fra hver brønd i den natlige inkuberende PCR-plade i to brønde på 6-Plex-pladen (30 μL pr. brønd for dubletter).</li>
	<li>Dæk pladen med folie, sæt derefter pladen på en pladeryster, og ryst med en hastighed på 450 o / min ved RT i 1 time.</li>
</ol>8. Vask 6-Plex-pladen, og tilføj læsebuffer
<ol><li>Opløsningen dumpes i 6-Plex-pladen, og pladen vaskes 3x med 150 μL 0,4 M NaCl-vaskebuffer pr. brønd hver gang.</li>
	<li>Når den tredje vask er færdig, tørres pladen mod køkkenrullen, og der tilsættes 150 μL læsebuffer i hver brønd. BEMÆRK: Luftbobler i brønden påvirker nøjagtigheden af pladelæsermaskinen og bør undgås for enhver pris.</li>
</ol>9. Læs pladen og analyser dataene
<ol><li>Tæl pladen på en elektrokemiluminescensanalysator. Læseresultaterne vil blive præsenteret med værdierne i tællinger pr. sekund (CPS). Beregn det relative antistofindeks for hver prøve ved hjælp af den rå CPS opnået fra læsemaskinen mod CPS for de interne standard positive og negative kontroller af hvert specifikt antistof (indeksværdi = [CPS (prøve) - CPS (negativ standard)] / [CPS (positiv standard) - CPS (negativ standard)]).</li>
	<li>Bestem negative eller positive antistofresultater ved hjælp af de afskæringsværdier, der er etableret ved 99,5til 99,8procent af 555 negative kontrolprøver fra ASK-undersøgelsen (alle antistoffer negative prøver uden historie eller familiehistorie af diabetes eller nogen anden form for autoimmun sygdom). BEMÆRK: Analysetrin i dag 2 omfatter afsnit 7-9.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Group, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Environmental+Determinants+of+Diabetes+in+the+Young+(TEDDY)+Study.">The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY) Study.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1150, 1-13 (2008).</li><li>Vehik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+incidence+of+type+1+diabetes+in+0-+to+17-year-old+Colorado+youth.">Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth.</a> Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).</li><li>Insel, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+presymptomatic+type+1+diabetes:+a+scientific+statement+of+JDRF,+the+Endocrine+Society,+and+the+American+Diabetes+Association.">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li><li>Stahl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+screening+for+celiac+disease:+The+autoimmunity+screening+for+kids+study.">Mass screening for celiac disease: The autoimmunity screening for kids study.</a> The American Journal of Gastroenterology. 116 (1), 180-187 (2021).</li><li>Al-Hussaini, A., Sulaiman, N., Al-Zahrani, M., Alenizi, A., El Haj, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+celiac+disease+among+Saudi+children+with+type+1+diabetes:+A+prospective+cross-sectional+study.">High prevalence of celiac disease among Saudi children with type 1 diabetes: A prospective cross-sectional study.</a> BMC Gastroenterology. 12, 180 (2012).</li><li>Agardh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+features+of+celiac+disease:+A+prospective+birth+cohort.">Clinical features of celiac disease: A prospective birth cohort.</a> Pediatrics. 135 (4), 627-634 (2015).</li><li>COVID-19: Clinical manifestations and diagnosis in children. UpToDate Available from: <a target="_blank" href="https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print">https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print</a> (2021)</li><li>Barron, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+type+1+and+type+2+diabetes+with+COVID-19-related+mortality+in+England:+a+whole-population+study.">Associations of type 1 and type 2 diabetes with COVID-19-related mortality in England: a whole-population study.</a> The Lancet Diabetes &amp; Endocrinology. 8 (10), 813-822 (2020).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemiluminescence+assays+for+insulin+and+glutamic+acid+decarboxylase+autoantibodies+improve+prediction+of+type+1+diabetes+risk.">Electrochemiluminescence assays for insulin and glutamic acid decarboxylase autoantibodies improve prediction of type 1 diabetes risk.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).</li><li>Jia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+SARS-CoV-2+antibodies+in+children+and+adults+with+Type+1+diabetes.">Prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in children and adults with Type 1 diabetes.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 23 (7), 517-521 (2021).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multiplex+electrochemiluminescence+assay+applicable+to+general+population+screening+for+type+1+diabetes+and+celiac+disease.">High-throughput multiplex electrochemiluminescence assay applicable to general population screening for type 1 diabetes and celiac disease.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. , (2022).</li><li>McQueen, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+and+cost-effectiveness+of+large-scale+screening+for+type+1+diabetes+in+Colorado.">Cost and cost-effectiveness of large-scale screening for type 1 diabetes in Colorado.</a> Diabetes Care. 43 (7), 1496-1503 (2020).</li><li>Insel, R. A., Dunne, J. L., Ziegler, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+population+screening+for+type+1+diabetes:+has+its+time+come.">General population screening for type 1 diabetes: has its time come.</a> Current Opinion in Endocrinology &amp; Diabetes and Obesity. 22 (4), 270-276 (2015).</li><li>Ziegler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+Screen+ELISA+for+high-throughput+detection+of+beta+cell+autoantibodies+in+capillary+blood.">3 Screen ELISA for high-throughput detection of beta cell autoantibodies in capillary blood.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).</li><li>Cortez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+multiple+islet+autoantibodies+in+type+1+diabetes+using+small+sample+volumes+by+agglutination-PCR.">Sensitive detection of multiple islet autoantibodies in type 1 diabetes using small sample volumes by agglutination-PCR.</a> PLoS One. 15 (11), 0242049 (2020).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL-IAA+and+ECL-GADA+can+identify+high-risk+single+autoantibody-positive+relatives+in+the+TrialNet+pathway+to+prevention+study.">ECL-IAA and ECL-GADA can identify high-risk single autoantibody-positive relatives in the TrialNet pathway to prevention study.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinsulin/Insulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity.">Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes.">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk:+Nonradioactive+bivalent+proinsulin/insulin+autoantibody+assay.">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: Nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+sensitivity+and+earlier+identification+of+celiac+disease+autoimmunity+by+a+nonradioactive+assay+for+transglutaminase+autoantibodies.">Higher sensitivity and earlier identification of celiac disease autoimmunity by a nonradioactive assay for transglutaminase autoantibodies.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 2904563 (2016).</li><li>Jia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+ZnT8+autoantibodies+by+electrochemiluminescence+assay+improve+risk+prediction+for+type+1+diabetes.">High-affinity ZnT8 autoantibodies by electrochemiluminescence assay improve risk prediction for type 1 diabetes.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (12), 3455-3463 (2021).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete-panel+islet+autoantibody+multiplex+ECL+assay.">A complete-panel islet autoantibody multiplex ECL assay.</a> Diabetes. 70, 158 (2021).</li><li>Achenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+high-affinity+immune+responses+to+(pro)insulin+anticipate+the+autoimmune+cascade+that+leads+to+type+1+diabetes.">Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (4), 589-597 (2004).</li><li>Schlosser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+insulin-autoantibody-positive+children+from+the+general+population,+antibody+affinity+identifies+those+at+high+and+low+risk.">In insulin-autoantibody-positive children from the general population, antibody affinity identifies those at high and low risk.</a> Diabetologia. 48 (9), 1830-1832 (2005).</li><li>Mayr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD+autoantibody+affinity+and+epitope+specificity+identify+distinct+immunization+profiles+in+children+at+risk+for+type+1+diabetes.">GAD autoantibody affinity and epitope specificity identify distinct immunization profiles in children at risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 56 (6), 1527-1533 (2007).</li><li>Siljander, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+insulin+autoantibody+affinity+as+a+predictive+marker+for+type+1+diabetes+in+young+children+with+HLA-conferred+disease+susceptibility.">Role of insulin autoantibody affinity as a predictive marker for type 1 diabetes in young children with HLA-conferred disease susceptibility.</a> Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 25 (7), 615-622 (2009).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multiplexed+autoantibody+detection+to+screen+type+1+diabetes+and+multiple+autoimmune+diseases+simultaneously.">High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously.</a> Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).</li><li>Jia, X., He, L., Gu, Y., High, H., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+electrochemiluminescence+7-plex+assay+simultaneously+screening+for+type+1+diabetes+and+multiple+autoimmune+diseases.">A high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e61160 (2020).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Interventionen for T1D er gået ind i præ-T1D-æraen, med igangværende nationale og internationale store screeningsprogrammer for T1D og blomstrende kliniske forsøg, der anvendes i fase 1 T1D for at ophæve eller bremse progressionen til klinisk T1D12,13. Målinger af fire IAbs ved hjælp af den nuværende standard RBA med et enkelt IAb-analyseformat er besværligt og ineffektivt for et massescreeningsprogram. Med den presserende efterspørgsel efter et multiplekset IAbs-assay med høj kapacitet er multiplekset ECL-assay, 3-Screen ICA ELISA og antistofdetektion ved agglutinations-PCR (ADAP) opstået som aktuelt konkurrencedygtige teknologier. I Fr1da-undersøgelsen af screening for T1D i en population af små børn i Tyskland blev 3-Screen ICA ELISA, der kombinerede 3 IAbs (GADA, IA-2A og ZnT8A) anvendt som hovedtest14. En stor begrænsning af 3-skærms ICA ELISA er manglen på IAA, som for det meste er den første IAb, der vises med en høj forekomst hos små børn med T1D. Desuden er analysen ikke i stand til at skelne mellem, hvilken af de tre IAbs der er positiv fra et positivt signal, og hver positiv prøve skal gentages med tre enkeltassays til bekræftelse. ADAP15 kombinerer GADA, IA-2A og IAA og illustrerede høj analysefølsomhed og specificitet i IASP-workshoppen, men mangler data om, hvor forudsigelig den er i populationsbaseret screening for T1D-undersøgelser, som IASP-værkstedet ikke er i stand til at bestemme. Multiplex ECL-analysen i denne undersøgelse er bygget på platformen for et enkelt ECL-assay, der er valideret mod den nuværende standard RBA i flere kliniske forsøg som TrailNet9,16, DAISY17,18,19 og ASK 4,20,21 studium. Det foreliggende assay er blevet valideret mod både RBA og enkelt ECL-assay ved hjælp af 880 serumprøver fra deltagere i ASK-undersøgelsen. Som vist i figur 2 og figur 3 var antistofniveauer mellem 6-Plex og enkelt ECL eller mellem 6-Plex og RBA for det meste kongruente med hinanden for antistoffernes positivitet. Sammenfaldsraterne for IAbs testet af RBA og 6-Plex var 91,7%-97,8%, og sammenfaldsraterne for IAbs testet med enkelt ECL og 6-Plex var 95,3%-99,2%. Uoverensstemmelse mellem ECL-analysen og RBA var hovedsageligt fra dem med enkelt IAb. Niveauerne af IAbs testet af 6-Plex og enkelt ECL (r = 0,6431-0,9434, alle p < 0,0001) og 6-Plex og RBA (r = 0,5775-0,8576, alle p < 0,0001) var også godt korreleret. TGA testet ved 6-Plex-assay var stærkt korreleret med resultaterne af både RBA (99,4%) og enkelt ECL-assay (99,4%). Derudover nåede COVID-19A testet af 6-Plex 99.8% overholdelse af resultaterne af det enkelte ECL-assay.
Som følge heraf er 6-Plex ECL-analysen formelt blevet accepteret som den primære screeningsmetode for den igangværende ASK-undersøgelse og erstattet standard RBA22. Dette assay demonstrerede dets fremragende følsomhed og specificitet med højere gennemstrømning, lavere omkostninger og mindre volumen serum sammenlignet med standard RBA.
Det er dokumenteret, at i T1D-screeningsstudiet var enkelt IAb påvist af RBA, som optog en stor del af IAb-positiviteterne, af lav affinitet, med lav sygdomsrisiko og resulterede i en samlet lav prædiktiv værdi 19,21,23,24,25,26. En sådan forudsigelse med lav risiko medførte enorme ekstraomkostninger ved opfølgende besøg og resulterede i vanskeligheder for forebyggende T1D-undersøgelser. Den etablerede ECL-analyseplatform er blevet demonstreret i flere kliniske forsøg for at diskriminere IAb'er med høj affinitet fra IAb'er med lav affinitet genereret af RBA og signifikant forbedre de forudsigelige værdier for alle fire IAb'er, især med enkelt IAb-positivitet16,17,18,21 . Multiplex ECL-analyseteknologien blev bygget på platformen for det enkelte ECL-assay med denne tydelige fordel ved påvisning af abs-abs med høj affinitet. I denne undersøgelse illustrerede 6-Plex ECL-analysen sin lighed med de tilsvarende enkelte ECL-assays i følsomhed og specificitet.
Nogle begrænsninger og de tekniske problemer ved multiplex ECL-analysen ved hjælp af flere Plex-plader er allerede blevet dækket i tidligere publikationer27,28. Med seks mærkede antigener i en brønd kan der være nogle påvirkninger mellem forskellige antigener, og analysebaggrunden kan øges, når der tilføjes hvert antistofassay til multiplexing i samme brønd. En stor mængde analyseoptimeringsarbejde er nødvendigt for at justere analysebetingelserne, især for at justere de endelige koncentrationer af hvert mærket antigenprotein baseret på skakbrætassayet for hvert antigen for at opretholde følsomheden og specificiteten for hvert antistofassay. Som nævnt i tidligere undersøgelser27,28 resulterer et lille antal prøver (<1%) i falsk positivitet på multipel Plex-pladen uden en klar underliggende årsag. Alle positive resultater bør gentages og bekræftes ved et enkelt ECL-assay som rutinemæssig kvalitetssikring af laboratorier; Normalt fjernes de falske positiver. Falsk-negative resultater forårsaget af "prozoneeffekten" observeret i det tidligere 7-Plex ECL-assay27,28 blev ikke observeret i denne undersøgelse. I analysen beskrevet her fjernede vi trinnet med syrebehandling af serumprøver fra den tidligere protokol; I stedet forvarmede vi serumprøverne ved 56 °C i 30 minutter (trin 5.1.). På den anden dag med pladevask brugte vi en vaskebuffer indeholdende 0,4 M NaCl (trin 8.1.) i stedet for almindelig vaskebuffer til at vaske pladen strengere. Disse ændringer gjorde multiplex ECL-analysen enklere og lavere baggrund uden at miste analysefølsomheden.
Afslutningsvis har dette assay fremragende ydeevne til påvisning af fire IAbs, TGA og COVID-19A samtidigt. Multiplexing-funktionen såvel som det høje gennemløb, lave omkostninger og små serumvolumenkrav gør storskala screening for T1D og samtidige sygdomme meget mere gennemførlig i den generelle befolkning. Patienter med T1D eller autoimmune sygdomme har en meget højere risiko for andre autoimmune sygdomme. Multiplex ECL-analysen giver en fremragende platform til at screene for T1D og flere autoimmune sygdomme samtidigt.

Store epidemiologiske undersøgelser over hele verden viser, at forekomsten af type 1-diabetes (T1D) har været hurtigt stigende med 3%-5% årligt, og forekomsten af T1D er fordoblet i de sidste 20 år, især hos små børn 1,2. Ø autoantistoffer (IAbs) forekommer normalt år før kliniske symptomer og er i øjeblikket de mest pålidelige prædiktive og diagnostiske biomarkører for T1D3. Screening for T1D-autoantistoffer kan identificere personer med risiko for at komme videre til klinisk T1D, uddanne offentligheden, stort set reducere den livstruende komplikation af ketoacidose og gavne kliniske forsøg med forebyggelsesterapier. Verdensomspændende forebyggelsesindsats for T1D er i gang, og flere interventionelle forsøg udføres blandt forsøgspersoner med IAbs-positive for at forsinke progressionen til klinisk T1D, og Barbara Davis Center for Diabetes lancerede det første amerikanske kliniske forsøg med screening i den generelle befolkning i 2016 for T1D og cøliaki, Autoimmunitetsscreening for børnene (ASK)4 . Cøliaki (CD) er en kronisk intestinal inflammatorisk sygdom relateret til immun- og genetiske faktorer. Forekomsten af CD hos børn med T1D kan nå op til 24,5%5. Mere end halvdelen af personer med CD kan ikke have typiske symptomer ved præsentation6, så serologisk screening for cøliaki er helt nødvendig.
Siden pandemien med coronavirussygdom 2019 (COVID-19) startede, er der rapporteret over 200 millioner tilfælde globalt, og børn tegner sig for op til 16% af laboratoriebekræftede tilfælde7. Mange undersøgelser har vist virkningen af eksisterende T1D på sværhedsgraden og dødeligheden af COVID-19-infektion8, mens virkningen af COVID-19-infektion på T1D-udvikling ikke er klar. Undersøgelsen af den samlede COVID-19-infektion i den generelle befolkning ved bestemmelse af alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-COV-2) antistoffer og undersøgelsen af sammenhængen mellem COVID-19-infektion og udløsning af T1D-autoimmunitet eller accelererende T1D-progression er presserende nødvendige og meget vigtige, mens den igangværende ASG-undersøgelse er en glimrende platform for dette. På grund af enkeltassayformatet og genereringen af en stor andel af antistofpositivitet med lav affinitet har standard radiobindingsassay (RBA) mødt en flaskehals med lav effektivitet og lav sygdomsspecificitet9. I dette papir præsenterer vi et nyt 6-Plexed elektrokemiluminescens (ECL) assay bygget på vores tidligere multiplex ECL-analyseplatform ved hjælp af en multiple-Plex-plade, der kombinerer seks autoantistofassays i en enkelt brønd, herunder alle fire store IAb'er til insulin (IAA), glutaminsyre decarboxylase-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) og zinktransport-8 (ZnT8A), autoantistoffer til transglutaminase (TGA) til cøliaki, og SARS-CoV-2 receptorbindende domæne (RBD) antistoffer (COVID-19A). Dette er det første multiplex-assay, der rekrutterede et komplet panel af fire store IAb'er og yderligere kombinerede dette med TGA og COVID-19A. Det er blevet valideret og formelt accepteret som det primære screeningsværktøj, der erstatter standard RBA i ASK-undersøgelsen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mM NaCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1070832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PI21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker A</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R93AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top 500 ml-Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974064A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAD65 protein</td>
			<td>Diamyd Medical</td>
			<td>10-65702-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IA-2 protein (aa 605-979)</td>
			<td>Creative BioMart</td>
			<td>283309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MESO QuickPlex SQ120</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R31QQ-3</td>
			<td>Electrochemiluminescence analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proinsulin protein</td>
			<td>AmideBio</td>
			<td>20160118B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer B</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0800019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 RBD protein</td>
			<td>Creative Biomart</td>
			<td>Spike-190V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0090019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-TAG</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tTG protein</td>
			<td>Diarect AG</td>
			<td>15201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Plex 6-Assay SECTOR plate</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Z00U0142E</td>
			<td>6-plex plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 1</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 10</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 2</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0020015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 3</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0030018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 8</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0080018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 9</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0090014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeBa Column</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89892</td>
			<td>Spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnT8 protein</td>
			<td>Research Laboratory</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19

Et igangværende klinisk forsøg, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), er den første screeningsundersøgelse i den generelle befolkning for type 1-diabetes (T1D) og cøliaki i USA. Med coronavirus-sygdommen 2019 (COVID-19) -pandemien er epidemiologien af COVID-19 i den generelle befolkning og viden om sammenhængen mellem COVID-19-infektion og T1D-udvikling presserende. Den nuværende standardscreeningsmetode for radiobindingsassay (RBA) har mødt to store udfordringer: lav effektivitet med et enkelt analyseformat og lav sygdomsspecificitet med en stor andel af antistoffer med lav affinitet genereret ved screening. Med platformen for multiplex elektrokemiluminescens (ECL) assay, vi etablerede tidligere, blev der udviklet et nyt 6-Plex ECL-assay, der kombinerer i en enkelt brønd alle fire ø-autoantistoffer (IAbs) til insulin, glutaminsyre decarboxylase (GAD65), insulinomantigen 2 (IA-2) og zinktransportør 8 (ZnT8) til T1D, transglutaminase autoantistoffer (TGA) til cøliaki og alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) receptorbindende domæne (RBD) antistoffer til COVID-19. Analysen blev valideret i blinde ved hjælp af 880 prøver fra ASK-undersøgelsen, herunder 325 positive prøver og 555 alle antistofnegative prøver, og sammenlignet med standard RBA'erne og et enkelt ECL-assay. Med fordelene ved høj effektivitet, lave omkostninger og lav serumvolumen er dette assay blevet accepteret som det primære screeningsværktøj til ASK-undersøgelsen.

Tabel 1, tabel 2 og tabel 3 viser de repræsentative resultater. Den rå CPS fra læsemaskinen er illustreret i tabel 1. I tabel 2 blev rå CPS arrangeret og sorteret efter de seks linkere og tilsvarende antistoffer. Tabel 3 viser de beregnede indeksværdier med CPS som beskrevet i analyseprotokollen. Alle rå tælleværdier skal kontrolleres for at undgå forkerte endelige indeksresultater forårsaget af dårlige dubletter. I tabel 1 er der givet eksempler på dårlige dubletter, hvilket resulterede i en fejl i den endelige indeksberegning i tabel 3.
Dette assay blev valideret blindt ved hjælp af 880 udvalgte prøver fra ASK-undersøgelsen med 325 IAbs-positive prøver og 555 alle Abs-negative prøver. Niveauerne af autoantistoffer fra 6-Plex ECL-assay for de 880 prøver blev sammenlignet punkt for punkt med niveauerne af tilsvarende enkelt ECL-assays (figur 2) og med tilsvarende enkelt standard RBA (figur 3). Afskæringen, følsomheden og specificiteten for hvert antistof er angivet i tabel 4. Følsomheden og specificiteten af dette ECL-COVID-19A-assay er blevet identificeret som henholdsvis 100% og 99.9%10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig01.jpg"> Figur 1: Illustration af 6-Plex ECL-analysen. Serumautoantistoffer skaber forbindelsen mellem det Ru Sulfo-NHS-mærkede antigen til det biotinylerede antigen, som er kombineret med en specifik linker og danner et kompleks af antigen-antistof-antigen-linker. Komplekserne fanges gennem hver specifik linker på de specifikke pletter i 6-Plex-pladen. For hvert antigen blev de specifikke linkernumre tildelt: GAD-linker-1, Covid-19-linker-2, IA-2-linker-3, tTG-linker-8, ZnT8-linker-9 og Proinslulin-linker-10. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig02.jpg"> Figur 2: Sammenligning af seks antistofniveauer i 880 prøver fra ASK-undersøgelsen mellem det enkelte ECL-assay og 6-Plex ECL-assayet. Panelerne viser sammenligninger af antistofniveauer for henholdsvis GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA og COVID-19A (indeks for COVID-19A blev præsenteret som (100 x beregnet indeksværdi)). De stiplede linjer repræsenterer assayafskæringerne for hvert antistofassay. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig03.jpg"> Figur 3: Sammenligning af fem antistofniveauer i 880 prøver fra ASK-undersøgelsen mellem RBA og 6-Plex ECL-analysen. Panelerne viser sammenligninger af antistofniveauer for henholdsvis GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A og TGA. De stiplede linjer repræsenterer assayafskæringerne for hvert antistofassay. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Tabel 1: Rå CPS-tal (venstre halvdel af pladen). Rå CPS-tællinger erhvervet fra venstre halvdel af en analyseplade. Hver prøve udføres i to eksemplarer. Hvert CPS-tal inden for samme kolonne (A1, A2, A3 osv.) repræsenterer læsedataene fra de 10 pletter i samme brønd (tilsvarende linkernumre er markeret). Eksempler på dårlige dubletter er fremhævet med gråt, som det ses i række D-linker 3 kolonne 5 og kolonne 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%201.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 2: Opstilling af tabel 1-data, sorteret med seks linkere. CPS-værdier fra tabel 1 blev omarrangeret, idet middelværdierne for duplikataflæsninger af CPS blev beregnet, og ubrugte værdier for linkere 4-7 blev slettet. Værdierne af den interne standard høj positiv, lav positiv og negativ kontrol af hvert autoantistofassay er markeret med mørk fed. PC, positiv kontrol. NC, negativ kontrol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%202.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 3: Resultater af indeksværdier. Indeksværdierne for hver prøve for alle seks antistoffer blev beregnet i forhold til de tilsvarende positive og negative kontroller. En indeksværdi, der var større end afskæringsværdien, blev defineret som positiv, markeret med fed skrift. De dårlige duplikerede CPS-værdier i tabel 1, række D-linker 3-kolonne 5 og 6, førte til en positiv IA-2A-indeksværdi for prøve 11 (fremhævet med gråt), hvilket sandsynligvis var et falsk-positivt resultat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table_3.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 4: Assay cutoff, følsomhed og specificitet for GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA og TGA blandt 880 ASK-prøver, herunder 325 IAbs-positive prøver og 555 alle antistoffer negative prøver. Den optimale cutoff-indeksværdi for GADA-, IA-2A-, ZnT8A-, IAA- og TGA-assay blev sat til mindst den 99. percentil af de 555 normale kontrolprøver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%204.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19 at JoVE.com

A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19

I tråd med det presserende behov for screening for type 1-diabetes, cøliaki og coronavirus sygdom 2019 udviklede vi et 6-Plex elektrokemiluminescensassay med høj gennemstrømning for samtidig at detektere alle fire ø-autoantistoffer, vævstransglutaminaseautoantistoffer og antistoffer mod receptorbindingsdomænet for alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2.

En multiplexed screening med høj kapacitet for type 1-diabetes, cøliaki og COVID-19

An ongoing clinical trial, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), is the first screening study in the general population for type 1 diabetes (T1D) and ...

Det nye 6-Plex ECL-assay er det første multiplex-assay, der er valideret og nu anvendt i kliniske forsøg til screening af den generelle population. Det kombinerer samtidig seks autoantistofassays, der er egnede til screening af type 1-diabetes, cøliaki og COVID-19 i en stor befolkning. Sammenlignet med det nuværende standard autoantistofassay kan denne teknik mere effektivt screene flere autoantistoffer for flere autoimmune sygdomme samtidigt.Implikationen af denne teknik vil gøre den store screening mere gennemførlig og sygdomsspecifik, hvilket fører til tidlig sygdomsforudsigelse til forebyggelse og mere præcis diagnose til terapi. Til at begynde med tilsættes fire mikroliter biotinyleret GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 og proinsulinantigenprotein i et rør indeholdende 156 mikroliter 1% BSA og blandes med 240 mikroliter tilsvarende streptavidinkonjugerede linkere, 1, 2, 3, 8, 9 og 10. Derefter inkuberes blandingen i 30 minutter ved stuetemperatur.Aliquot 160 mikroliter stopopløsning i hvert rør og inkubere blandingen ved stuetemperatur i 30 minutter. Tag nu 400 mikroliter af blandingsopløsningen fra hvert rør og kombiner dem sammen. Tilsæt fire mikroliter rutheniummærket GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 og proinsulinantigen til blandingen.Derefter tilsættes 1,6 ml stopopløsning og 3,2 ml PBS. Bland alle komponenterne grundigt. Og nu er antigenopløsningen klar til brug i analysen.For en 96-brønds PCR-plade aliquot syv mikroliter serum pr. Brønd og dække pladen med en tætningsfilm. Forvarm derefter seraen ved 56 grader Celsius i 30 minutter på en PCR-maskine og centrifugerer pladen kortvarigt ved 100 gange G i et minut. Tilsæt 63 mikroliter forberedt antigenopløsning pr. Brønd, bland med seraen, og dæk PCR-pladen med tætningsfolie for at undgå lys.Ryst pladen på en ryster med en hastighed på 450 o / min i to timer ved stuetemperatur. Og inkuber derefter pladen ved fire grader Celsius i 18 til 24 timer. Tag en 6-Plex plade fra fire grader Celsius køleskabet, så pladen kan komme til stuetemperatur.Tilsæt derefter 150 mikroliter 3% Blocker A til hver brønd på 6-Plex-pladen. Dæk pladen med folie for at undgå lys. Sæt pladen tilbage i et køleskab på fire grader Celsius og inkuber natten over.Ved afslutningen af inkubationen, når pladen er fjernet fra køleskabet, skal du fjerne al bufferen fra pladen. Klap tallerkenen på køkkenrullerne for at tørre ud, og vask den tre gange med 150 mikroliter vaskebuffer pr. brønd hver gang. Tør pladen på køkkenrullen, og aliquot 30 mikroliter serumantigen inkuberes fra hver brønd i den natlige inkuberende PCR-plade i to brønde på 6-Plex-pladen.Dæk pladen med folie, læg derefter pladen på en pladeryster og ryst med en hastighed på 450 o / min ved stuetemperatur i en time. Opløsningen i 6-Plex-pladen dumpes, og pladen vaskes tre gange med 150 mikroliter 0,4 M natriumchloridvaskebuffer pr. Brønd. Når den tredje vask er færdig, tørres pladen mod køkkenrullen, og der tilsættes 150 mikroliter læsebuffer i hver brønd.Niveauerne af seks autoantistoffer til GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA og COVID-19A fra 6-Plex ECL-analysen var godt korreleret med deres tilsvarende seks enkelt ECL-assay og det nuværende standard radiobindingsassay. Indeksværdierne for hver prøve for alle seks antistoffer blev beregnet i forhold til de tilsvarende positive og negative kontroller. Der blev observeret en indeksværdi større end afskæringsværdien, hvilket indikerede et positivt resultat.Autoantistoffer i serum brød det rutheniummærkede antigen til det biotinylerede antigen og dannede et kompleks med en specifik linker for at opbygge en multiplexingplatform. Denne taktik gør den store screening mere gennemførlig og mere effektiv i den generelle befolkning for type et-diabetes og samtidige sygdomme, hvilket fører til tidlig forudsigelse og forebyggelse af sygdommene.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Accelerated Type 1 Diabetes Induktion i mus ved adoptiv overførsel af diabetogene CD4 + T-celler

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fænotypisk analyse til kvantificering af intracellulære mycobakterier tilpasset til screening med højt gennemløb/højt indhold

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput Screening for Bredspektret Chemical hæmmere af RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Etablering af en High-throughput Opsætning til screening små molekyler, der modulerer c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

En Fluorescens-baserede lymfocyt Assay Egnet til high-throughput screening af små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Celle-fri biokemiske fluorometriske enzymatisk Assay for høj overførselshastighed måling af Lipid fedtstoffer i High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

En høj overførselshastighed Cre-Lox aktiveret Viral membran Fusion analyse for at identificere hæmmere af HIV-1 Viral membran Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høj overførselshastighed Platform for Screening af Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høj overførselshastighed Shigella-specifikke bakteriedræbende Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

En avanceret murine model for alkoholfri steatohepatitis i forbindelse med type 2 diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...