Name: a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19
Uploaded: 2022-07-05T13:00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19 at JoVE.com

De studie werd ondersteund door JDRF-subsidie 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, NIH-subsidie DK32083 en Diabetes Research Center (DRC) subsidie P30 DK116073.

Het onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door de Colorado Multiple Institutional Review Board.
1. Buffervoorbereiding
<ol><li>Bereid de etiketteringsbuffer voor (2x PBS, pH 7,9): Voeg 100 ml 10x PBS toe aan 400 ml gedestilleerd water en pas de pH met NaOH aan op 7,9.</li>
	<li>Maak 3 mM biotine en Ru Sulfo-NHS: Los 1 mg biotine op in 588 μL etiketteringsbuffer en los 150 nmol Ru Sulfo-NHS op in 50 μL etiketteringsbuffer.</li>
	<li>Bereid de antigeenbuffer (1% BSA): Los 5 g runderserumalbumine (BSA) op in 500 ml 1x PBS.</li>
	<li>Bereid de coatingbuffer (3% Blocker A): Los 15 g Blocker A op in 500 ml 1x PBS.</li>
	<li>Bereid de eerste wasbuffer voor (0,05 % Tween 20, PBST): Meng 2,5 ml Tween 20 in 5.000 ml 1x PBS.</li>
	<li>Bereid de tweede wasbuffer (0,4 M NaCl): Meng 50 ml 5 M NaCl in 575 ml gedestilleerd water om de 0,4 M NaCl-oplossing te maken. OPMERKING: Gebruik voor een efficiënte etikettering altijd vers bereide biotine en Ru Sulfo-NHS-oplossingen en niet opgeslagen oplossingen die eerder zijn gemaakt.</li>
</ol>2. Antigeen eiwitetikettering met biotine en Ru Sulfo-NHS afzonderlijk
OPMERKING: Een hogere concentratie antigeeneiwit ≥0,5 mg / ml wordt aanbevolen voor een hogere etiketteringsefficiëntie.
<ol><li>Bereid zes gerichte antigeeneiwitoplossingen, waaronder proinsuline, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG en receptorbindingsdomein (RBD) van het spike-eiwit van SARS-CoV-2. Bereken de mol van elk antigeeneiwit op basis van het molecuulgewicht en maak de juiste molaire verhoudingen van biotine of Ru Sulfo-NHS. De verhouding van antigeen tot de som van biotine of Ru Sulfo-NHS zal 1:5 zijn voor kleine moleculaire antigenen (molecuulgewicht ≤10 kd), zoals proinsuline-eiwit. Voor middelgrote moleculaire antigenen (molecuulgewicht 10-50 kd), zoals ZnT8, zal de verhouding zich aanpassen aan 1:10. Voor antigenen met een groot molecuulgewicht (molecuulgewicht >50 kd), zoals GAD, is de molaire verhouding 1:20.</li>
	<li>Verdeel het antigeeneiwit in twee gelijke delen en meng het afzonderlijk met biotine en Ru Sulfo-NHS met behulp van de berekende molaire verhouding in stap 2.1. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur (RT) gedurende 1,5 uur en vermijd licht. OPMERKING: Alle reducerende chemicaliën zoals de Tris of glycine in de buffer van antigeeneiwit moeten worden verwijderd door een maatspinkolom geprimed met een buffer van 2x PBS (pH 7,9).</li>
	<li>Prime de spinkolommen met 2x PBS (de grootte van de spinkolom, 2 ml of 5 ml, hangt af van het volume van het etiketteerantigeeneiwit): voeg 1 ml 2x PBS-buffer toe aan de spinkolom, centrifugeer het op 1.000 x g gedurende 2 minuten en herhaal de stap 2x meer.</li>
	<li>Laat het antigeen eiwit-biotine of -Ru Sulfo-NHS mengsel 1x door de geprimeerde spinkolom gaan (centrifugeer de kolom op 1.000 x g gedurende 2 min) om te zuiveren en de etiketteringsreactie te stoppen.</li>
	<li>Meet het uiteindelijke volume van het gelabelde antigeeneiwit dat uit de spinkolommen is geëlueerd en bereken de concentraties van biotine- of Ru Sulfo-NHS-gelabeld antigeeneiwit. Maak kleinere aliquots van gelabeld antigeeneiwit (50 μL/tube) en bewaar ze bij −80 °C voor langdurig gebruik. OPMERKING: De dekking van eiwitten na elke spinkolom is een retentiepercentage van ongeveer 90% -95%.</li>
</ol>3. Definieer de beste concentratie en verhoudingen voor biotine- en Ru Sulfo-NHS-gelabelde antigenen voor de 6-Plex ECL-test (dambordtest)
OPMERKING: De dambordtest voor elk antigeen is noodzakelijk voordat de multiplextest wordt geïntegreerd.
<ol><li>Pas de dambordtest voor elk antigeen afzonderlijk toe. OPMERKING: Stappen 3.2.-3.7. zal TGA als een kort voorbeeld gebruiken. Het TGA-dambordtestproces is om het testproces te simuleren, maar met slechts één soort antigeen.</li>
	<li>Maak de seriële verdunning van de gebiotinyleerde tTG en Ru Sulfo-NHS-gelabelde tTG. De aanbevolen werkconcentraties van de eerste mengseloplossing beginnen bij 240 ng /ml voor zowel gebiotinyleerd als Ru Sulfo-NHS-gelabeld tTG. Stel dat de concentraties van zowel de oorspronkelijke gebiotinyleerde als de Ru Sulfo-NHS-gelabelde tTG 1,0 μg/μL zijn. Maak een 10x verdunning van de originele Ru Sulfo-NHS-gelabelde tTG en een 5x verdunning van de oorspronkelijke gebiotinyleerde tTG met 5% BSA.</li>
	<li>Meng 4 μL gebiotinyleerd tTG-eiwit met 156 μL 5% BSA (antigeenbuffer) en 240 μL van de geconjugeerde linker in één buis en incubeer de oplossing bij RT gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 160 μL stopoplossing toe en incubeer nog eens 30 minuten bij RT. Neem 400 μL van het mengsel en meng met 2 ml stopoplossing. De concentratie van de gebiotinyleerde tTG in het mengsel is 240 ng/ml.</li>
	<li>Om een seriële verdunning te maken voor biotine-gelabeld ZnT8-antigeen, bereidt u nog eens vijf nieuwe buizen voor, neemt u 1 ml van een aliquot uit het mengsel in stap 3.3. en meng met 1 ml stopoplossing in een nieuwe buis en krijg het mengsel met een concentratie van 120 ng / ml. Herhaal deze stap, maak seriële 1:1 verdunningen en krijg de biotine-gelabelde tTG op 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml en 7,5 ng / ml.</li>
	<li>Voeg 4 μL Ru Sulfo-NHS-gelabeld tTG toe met 1,6 ml stopoplossing en krijg een mengsel van Ru Sulfo-NHS-gelabeld tTG in een concentratie van 240 ng / ml. Maak met dezelfde stappen van 3.4. seriële 1:1 verdunningen en krijg het Ru Sulfo-NHS-gelabelde ZnT8-antigeen op 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml, 7,5 ng / ml en 3,75 ng / ml. De laatste concentratie is 0 ng/ml, met alleen stopoplossing en geen Ru Sulfo-NHS-gelabeld antigeen.</li>
	<li>Bereid tTG positieve controle en negatieve controle serummonsters (vooraf gekwalificeerd en gestandaardiseerd door een enkele ECL tTG-test) en een 96-well PCR-plaat. Voeg de positieve en negatieve controleserummonsters toe aan respectievelijk de linkerhelft en de rechterhelft van de plaat, met 7 μL in elk putje. Voeg 1x PBS toe aan de plaat, met 33 μL per putje.</li>
	<li>Voeg op de linkerhelft van de PCR-plaat 24 μL van de serieel verdunde biotine-gelabelde tTG-linkeroplossing toe aan elke put, één kolom met één concentratie in volgorde van hoog tot laag. Voeg op dezelfde manier 16 μL van het serieel verdunde Ru Sulfo-NHS-gelabelde tTG-antigeen toe aan elke put, één rij met één concentratie en meng vervolgens grondig. Herhaal de stap op de rechterhelft van de PCR-plaat.</li>
	<li>Ga verder met de rest van de teststappen die worden beschreven in stap 5.3.-9.1. totdat de ruwe telgegevens zijn verkregen.</li>
	<li>Bereken de verhoudingen van positieve besturingssignalen tot overeenkomstige negatieve besturingssignalen. Bepaal de beste concentratie voor het biotine-gelabelde antigeen en het Ru Sulfo-NHS-gelabelde antigeen met hogere ratiowaarden en lagere achtergrond voor het negatieve controlemonster. De optimale werkconcentraties van biotine en Ru Sulfo-NHS gelabeld antigeeneiwit worden hieronder weergegeven: 16,0 ng / ml en 8,0 ng / ml voor GAD65, 18,8 ng / ml en 9,4 ng / ml voor SARS-CoV-2 RBD, 42,0 ng / ml en 42,0 ng / ml voor IA-2, 60,0 ng / ml en 60,0 ng / ml voor tTG, 4,2 ng / ml en 4,2 ng / ml voor ZnT8, en 31,3 ng/ml en 31,3 ng/ml voor pro-insuline.</li>
</ol>4. Maak linker-gekoppelde antigeenoplossing
<ol><li>Verdun de biotine- en Ru Sulfo-NHS-gelabelde antigenen met 5% BSA tot de optimale werkconcentraties volgens stap 3.9.</li>
	<li>Bind vooraf geselecteerde linkers aan elk gebiotinyleerd antigeeneiwit. Voeg voor een 96-wells plaattest 4 μL gebiotinyleerd GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 en proinsuline antigeeneiwit toe aan een afzonderlijke buis met 156 μL van 1% BSA en meng met 240 μL overeenkomstige streptavidin-geconjugeerde linkers 1, 2, 3, 8, 9 en 10 (figuur 1). Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij RT.</li>
	<li>Aliquot 160 μL stopoplossing in elke buis en incubeer het mengsel bij RT gedurende 30 minuten. Haal 400 μL van de mengseloplossing uit elke buis en combineer ze samen.</li>
	<li>Voeg 4 μL Ru Sulfo-NHS met het label GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 en proinsuline-antigeen toe aan het bovenstaande mengsel en voeg vervolgens 1,6 ml stopoplossing en 3,2 ml 1x PBS toe en meng. Nu is de antigeenoplossing klaar voor gebruik in de test.</li>
</ol>5. Incubeer serummonsters met het gelabelde antigeen
<ol><li>Aliquot 7 μL serum per putje voor een 96-well PCR plaat en afdek met afdichtingsfolie. Verwarm de sera gedurende 30 minuten voor op 56 °C op een PCR-machine. Centrifugeer de plaat kort op 100 x g gedurende 1 min.</li>
	<li>Voeg 63 μL antigeenoplossing (bereid in stap 4.4) per putje toe en meng met de sera. Bedek de PCR-plaat met afdichtingsfolie om licht te voorkomen.</li>
	<li>Schud de plaat op een shaker bij 450 rpm bij RT gedurende 2 uur en incubeer de plaat vervolgens bij 4 °C gedurende 18-24 uur.</li>
</ol>6. Bereid de 6-Plex plaat voor
<ol><li>Neem een 6-Plex plaat uit de 4 °C koelkast, zodat de plaat naar RT kan komen. Voeg 150 μL 3% Blocker A toe aan elk putje van de 6-Plex plaat.</li>
	<li>Zet de plaat terug in de koelkast van 4 °C, bedek de plaat met folie die licht vermijdt en incubeer een nacht. OPMERKING: Teststappen in dag 1 omvatten secties 4.-6.</li>
</ol>7. Breng serum/antigeen over in de 6-Plex plaat
<ol><li>Neem de volgende dag de broedende 6-Plex plaat uit de koelkast en gooi alle buffer uit de plaat. Dep het bord op keukenpapier om uit te drogen.</li>
	<li>Was de 6-Plex plaat 3x met telkens 150 μL wasbuffer per putje. Droog de plaat op keukenpapier en aliquot serum / antigeen incubeert uit elke put van de nachtelijke broedende PCR-plaat in twee putjes van de 6-Plex-plaat (30 μL per putje voor duplicaten).</li>
	<li>Bedek de plaat met folie, leg de plaat vervolgens op een platenschudder en schud met een snelheid van 450 tpm bij RT gedurende 1 uur.</li>
</ol>8. Was de 6-Plex plaat en voeg leesbuffer toe
<ol><li>Dump de oplossing in de 6-Plex plaat en was de plaat 3x met 150 μL van 0,4 M NaCl wasbuffer per putje per keer.</li>
	<li>Nadat de derde wasbeurt is voltooid, droogt u de plaat tegen het keukenpapier en voegt u 150 μL leesbuffer toe aan elk putje. OPMERKING: Luchtbellen in de put beïnvloeden de nauwkeurigheid van de plaatlezermachine en moeten ten koste van alles worden vermeden.</li>
</ol>9. Lees de plaat en analyseer de gegevens
<ol><li>Tel de plaat op een elektrochemiluminescentieanalysator. De leesresultaten worden gepresenteerd met de waarden in tellingen per seconde (CPS). Bereken de relatieve antilichaamindex van elk monster met behulp van de ruwe CPS verkregen uit de leesmachine tegen de CPS van de interne standaard positieve en negatieve controles van elk specifiek antilichaam (Indexwaarde = [CPS (monster) - CPS (negatieve standaard)] / [CPS (positieve standaard) - CPS (negatieve standaard)]).</li>
	<li>Bepaal negatieve of positieve antilichaamresultaten met behulp van de cutoff-waarden die zijn vastgesteld op de 99,5tot 99,8e percentielen van 555 negatieve controlemonsters uit de ASK-studie (alle antilichamen negatieve monsters zonder een voorgeschiedenis of familiegeschiedenis van diabetes of een ander type auto-immuunziekte). OPMERKING: Teststappen in dag 2 omvatten secties 7-9.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Group, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Environmental+Determinants+of+Diabetes+in+the+Young+(TEDDY)+Study.">The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY) Study.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1150, 1-13 (2008).</li><li>Vehik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+incidence+of+type+1+diabetes+in+0-+to+17-year-old+Colorado+youth.">Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth.</a> Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).</li><li>Insel, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+presymptomatic+type+1+diabetes:+a+scientific+statement+of+JDRF,+the+Endocrine+Society,+and+the+American+Diabetes+Association.">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li><li>Stahl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+screening+for+celiac+disease:+The+autoimmunity+screening+for+kids+study.">Mass screening for celiac disease: The autoimmunity screening for kids study.</a> The American Journal of Gastroenterology. 116 (1), 180-187 (2021).</li><li>Al-Hussaini, A., Sulaiman, N., Al-Zahrani, M., Alenizi, A., El Haj, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+celiac+disease+among+Saudi+children+with+type+1+diabetes:+A+prospective+cross-sectional+study.">High prevalence of celiac disease among Saudi children with type 1 diabetes: A prospective cross-sectional study.</a> BMC Gastroenterology. 12, 180 (2012).</li><li>Agardh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+features+of+celiac+disease:+A+prospective+birth+cohort.">Clinical features of celiac disease: A prospective birth cohort.</a> Pediatrics. 135 (4), 627-634 (2015).</li><li>COVID-19: Clinical manifestations and diagnosis in children. UpToDate Available from: <a target="_blank" href="https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print">https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print</a> (2021)</li><li>Barron, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+type+1+and+type+2+diabetes+with+COVID-19-related+mortality+in+England:+a+whole-population+study.">Associations of type 1 and type 2 diabetes with COVID-19-related mortality in England: a whole-population study.</a> The Lancet Diabetes &amp; Endocrinology. 8 (10), 813-822 (2020).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemiluminescence+assays+for+insulin+and+glutamic+acid+decarboxylase+autoantibodies+improve+prediction+of+type+1+diabetes+risk.">Electrochemiluminescence assays for insulin and glutamic acid decarboxylase autoantibodies improve prediction of type 1 diabetes risk.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).</li><li>Jia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+SARS-CoV-2+antibodies+in+children+and+adults+with+Type+1+diabetes.">Prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in children and adults with Type 1 diabetes.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 23 (7), 517-521 (2021).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multiplex+electrochemiluminescence+assay+applicable+to+general+population+screening+for+type+1+diabetes+and+celiac+disease.">High-throughput multiplex electrochemiluminescence assay applicable to general population screening for type 1 diabetes and celiac disease.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. , (2022).</li><li>McQueen, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+and+cost-effectiveness+of+large-scale+screening+for+type+1+diabetes+in+Colorado.">Cost and cost-effectiveness of large-scale screening for type 1 diabetes in Colorado.</a> Diabetes Care. 43 (7), 1496-1503 (2020).</li><li>Insel, R. A., Dunne, J. L., Ziegler, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+population+screening+for+type+1+diabetes:+has+its+time+come.">General population screening for type 1 diabetes: has its time come.</a> Current Opinion in Endocrinology &amp; Diabetes and Obesity. 22 (4), 270-276 (2015).</li><li>Ziegler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+Screen+ELISA+for+high-throughput+detection+of+beta+cell+autoantibodies+in+capillary+blood.">3 Screen ELISA for high-throughput detection of beta cell autoantibodies in capillary blood.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).</li><li>Cortez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+multiple+islet+autoantibodies+in+type+1+diabetes+using+small+sample+volumes+by+agglutination-PCR.">Sensitive detection of multiple islet autoantibodies in type 1 diabetes using small sample volumes by agglutination-PCR.</a> PLoS One. 15 (11), 0242049 (2020).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL-IAA+and+ECL-GADA+can+identify+high-risk+single+autoantibody-positive+relatives+in+the+TrialNet+pathway+to+prevention+study.">ECL-IAA and ECL-GADA can identify high-risk single autoantibody-positive relatives in the TrialNet pathway to prevention study.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinsulin/Insulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity.">Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes.">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk:+Nonradioactive+bivalent+proinsulin/insulin+autoantibody+assay.">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: Nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+sensitivity+and+earlier+identification+of+celiac+disease+autoimmunity+by+a+nonradioactive+assay+for+transglutaminase+autoantibodies.">Higher sensitivity and earlier identification of celiac disease autoimmunity by a nonradioactive assay for transglutaminase autoantibodies.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 2904563 (2016).</li><li>Jia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+ZnT8+autoantibodies+by+electrochemiluminescence+assay+improve+risk+prediction+for+type+1+diabetes.">High-affinity ZnT8 autoantibodies by electrochemiluminescence assay improve risk prediction for type 1 diabetes.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (12), 3455-3463 (2021).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete-panel+islet+autoantibody+multiplex+ECL+assay.">A complete-panel islet autoantibody multiplex ECL assay.</a> Diabetes. 70, 158 (2021).</li><li>Achenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+high-affinity+immune+responses+to+(pro)insulin+anticipate+the+autoimmune+cascade+that+leads+to+type+1+diabetes.">Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (4), 589-597 (2004).</li><li>Schlosser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+insulin-autoantibody-positive+children+from+the+general+population,+antibody+affinity+identifies+those+at+high+and+low+risk.">In insulin-autoantibody-positive children from the general population, antibody affinity identifies those at high and low risk.</a> Diabetologia. 48 (9), 1830-1832 (2005).</li><li>Mayr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD+autoantibody+affinity+and+epitope+specificity+identify+distinct+immunization+profiles+in+children+at+risk+for+type+1+diabetes.">GAD autoantibody affinity and epitope specificity identify distinct immunization profiles in children at risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 56 (6), 1527-1533 (2007).</li><li>Siljander, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+insulin+autoantibody+affinity+as+a+predictive+marker+for+type+1+diabetes+in+young+children+with+HLA-conferred+disease+susceptibility.">Role of insulin autoantibody affinity as a predictive marker for type 1 diabetes in young children with HLA-conferred disease susceptibility.</a> Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 25 (7), 615-622 (2009).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multiplexed+autoantibody+detection+to+screen+type+1+diabetes+and+multiple+autoimmune+diseases+simultaneously.">High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously.</a> Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).</li><li>Jia, X., He, L., Gu, Y., High, H., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+electrochemiluminescence+7-plex+assay+simultaneously+screening+for+type+1+diabetes+and+multiple+autoimmune+diseases.">A high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e61160 (2020).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De interventie voor T1D is het pre-T1D-tijdperk ingegaan, met lopende nationale en internationale grootschalige screeningsprogramma's voor T1D en bloeiende klinische onderzoeken die worden toegepast in stadium 1 T1D om de progressie naar klinische T1D12,13 in te trekken of te vertragen. Metingen van vier IAbs met behulp van de huidige standaard RBA met een enkel IAb-testformaat zijn bewerkelijk en inefficiënt voor een massascreeningprogramma. Met de dringende vraag naar een high-throughput multiplexed IAbs-assay, zijn multiplexed ECL-assay, 3-Screen ICA ELISA en antilichaamdetectie door agglutinatie-PCR (ADAP) naar voren gekomen als momenteel concurrerende technologieën. In de Fr1da-studie van screening op T1D in een populatie van jonge kinderen in Duitsland, werd 3-Screen ICA ELISA gecombineerd met 3 IAbs (GADA, IA-2A en ZnT8A) gebruikt als de belangrijkste test14. Een belangrijke beperking van 3-Screen ICA ELISA is het ontbreken van IAZ, dat meestal de eerste IAb is die verschijnt met een hoge prevalentie bij jonge kinderen met T1D. Bovendien is de test niet in staat om te onderscheiden welke van de drie IAbs positief is van een positief signaal, en elk positief monster moet worden herhaald met drie enkele assays voor bevestiging. ADAP15 combineert GADA, IA-2A en IAA en illustreerde een hoge testgevoeligheid en specificiteit in de IASP-workshop, maar mist gegevens over hoe voorspellend het is in populatiegebaseerde screening voor T1D-studies, die de IASP-workshop niet kan bepalen. De multiplex ECL-test in de huidige studie is gebouwd op het platform van een enkele ECL-test die is gevalideerd tegen de huidige standaard RBA in meerdere klinische onderzoeken zoals TrailNet 9,16, DAISY 17,18,19 en de ASK 4,20,21 studeren. De huidige test is gevalideerd tegen zowel RBA als enkele ECL-test met behulp van 880 serummonsters van deelnemers aan de ASK-studie. Zoals te zien is in figuur 2 en figuur 3, waren de antilichaamniveaus tussen 6-Plex en single ECL of tussen 6-Plex en RBA meestal congruent met elkaar voor de positiviteit van antilichamen. De toevalspercentages van IAbs getest door RBA en 6-Plex waren 91,7% -97,8%, en de toevalspercentages van IAbs getest door enkele ECL en 6-Plex waren 95,3% -99,2%. De discrepantie tussen de ECL-test en RBA was voornamelijk afkomstig van mensen met een enkele IAb. De niveaus van IAbs getest door 6-Plex en single ECL (r = 0,6431-0,9434, alle p < 0,0001) en 6-Plex en RBA (r = 0,5775-0,8576, alle p < 0,0001) waren ook goed gecorreleerd. TGA getest door 6-Plex-assay waren sterk gecorreleerd met de resultaten van zowel de RBA (99,4%) als de enkele ECL-test (99,4%). Bovendien bereikte COVID-19A getest door 6-Plex 99,8% naleving van de resultaten van de enkele ECL-test.
Als gevolg hiervan is de 6-Plex ECL-test formeel geaccepteerd als de primaire screeningsmethode voor de lopende ASK-studie en heeft de standaard RBA22 vervangen. Deze test toonde zijn uitstekende gevoeligheid en specificiteit aan met een hogere doorvoer, lagere kosten en een kleiner volume serum in vergelijking met standaard RBA.
Het is gedocumenteerd dat, in de T1D-screeningsstudie, enkele IAb gedetecteerd door RBA, die een groot deel van de IAb-positiviteiten in beslag nam, van lage affiniteit was, met een laag ziekterisico, en resulteerde in een algehele lage voorspellende waarde 19,21,23,24,25,26. Een dergelijke voorspelling met een laag risico veroorzaakte enorme extra kosten van vervolgbezoeken en resulteerde in problemen voor T1D-preventieve studies. Het gevestigde ECL-testplatform is in meerdere klinische onderzoeken aangetoond om IAbs met hoge affiniteit te onderscheiden van IAbs met lage affiniteit gegenereerd door RBA en de voorspellende waarden voor alle vier IAbs aanzienlijk te verbeteren, vooral met enkele IAb-positiviteit 16,17,18,21 . De multiplex ECL-testtechnologie is gebouwd op het platform van de enkele ECL-test, met dit duidelijke voordeel van de detectie van abs met hoge affiniteit. In de huidige studie illustreerde de 6-Plex ECL-test de gelijkenis met de overeenkomstige enkele ECL-assays in gevoeligheid en specificiteit.
Enkele beperkingen en de technische zorgen van de multiplex ECL-test met behulp van meerdere Plex-platen zijn al behandeld in eerdere publicaties27,28. Met zes gelabelde antigenen in één put, kunnen er enkele invloeden zijn tussen verschillende antigenen, en de testachtergrond kan toenemen bij het toevoegen van elke antilichaamtest voor multiplexing in dezelfde put. Een grote hoeveelheid assay-optimalisatiewerk is nodig om de testomstandigheden aan te passen, vooral voor het aanpassen van de uiteindelijke concentraties van elk gelabeld antigeeneiwit op basis van de dambordtest voor elk antigeen, om de gevoeligheid en specificiteit voor elke antilichaamtest te behouden. Zoals vermeld in eerdere studies 27,28, resulteert een klein aantal monsters (<1%) in valse positiviteit op de meervoudige Plex-plaat zonder een duidelijke onderliggende reden. Alle positieve resultaten moeten worden herhaald en bevestigd door één ECL-test als routinematige kwaliteitsborging in het laboratorium; meestal worden de valse positieven verwijderd. Vals-negatieve resultaten veroorzaakt door het "prozone-effect" waargenomen in de vorige 7-Plex ECL-test 27,28 werden niet waargenomen in de huidige studie. In de hier beschreven test hebben we de stap van de zuurbehandeling van serummonsters uit het vorige protocol verwijderd; in plaats daarvan hebben we de serummonsters gedurende 30 minuten voorverwarmd op 56 °C (stap 5.1.). Op de tweede dag van het wassen van de plaat gebruikten we een wasbuffer met 0,4 M NaCl (stap 8.1.) in plaats van een gewone wasbuffer om de plaat strenger te wassen. Deze wijzigingen maakten de multiplex ECL-test eenvoudiger en verlaagden de achtergrond zonder de gevoeligheid van de test te verliezen.
Kortom, deze test heeft uitstekende prestaties voor het gelijktijdig detecteren van vier IAbs, TGA en COVID-19A. De multiplexing-functie, evenals de hoge doorvoer, lage kosten en kleine serumvolumevereisten, maken grootschalige screening op T1D en bijkomende ziekten veel haalbaarder in de algemene bevolking. Patiënten met T1D of auto-immuunziekten hebben een veel hoger risico op andere auto-immuunziekten. De multiplex ECL-test biedt een uitstekend platform om tegelijkertijd te screenen op T1D en meerdere auto-immuunziekten.

Grote epidemiologische studies wereldwijd tonen aan dat de incidentie van type 1 diabetes (T1D) jaarlijks snel is toegenomen met 3% -5% en de prevalentie van T1D is de afgelopen 20 jaar verdubbeld, vooral bij jonge kinderen 1,2. Eilandjesautoantilichamen (IAbs) verschijnen meestal jaren voor klinische symptomen en zijn momenteel de meest betrouwbare voorspellende en diagnostische biomarkers voor T1D3. Screening op T1D-autoantilichamen kan mensen identificeren die risico lopen om door te stromen naar klinische T1D, het publiek informeren, de levensbedreigende complicatie van ketoacidose grotendeels verminderen en klinische onderzoeken voor preventietherapieën ten goede komen. Wereldwijde preventie-inspanningen voor T1D zijn aan de gang en er worden meerdere interventionele onderzoeken uitgevoerd onder proefpersonen met IAbs positief om de progressie naar klinische T1D te vertragen, en het Barbara Davis Center for Diabetes lanceerde de eerste Amerikaanse klinische studie van screening in de algemene bevolking in 2016 voor T1D en coeliakie, Autoimmunity Screening for the Kids (ASK)4 . Coeliakie (CD) is een chronische intestinale ontstekingsziekte gerelateerd aan immuun- en genetische factoren. De prevalentie van CD bij kinderen met T1D kan oplopen tot 24,5%5. Meer dan de helft van de personen met CD heeft mogelijk geen typische symptomen bij presentatie6, dus serologische screening op coeliakie is vrij noodzakelijk.
Sinds de pandemie van coronavirusziekte 2019 (COVID-19) begon, zijn er wereldwijd meer dan 200 miljoen gevallen gemeld en zijn kinderen goed voor maximaal 16% van de laboratorium bevestigde gevallen7. Veel studies hebben de impact van bestaande T1D op de ernst en mortaliteit van COVID-19-infectie8 aangetoond, terwijl de impact van COVID-19-infectie op de ontwikkeling van T1D niet duidelijk is. Het onderzoek naar de totale snelheid van COVID-19-infectie in de algemene bevolking door de bepaling van ernstige acute respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-COV-2) antilichamen en de studie van de associatie tussen COVID-19-infectie en het activeren van T1D-auto-immuniteit of het versnellen van T1D-progressie zijn dringend nodig en zeer belangrijk, terwijl de lopende ASK-studie hiervoor een uitstekend platform is. Vanwege het enkelvoudige testformaat en de generatie van een groot deel van de antilichaampositie van lage affiniteit, heeft de standaard radiobindingstest (RBA) een knelpunt van lage efficiëntie en lage ziektespecificiteitontmoet 9. In dit artikel presenteren we een nieuwe 6-Plexed elektrochemiluminescentie (ECL) assay gebouwd op ons vorige multiplex ECL assay platform met behulp van een multiple-Plex plaat, waarbij zes autoantilichaam assays in één put worden gecombineerd, waaronder alle vier de grote IAbs voor insuline (IAA), glutaminezuur decarboxylase-65 (GADA), insulinoma antigeen-2 (IA-2A) en Zink transport-8 (ZnT8A), autoantilichamen voor transglutaminase (TGA) voor coeliakie, en SARS-CoV-2 receptor-binding domain (RBD) antilichamen (COVID-19A). Dit is de eerste multiplex-test die een compleet panel van vier grote IAbs rekruteerde en dit verder combineerde met TGA en COVID-19A. Het is gevalideerd en formeel geaccepteerd als de primaire screeningtool ter vervanging van de standaard RBA in de ASK-studie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mM NaCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1070832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PI21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker A</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R93AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top 500 ml-Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974064A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAD65 protein</td>
			<td>Diamyd Medical</td>
			<td>10-65702-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IA-2 protein (aa 605-979)</td>
			<td>Creative BioMart</td>
			<td>283309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MESO QuickPlex SQ120</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R31QQ-3</td>
			<td>Electrochemiluminescence analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proinsulin protein</td>
			<td>AmideBio</td>
			<td>20160118B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer B</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0800019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 RBD protein</td>
			<td>Creative Biomart</td>
			<td>Spike-190V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0090019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-TAG</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tTG protein</td>
			<td>Diarect AG</td>
			<td>15201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Plex 6-Assay SECTOR plate</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Z00U0142E</td>
			<td>6-plex plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 1</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 10</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 2</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0020015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 3</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0030018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 8</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0080018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 9</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0090014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeBa Column</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89892</td>
			<td>Spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnT8 protein</td>
			<td>Research Laboratory</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19

Een lopende klinische studie, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), is de eerste screeningstudie in de algemene bevolking voor type 1 diabetes (T1D) en coeliakie in de Verenigde Staten. Met de pandemie van de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) zijn de epidemiologie van COVID-19 in de algemene bevolking en kennis over het verband tussen COVID-19-infectie en T1D-ontwikkeling dringend nodig. De momenteel standaard screeningsmethode van de radiobindingstest (RBA) heeft twee grote uitdagingen ontmoet: lage efficiëntie met een enkel testformaat en lage ziektespecificiteit met een groot aandeel antilichamen met lage affiniteit gegenereerd in screening. Met het platform van de multiplex elektrochemiluminescentie (ECL) assay die we eerder hebben opgezet, werd een nieuwe 6-Plex ECL-test ontwikkeld die in één put alle vier de eilandjesautoantilichamen (IAbs) combineert met insuline, glutaminezuurdecarboxylase (GAD65), insulinoomantigeen 2 (IA-2) en zinktransporter 8 (ZnT8) voor T1D, transglutaminase autoantilichamen (TGA) voor coeliakie en ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) receptorbindende domein (RBD) antilichamen voor coeliakie COVID-19. De test werd blind gevalideerd met behulp van 880 monsters uit de ASK-studie, waaronder 325 positieve monsters en 555 alle antilichaamnegatieve monsters, en vergeleken met de standaard RBA's en een enkele ECL-test. Met de voordelen van hoge efficiëntie, lage kosten en een laag serumvolume, is deze test geaccepteerd als de primaire screeningtool voor de ASK-studie.

Tabel 1, tabel 2 en tabel 3 illustreren de representatieve resultaten. De ruwe CPS verkregen uit de leesmachine zijn geïllustreerd in tabel 1. In tabel 2 werden ruwe CPS gerangschikt en gesorteerd op de zes linkers en bijbehorende antilichamen. Tabel 3 toont de berekende indexwaarden met CPS zoals beschreven in het testprotocol. Alle onbewerkte telwaarden moeten worden gecontroleerd om verkeerde eindindexresultaten te voorkomen die worden veroorzaakt door slechte duplicaten. In tabel 1 worden voorbeelden gegeven van slechte duplicaten, wat resulteerde in een fout voor de uiteindelijke indexberekening in tabel 3.
Deze test werd op een blinde manier gevalideerd met behulp van 880 geselecteerde monsters uit de ASK-studie met 325 IAbs-positieve monsters en 555 alle Abs-negatieve monsters. De niveaus van auto-antilichamen uit 6-Plex ECL-assay voor de 880 monsters werden punt voor punt vergeleken met de niveaus van overeenkomstige enkelvoudige ECL-assays (figuur 2) en met de overeenkomstige single standard RBA (figuur 3). De cutoff, gevoeligheid en specificiteit voor elk antilichaam zijn vermeld in tabel 4. De sensitiviteit en specificiteit van deze ECL-COVID-19A-test zijn geïdentificeerd als respectievelijk 100% en 99,9%,10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig01.jpg"> Figuur 1: Illustratie van de 6-Plex ECL-test. Serumautoantilichamen maken de verbinding van het Ru Sulfo-NHS-gelabelde antigeen met het gebiotinyleerde antigeen, dat is gekoppeld aan een specifieke linker en een complex van antigeen-antilichaam-antigeen-antigeen-linker vormt. De complexen worden via elke specifieke linker vastgelegd op de specifieke plekken in de 6-Plex plaat. Voor elk antigeen werden de specifieke linkernummers toegekend: GAD-linker-1, Covid-19-linker-2, IA-2-linker-3, tTG-linker-8, ZnT8-linker-9 en Proinslulin-linker-10. Dit cijfer is aangepast met toestemming van He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig02.jpg"> Figuur 2: Vergelijking van zes antilichaamniveaus in 880 monsters uit de ASK-studie tussen de enkele ECL-test en de 6-Plex ECL-test. De panelen tonen vergelijkingen van antilichaamniveaus voor respectievelijk GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA en COVID-19A (index van COVID-19A werd gepresenteerd als (100 x berekende indexwaarde)). De stippellijnen vertegenwoordigen de assay cutoffs voor elke antilichaamtest. Dit cijfer is aangepast met toestemming van He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig03.jpg"> Figuur 3: Vergelijking van vijf antilichaamniveaus in 880 monsters uit de ASK-studie tussen de RBA- en de 6-Plex ECL-test. De panelen tonen vergelijkingen van antilichaamniveaus voor respectievelijk GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A en TGA. De stippellijnen vertegenwoordigen de assay cutoffs voor elke antilichaamtest. Dit cijfer is aangepast met toestemming van He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Ruwe CPS-tellingen (linkerhelft van de plaat). Ruwe CPS-tellingen verkregen uit de linkerhelft van een testplaat. Elk monster wordt in tweevoud uitgevoerd. Elke CPS-telling binnen dezelfde kolom (A1, A2, A3, enz.) vertegenwoordigt de leesgegevens van de 10 vlekken in dezelfde put (overeenkomstige linkernummers zijn gemarkeerd). Voorbeelden van slechte duplicaten worden grijs gemarkeerd, zoals te zien is in rij D-linker 3 kolom 5 en kolom 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%201.zip" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 2: Rangschikking van de tabel 1-gegevens, gesorteerd met zes linkers. CPS-waarden uit tabel 1 werden herschikt, waarbij de gemiddelde waarden voor dubbele metingen van CPS werden berekend en ongebruikte waarden voor linkers 4-7 werden verwijderd. De waarden van de interne standaard hoge positieve, lage positieve en negatieve controles van elke autoantilichaamtest zijn gemarkeerd in donker vetgedrukt. PC, positieve controle. NC, negatieve controle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%202.zip" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 3: Resultaten van indexwaarden. De indexwaarden voor elk monster voor alle zes antilichamen werden berekend op basis van de overeenkomstige positieve en negatieve controles. Een indexwaarde groter dan de cutoff-waarde werd gedefinieerd als positief, gemarkeerd in donker vetgedrukt. De slechte dubbele CPS-waarden in tabel 1, rij D-linker 3-kolommen 5 en 6, leidden tot een positieve IA-2A-indexwaarde van monster 11 (grijs gemarkeerd), wat waarschijnlijk een vals-positief resultaat was. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table_3.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 4: Testafsnijding, gevoeligheid en specificiteit voor GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA en TGA onder 880 ASK-monsters, waaronder 325 IAbs-positieve monsters en 555 alle antilichamen negatieve monsters. De optimale cutoff index waarde van GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA en TGA assay was ingesteld op ten minste het 99e percentiel van de 555 normale controlemonsters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%204.zip" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19 at JoVE.com

A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19

In lijn met de dringende behoefte aan screening op type 1 diabetes, coeliakie en coronavirusziekte 2019, hebben we een high throughput 6-Plex elektrochemiluminescentietest ontwikkeld om tegelijkertijd alle vier de eilandjesautoantilichamen, weefseltransglutaminase autoantilichamen en antilichamen tegen het receptorbindingsdomein van ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 te detecteren.

Een high-throughput multiplexed screening voor type 1 diabetes, coeliakie en COVID-19

An ongoing clinical trial, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), is the first screening study in the general population for type 1 diabetes (T1D) and ...

De nieuwe 6-Plex ECL-test is de eerste multiplextest die is gevalideerd en nu wordt toegepast in klinische onderzoeken voor algemene bevolkingsonderzoek. Het combineert tegelijkertijd zes autoantilichaamtests die geschikt zijn voor het screenen van type 1 diabetes, coeliakie en COVID-19 in een grote populatie. Vergeleken met de huidige standaard autoantilichaamtest kan deze techniek efficiënter meerdere auto-antilichamen tegelijkertijd screenen op meerdere auto-immuunziekten.De implicatie van deze techniek zal de grootschalige screening haalbaarder en ziektespecifikeler maken, wat leidt tot vroege ziektevoorspelling voor preventie en een nauwkeurigere diagnose voor therapie. Voeg om te beginnen vier microliter gebiotinyleerd GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 en proinsuline-antigeeneiwit toe aan een buis met 156 microliter van 1% BSA en meng met 240 microliter overeenkomstige streptavidin-geconjugeerde linkers, 1, 2, 3, 8, 9 en 10. Incubeer het mengsel vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Aliquot 160 microliter stopoplossing in elke buis en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Neem nu 400 microliter van de mengseloplossing uit elke buis en combineer ze samen. Voeg vier microliter ruthenium-gelabeld GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 en proinsuline antigeen toe aan het mengsel.Voeg vervolgens 1,6 milliliter stopoplossing en 3,2 milliliter PBS toe. Meng alle componenten grondig. En nu is de antigeenoplossing klaar voor gebruik in de test.Voor een 96-well PCR plaat, aliquot zeven microliter serum per put en bedek de plaat met een afdichtingsfilm. Verwarm vervolgens de sera gedurende 30 minuten voor op 56 graden Celsius op een PCR-machine en centrifugeer de plaat gedurende één minuut kort op 100 maal G. Voeg 63 microliter bereide antigeenoplossing per put toe, meng met de sera en bedek de PCR-plaat met afdichtingsfolie om licht te voorkomen.Schud de plaat op een shaker met een snelheid van 450 tpm gedurende twee uur bij kamertemperatuur. En incubeer vervolgens de plaat op vier graden Celsius gedurende 18 tot 24 uur. Neem een 6-Plex plaat uit de vier graden Celsius koelkast, zodat de plaat op kamertemperatuur komt.Voeg vervolgens 150 microliter van 3% Blocker A toe aan elk putje van de 6-Plex-plaat. Bedek de plaat met folie om licht te voorkomen. Zet het bord terug in een koelkast van vier graden Celsius en incubeer een nacht.Aan het einde van de incubatie, zodra de plaat uit de koelkast is verwijderd, verwijdert u alle buffer van de plaat. Dep het bord op de papieren handdoekjes om uit te drogen en was het driemaal met telkens 150 microliter wasbuffer per putje. Droog de plaat op het keukenpapier en aliquot 30 microliter serumantigeen incubeer uit elk putje van de nachtelijke broedende PCR-plaat in twee putjes van de 6-Plex-plaat.Bedek de plaat met folie, leg de plaat vervolgens op een platenschudder en schud met een snelheid van 450 tpm bij kamertemperatuur gedurende een uur. Dump de aanwezige oplossing in de 6-Plex plaat en was de plaat drie keer met 150 microliter van 0,4 M natriumchloride wasbuffer per putje. Nadat de derde wasbeurt is voltooid, droogt u de plaat tegen het keukenpapier en voegt u 150 microliter leesbuffer toe aan elk putje.De niveaus van zes autoantilichamen voor GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA en COVID-19A uit de 6-Plex ECL-test waren goed gecorreleerd met hun overeenkomstige zes enkele ECL-assay en de huidige standaard radiobindingstest. De indexwaarden voor elk monster voor alle zes antilichamen werden berekend op basis van de overeenkomstige positieve en negatieve controles. Er werd een indexwaarde waargenomen die groter was dan de cutoff-waarde, wat een positief resultaat aangaf.Autoantilichamen in serum doorbraken het ruthenium-gelabelde antigeen naar het gebiotinyleerde antigeen en vormden een complex met een specifieke linker om een multiplexingplatform te bouwen. Deze tactiek maakt de grootschalige screening haalbaarder en efficiënter in de algemene bevolking op diabetes type één en bijkomende ziekten, wat leidt tot vroege voorspelling en preventie van de ziekten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Versnelde Type 1 diabetes inductie in muizen door adoptieve overdracht van diabetogenische CD4 + T cellen

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Oprichting van een High-throughput Setup voor het screenen van kleine moleculen die Moduleer c-di-GMP Signalering in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Cel-vrije biochemische fluorimetrische enzymatische Assay voor High-throughput meting van lipide peroxidatie in High Density lipoproteïne

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Een High-throughput Shigella-specifieke bactericide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Een geavanceerd muizen model voor niet-alcoholische Steatohepatitis in samenwerking met type 2 diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...