Name: a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19
Uploaded: 2022-07-05T13:00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19 at JoVE.com

अध्ययन को जेडीआरएफ अनुदान 2-एसआरए-2019-695-एस-बी, 2-एसआरए-2020-965-एस-बी, 1-एसआरए-2017-564-M_N, एनआईएच अनुदान डीके 32083 और मधुमेह अनुसंधान केंद्र (डीआरसी) अनुदान पी 30 डीके 116073 द्वारा समर्थित किया गया था।

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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

टी 1 डी के लिए हस्तक्षेप पूर्व-टी 1 डी युग में प्रवेश कर गया है, टी 1 डी के लिए चल रहे राष्ट्रीय और अंतर्राष्ट्रीय बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग कार्यक्रम और नैदानिक टी 1 डी 12,13 की प्रगति को निरस्त करने या धीमा करने के लिए चरण 1 टी 1 डी में तेजी से नैदानिकपरीक्षणों को लागू किया जा रहा है। एकल आईएबी परख प्रारूप के साथ वर्तमान मानक आरबीए का उपयोग करके चार आईएबी का माप बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग कार्यक्रम के लिए श्रमसाध्य और अक्षम है। उच्च-थ्रूपुट मल्टीप्लेक्स आईएबीएस परख की तत्काल मांग के साथ, मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख, 3-स्क्रीन आईसीए एलिसा, और एग्लूटीनेशन-पीसीआर (एडीएपी) द्वारा एंटीबॉडी का पता लगाना वर्तमान में प्रतिस्पर्धी प्रौद्योगिकियों के रूप में उभरा है। जर्मनी में छोटे बच्चों की आबादी में टी 1 डी के लिए स्क्रीनिंग के Fr1da अध्ययन में, 3-स्क्रीन आईसीए एलिसा संयोजन 3 IAB (GADA, IA-2A, और ZnT8A) को मुख्य परीक्षण14 के रूप में उपयोग किया गया था। 3-स्क्रीन आईसीए एलिसा की एक बड़ी सीमा आईएए की कमी है, जो ज्यादातर टी 1 डी वाले छोटे बच्चों में उच्च प्रसार के साथ दिखाई देने वाला पहला आईएबी है। इसके अलावा, परख यह भेद करने में सक्षम नहीं है कि तीन आईएबीएस में से कौन सा सकारात्मक संकेत से सकारात्मक है, और प्रत्येक सकारात्मक नमूने को पुष्टि के लिए तीन एकल परखों के साथ दोहराया जाना चाहिए। एडीएपी15 जीएडीए, आईए -2 ए और आईएए को जोड़ता है और आईएएसपी कार्यशाला में उच्च परख संवेदनशीलता और विशिष्टता का चित्रण करता है, लेकिन टी 1 डी अध्ययनों के लिए जनसंख्या-आधारित स्क्रीनिंग में यह कितना पूर्वानुमानित है, जिसके बारे में डेटा का अभाव है, जिसे आईएएसपी कार्यशाला निर्धारित करने में सक्षम नहीं है। वर्तमान अध्ययन में मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख एक एकल ईसीएल परख के मंच पर बनाई गई है जिसे ट्रेलनेट 9,16, डेज़ी 17,18,19 और एएसके 4,20,21 जैसे कई नैदानिक परीक्षणों में वर्तमान मानक आरबीए के खिलाफ मान्य किया गया है। पढ। एएसके अध्ययन के प्रतिभागियों से 880 सीरम नमूनों का उपयोग करके आरबीए और एकल ईसीएल परख दोनों के खिलाफ वर्तमान परख को मान्य किया गया है। जैसा कि चित्रा 2 और चित्रा 3 में दिखाया गया है, 6-प्लेक्स और एकल ईसीएल के बीच या 6-प्लेक्स और आरबीए के बीच एंटीबॉडी का स्तर ज्यादातर एंटीबॉडी की सकारात्मकता के लिए एक दूसरे के साथ संगत था। आरबीए और 6-प्लेक्स द्वारा परीक्षण किए गए आईएबीएस की संयोग दर 91.7% -97.8% थी, और एकल ईसीएल और 6-प्लेक्स द्वारा परीक्षण किए गए आईएबीएस की संयोग दर 95.3% -99.2% थी। ईसीएल परख और आरबीए के बीच मतभेद मुख्य रूप से एकल आईएबी वाले लोगों से था। 6-प्लेक्स और एकल ईसीएल (आर = 0.6431-0.9434, सभी पी < 0.0001) और 6-प्लेक्स और आरबीए (आर = 0.5775-0.8576, सभी पी < 0.0001) द्वारा परीक्षण किए गए आईएबीएस के स्तर भी अच्छी तरह से सहसंबद्ध थे। 6-प्लेक्स परख द्वारा परीक्षण किए गए टीजीए आरबीए (99.4%) और एकल ईसीएल परख (99.4%) दोनों के परिणामों के साथ अत्यधिक सहसंबद्ध थे। इसके अतिरिक्त, 6-प्लेक्स द्वारा परीक्षण किए गए सीओवीआईडी -19 ए एकल ईसीएल परख के परिणामों के साथ 99.8% अनुपालन तक पहुंच गया।
नतीजतन, 6-प्लेक्स ईसीएल परख को औपचारिक रूप से चल रहे एएसके अध्ययन के लिए प्राथमिक स्क्रीनिंग विधि के रूप में स्वीकार किया गया है और मानक आरबीए22 को बदल दिया गया है। इस परख ने मानक आरबीए की तुलना में उच्च थ्रूपुट, कम लागत और सीरम की छोटी मात्रा के साथ अपनी उत्कृष्ट संवेदनशीलता और विशिष्टता का प्रदर्शन किया।
यह प्रलेखित किया गया है कि, टी 1 डी स्क्रीनिंग अध्ययन में, आरबीए द्वारा पता लगाए गए एकल आईएबी, जिसने आईएबी सकारात्मकता का एक बड़ा हिस्सा लिया, कम आत्मीयता के थे, कम बीमारी के जोखिम के साथ, और इसके परिणामस्वरूप समग्र कम पूर्वानुमान मूल्य 19,21,23,24,25,26 था। इस तरह के कम जोखिम की भविष्यवाणी ने अनुवर्ती यात्राओं की भारी अतिरिक्त लागत पैदा की और इसके परिणामस्वरूप टी 1 डी निवारक अध्ययनों के लिए कठिनाइयां हुईं। स्थापित ईसीएल परख मंच को कई नैदानिक परीक्षणों में आरबीए द्वारा उत्पन्न कम-आत्मीयता वाले आईएबी से उच्च-आत्मीयता आईएबी को अलग करने और सभी चार आईएबी के लिए पूर्वानुमानमूल्यों को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ाने के लिए प्रदर्शित किया गया है, विशेष रूप से एकल आईएबी सकारात्मकता 16,17,18,21 के साथ। . मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख तकनीक एकल ईसीएल परख के मंच पर बनाई गई थी, जिसमें उच्च-आत्मीयता एबीएस का पता लगाने का यह विशिष्ट लाभ था। वर्तमान अध्ययन में, 6-प्लेक्स ईसीएल परख ने संवेदनशीलता और विशिष्टता में संबंधित एकल ईसीएल परख के साथ अपनी समानता का चित्रण किया।
कई प्लेक्स प्लेटों का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख की कुछ सीमाओं और तकनीकी चिंताओं को पहले से ही पिछले प्रकाशनों27,28 में कवर किया गया है। एक कुएं में छह लेबल एंटीजन के साथ, विभिन्न एंटीजन के बीच कुछ प्रभाव हो सकते हैं, और एक ही कुएं में मल्टीप्लेक्सिंग के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी परख जोड़ते समय परख पृष्ठभूमि बढ़ सकती है। परख स्थितियों को समायोजित करने के लिए बड़ी मात्रा में परख अनुकूलन कार्य की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से प्रत्येक एंटीजन के लिए चेकरबोर्ड परख के आधार पर प्रत्येक लेबल एंटीजन प्रोटीन की अंतिम सांद्रता को समायोजित करने के लिए, प्रत्येक एंटीबॉडी परख के लिए संवेदनशीलता और विशिष्टता बनाए रखने के लिए। जैसा कि पिछलेअध्ययनों 27,28 में उल्लेख किया गया है, नमूनों की एक छोटी संख्या (<1%) के परिणामस्वरूप स्पष्ट अंतर्निहित कारण के बिना कई प्लेक्स प्लेट पर झूठी सकारात्मकता होती है। सभी सकारात्मक परिणामों को नियमित प्रयोगशाला गुणवत्ता आश्वासन के रूप में एकल ईसीएल परख द्वारा दोहराया और पुष्टि की जानी चाहिए; आमतौर पर, झूठी सकारात्मकता को हटा दिया जाएगा। पिछले 7-प्लेक्स ईसीएल परख27,28 में देखे गए "प्रोज़ोन प्रभाव" के कारण गलत-नकारात्मक परिणाम वर्तमान अध्ययन में नहीं देखे गए थे। यहां वर्णित परख में, हमने पिछले प्रोटोकॉल से सीरम नमूनों के एसिड उपचार के चरण को हटा दिया; इसके बजाय, हमने सीरम नमूनों को 30 मिनट (चरण 5.1.) के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट किया। प्लेट धोने के दूसरे दिन, हमने प्लेट को अधिक सख्ती से धोने के लिए नियमित वॉशिंग बफर के बजाय 0.4 एम एनएसीएल (चरण 8.1.) युक्त वॉशिंग बफर का उपयोग किया। इन संशोधनों ने परख संवेदनशीलता को खोए बिना मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख को सरल और कम पृष्ठभूमि बना दिया।
अंत में, इस परख में एक साथ चार आईएबी, टीजीए और सीओवीआईडी -19 ए का पता लगाने के लिए उत्कृष्ट प्रदर्शन है। मल्टीप्लेक्सिंग फीचर, साथ ही उच्च थ्रूपुट, कम लागत और छोटे सीरम वॉल्यूम की आवश्यकता, टी 1 डी और सहवर्ती बीमारियों के लिए बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग को सामान्य आबादी में बहुत अधिक संभव बनाती है। टी 1 डी या किसी भी ऑटोइम्यून बीमारियों वाले रोगियों में अन्य ऑटोइम्यून बीमारियों के लिए बहुत अधिक जोखिम होता है। मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख टी 1 डी और कई ऑटोइम्यून बीमारियों के लिए एक साथ स्क्रीन करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करता है।

दुनिया भर में बड़े महामारी विज्ञान के अध्ययनों से पता चलता है कि टाइप 1 मधुमेह (टी 1 डी) की घटनाएं तेजी से 3% -5% सालाना बढ़ रही हैं, और टी 1 डी का प्रसार पिछले 20 वर्षों में दोगुना हो गया है, खासकर छोटे बच्चों में 1,2। आइलेट ऑटोएंटीबॉडीज (आईएबीएस) आमतौर पर नैदानिक लक्षणों से वर्षों पहले दिखाई देते हैं और वर्तमान में टी 1 डी3 के लिए सबसे विश्वसनीय पूर्वानुमान और नैदानिक बायोमार्कर हैं। टी 1 डी ऑटोएंटीबॉडी के लिए स्क्रीनिंग नैदानिक टी 1 डी में प्रगति के लिए जोखिम वाले लोगों की पहचान कर सकती है, जनता को शिक्षित कर सकती है, बड़े पैमाने पर कीटोएसिडोसिस की जीवन-धमकी देने वाली जटिलता को कम कर सकती है, और रोकथाम उपचारों के लिए नैदानिक परीक्षणों का लाभ उठा सकती है। टी 1 डी के लिए दुनिया भर में रोकथाम के प्रयास चल रहे हैं और नैदानिक टी 1 डी की प्रगति में देरी के लिए आईएबीएस पॉजिटिव वाले विषयों के बीच कई पारंपरिक परीक्षण किए जा रहे हैं, और बारबरा डेविस सेंटर फॉर डायबिटीज ने टी 1 डी और सीलिएक रोग के लिए 2016 में सामान्य आबादी में स्क्रीनिंग का पहला अमेरिकी नैदानिक परीक्षण शुरू किया, ऑटोइम्यूनिटी स्क्रीनिंग फॉर द किड्स (एएसके)4 . सीलिएक रोग (सीडी) प्रतिरक्षा और आनुवंशिक कारकों से संबंधित एक पुरानी आंतों की सूजन की बीमारी है। टी 1 डी वाले बच्चों में सीडी की व्यापकता 24.5% तक पहुंच सकती है। सीडी वाले आधे से अधिक व्यक्तियों में प्रस्तुति6 में विशिष्ट लक्षण नहीं हो सकते हैं, इसलिए सीलिएक रोग के लिए सीरोलॉजिकल स्क्रीनिंग काफी आवश्यक है।
कोरोनावायरस रोग 2019 (सीओवीआईडी -19) की महामारी शुरू होने के बाद से, वैश्विक स्तर पर 200 मिलियन से अधिक मामले सामने आए हैं, और प्रयोगशाला-पुष्टिकिए गए मामलों में से 16% तक बच्चे हैं। कई अध्ययनों ने कोविड-19 संक्रमण की गंभीरता और मृत्यु दर पर मौजूदा टी1डी के प्रभाव को प्रदर्शितकिया है, जबकि टी1डी विकास पर कोविड-19 संक्रमण का प्रभाव स्पष्ट नहीं है। गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) एंटीबॉडी के निर्धारण द्वारा सामान्य आबादी में कोविड-19 संक्रमण की कुल दर की जांच और कोविड-19 संक्रमण और टी 1 डी ऑटोइम्यूनिटी को ट्रिगर करने या टी 1 डी प्रगति में तेजी लाने के बीच संबंध का अध्ययन तत्काल आवश्यक और बहुत महत्वपूर्ण है, जबकि चल रहा एएसके अध्ययन इसके लिए एक उत्कृष्ट मंच है। एकल परख प्रारूप और कम-आत्मीयता एंटीबॉडी सकारात्मकता के एक बड़े अनुपात की पीढ़ी के कारण, मानक रेडियो-बाइंडिंग परख (आरबीए) ने कम दक्षता और कम रोग विशिष्टता 9 की अड़चन को पूराकिया है। वर्तमान पेपर में, हम एक मल्टीपल-प्लेक्स प्लेट का उपयोग करके हमारे पिछले मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख प्लेटफॉर्म पर निर्मित एक नया 6-प्लेक्स इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस (ईसीएल) परख प्रस्तुत करते हैं, जिसमें एक ही कुएं में छह ऑटोएंटीबॉडी परख शामिल हैं, जिसमें इंसुलिन (आईएए), ग्लूटामिक एसिड डीकार्बोक्सिलेज -65 (जीएडीए), इंसुलिनोमा एंटीजन -2 (आईए -2 ए), और जिंक ट्रांसपोर्ट -8 (जेडएनटी 8 ए), ट्रांसग्लूटामिनेज के लिए ऑटोएंटीबॉडी शामिल हैं। और सार्स-सीओवी-2 रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी) एंटीबॉडी (कोविड-19ए)। यह पहला मल्टीप्लेक्स परख है जिसने चार प्रमुख आईए के एक पूर्ण पैनल की भर्ती की और इसे टीजीए और सीओवीआईडी -19 ए के साथ जोड़ा। इसे एएसके अध्ययन में मानक आरबीए की जगह प्राथमिक स्क्रीनिंग टूल के रूप में मान्य और औपचारिक रूप से स्वीकार किया गया है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mM NaCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1070832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PI21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker A</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R93AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top 500 ml-Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974064A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAD65 protein</td>
			<td>Diamyd Medical</td>
			<td>10-65702-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IA-2 protein (aa 605-979)</td>
			<td>Creative BioMart</td>
			<td>283309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MESO QuickPlex SQ120</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R31QQ-3</td>
			<td>Electrochemiluminescence analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proinsulin protein</td>
			<td>AmideBio</td>
			<td>20160118B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer B</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0800019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 RBD protein</td>
			<td>Creative Biomart</td>
			<td>Spike-190V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0090019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-TAG</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tTG protein</td>
			<td>Diarect AG</td>
			<td>15201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Plex 6-Assay SECTOR plate</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Z00U0142E</td>
			<td>6-plex plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 1</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 10</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 2</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0020015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 3</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0030018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 8</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0080018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 9</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0090014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeBa Column</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89892</td>
			<td>Spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnT8 protein</td>
			<td>Research Laboratory</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19

एक चल रहे नैदानिक परीक्षण, ऑटोइम्यूनिटी स्क्रीनिंग फॉर किड्स (एएसके), संयुक्त राज्य अमेरिका में टाइप 1 मधुमेह (टी 1 डी) और सीलिएक रोग के लिए सामान्य आबादी में पहला स्क्रीनिंग अध्ययन है। कोरोनावायरस रोग 2019 (सीओवीआईडी -19) महामारी के साथ, आम आबादी में सीओवीआईडी -19 की महामारी विज्ञान और सीओवीआईडी -19 संक्रमण और टी 1 डी विकास के बीच संबंध के बारे में ज्ञान की तत्काल आवश्यकता है। रेडियो-बाइंडिंग परख (आरबीए) की वर्तमान मानक स्क्रीनिंग विधि ने दो बड़ी चुनौतियों का सामना किया है: एकल परख प्रारूप के साथ कम दक्षता और स्क्रीनिंग में उत्पन्न कम-आत्मीयता एंटीबॉडी के एक बड़े अनुपात के साथ कम रोग विशिष्टता। मल्टीप्लेक्स इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस (ईसीएल) परख के मंच के साथ, एक नया 6-प्लेक्स ईसीएल परख विकसित किया गया था, जो एक ही कुएं में, सभी चार आइलेट ऑटोएंटीबॉडीज (आईएबीएस) को इंसुलिन, ग्लूटामिक एसिड डिकार्बोक्सिलेज (जीएडी 65), इंसुलिनोमा एंटीजन 2 (आईए -2), और जिंक ट्रांसपोर्टर 8 (जेडएनटी 8) को जोड़ता है। covid-19। एएसके अध्ययन से 880 नमूनों का उपयोग करके अंधे में परख को मान्य किया गया था, जिसमें 325 सकारात्मक नमूने और 555 सभी एंटीबॉडी-नकारात्मक नमूने शामिल थे, और मानक आरबीए और एक एकल ईसीएल परख के साथ तुलना की गई थी। उच्च दक्षता, कम लागत और कम सीरम मात्रा के फायदे के साथ, इस परख को एएसके अध्ययन के लिए प्राथमिक स्क्रीनिंग टूल के रूप में स्वीकार किया गया है।

तालिका 1, तालिका 2, और तालिका 3 प्रतिनिधि परिणामों को स्पष्ट करते हैं। रीडिंग मशीन से प्राप्त कच्चे सीपीएस को तालिका 1 में चित्रित किया गया है। तालिका 2 में, कच्चे सीपीएस को छह लिंकर और संबंधित एंटीबॉडी द्वारा व्यवस्थित और क्रमबद्ध किया गया था। तालिका 3 परख प्रोटोकॉल में वर्णित सीपीएस के साथ गणना किए गए सूचकांक मूल्यों को दर्शाती है। खराब डुप्लिकेट के कारण गलत अंतिम सूचकांक परिणामों से बचने के लिए सभी कच्चे गिनती मूल्यों की जांच की जानी चाहिए। तालिका 1 में, खराब डुप्लिकेट के उदाहरण दिए गए हैं, जिसके परिणामस्वरूप तालिका 3 में अंतिम सूचकांक गणना के लिए त्रुटि हुई।
इस परख को एएसके अध्ययन से 880 चयनित नमूनों का उपयोग करके अंधे तरीके से मान्य किया गया था, जिसमें 325 आईएबीएस सकारात्मक नमूने और 555 सभी एबीएस नकारात्मक नमूने थे। 880 नमूनों के लिए 6-प्लेक्स ईसीएल परख से ऑटोएंटीबॉडी के स्तर की तुलना संबंधित एकल ईसीएल परख (चित्रा 2) और संबंधित एकल मानक आरबीए (चित्रा 3) के स्तर के साथ बिंदु-दर-बिंदु की गई थी। प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए कटऑफ, संवेदनशीलता और विशिष्टता तालिका 4 में सूचीबद्ध हैं। इस ईसीएल-कोविड-19ए परख की संवेदनशीलता और विशिष्टता की पहचान क्रमशः 100% और 99.9%के रूप में की गई है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig01.jpg"> चित्रा 1: 6-प्लेक्स ईसीएल परख का चित्रण। सीरम ऑटोएंटीबॉडीज आरयू सल्फो-एनएचएस-लेबल एंटीजन का बायोटिनिलेटेड एंटीजन से कनेक्शन बनाते हैं, जो एक विशिष्ट लिंकर के साथ युग्मित होता है और एंटीजन-एंटीबॉडी-एंटीजन-लिंकर का एक परिसर बनाता है। परिसरों को 6-प्लेक्स प्लेट में विशिष्ट स्थानों पर प्रत्येक विशिष्ट लिंकर के माध्यम से कैप्चर किया जाता है। प्रत्येक एंटीजन के लिए, विशिष्ट लिंकर नंबर सौंपे गए थे: जीएडी-लिंकर -1, कोविद -19-लिंकर -2, आईए -2-लिंकर -3, टीटीजी-लिंकर -8, जेडएनटी 8-लिंकर -9, और प्रोइंसुल्लिन-लिंकर -10। इस आंकड़े को He et al.11 की अनुमति से संशोधित किया गया है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig02.jpg"> चित्रा 2: एकल ईसीएल परख और 6-प्लेक्स ईसीएल परख के बीच एएसके अध्ययन से 880 नमूनों में छह एंटीबॉडी स्तरों की तुलना। पैनल क्रमशः जीएडीए, आईएए, आईए -2 ए, जेडएनटी 8 ए, टीजीए और सीओवीआईडी -19 ए के एंटीबॉडी स्तरों की तुलना प्रदर्शित करते हैं (सीओवीआईडी -19 ए का सूचकांक (100 x गणना सूचकांक मूल्य) के रूप में प्रस्तुत किया गया था)। डॉटेड लाइनें प्रत्येक एंटीबॉडी परख के लिए परख कटऑफ का प्रतिनिधित्व करती हैं। इस आंकड़े को He et al.11 की अनुमति से संशोधित किया गया है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig03.jpg"> चित्रा 3: आरबीए और 6-प्लेक्स ईसीएल परख के बीच एएसके अध्ययन से 880 नमूनों में पांच एंटीबॉडी स्तरों की तुलना। पैनल क्रमशः जीएडीए, आईएए, आईए -2 ए, जेडएनटी 8 ए और टीजीए के लिए एंटीबॉडी स्तरों की तुलना प्रदर्शित करते हैं। डॉटेड लाइनें प्रत्येक एंटीबॉडी परख के लिए परख कटऑफ का प्रतिनिधित्व करती हैं। इस आंकड़े को He et al.11 की अनुमति से संशोधित किया गया है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
तालिका 1: कच्चे सीपीएस गिनती (प्लेट का बायां आधा हिस्सा)। कच्चे सीपीएस की गणना एक परख प्लेट के बाएं आधे हिस्से से प्राप्त होती है। प्रत्येक नमूना डुप्लिकेट में किया जाता है। एक ही कॉलम (ए 1, ए 2, ए 3, आदि) के भीतर प्रत्येक सीपीएस गिनती एक ही कुएं में 10 स्थानों से पढ़ने वाले डेटा का प्रतिनिधित्व करती है (संबंधित लिंकर संख्याओं को चिह्नित किया जाता है)। खराब डुप्लिकेट के उदाहरण ग्रे में हाइलाइट किए गए हैं, जैसा कि पंक्ति डी-लिंकर 3 कॉलम 5 और कॉलम 6 में देखा गया है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%201.zip" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
तालिका 2: तालिका 1 डेटा की व्यवस्था, छह लिंकर के साथ क्रमबद्ध। तालिका 1 से सीपीएस मानों को फिर से व्यवस्थित किया गया था, सीपीएस के डुप्लिकेट रीडिंग के लिए औसत मूल्यों की गणना की गई थी और लिंकर 4-7 के लिए अप्रयुक्त मानों को हटा दिया गया था। प्रत्येक ऑटोएंटीबॉडी परख के आंतरिक मानक उच्च सकारात्मक, कम सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के मूल्यों को गहरे बोल्ड में चिह्नित किया गया है। पीसी, सकारात्मक नियंत्रण। एनसी, नकारात्मक नियंत्रण। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%202.zip" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
तालिका 3: अनुक्रमणिका मानों के परिणाम. सभी छह एंटीबॉडी के लिए प्रत्येक नमूने के लिए सूचकांक मूल्यों की गणना संबंधित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों के खिलाफ की गई थी। कटऑफ मान से अधिक सूचकांक मूल्य को सकारात्मक के रूप में परिभाषित किया गया था, जिसे डार्क बोल्ड में चिह्नित किया गया था। तालिका 1, पंक्ति डी-लिंकर 3-कॉलम 5 और 6 में खराब डुप्लिकेट सीपीएस मानों ने नमूना 11 (ग्रे में हाइलाइट किया गया) के सकारात्मक आईए -2 ए सूचकांक मूल्य को जन्म दिया, जो शायद एक गलत-सकारात्मक परिणाम था। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table_3.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
तालिका 4: 880 एएसके नमूनों के बीच जीएडीए, आईए -2 ए, जेडएनटी 8 ए, आईएए और टीजीए के लिए परख कटऑफ, संवेदनशीलता और विशिष्टता, जिसमें 325 आईएबी सकारात्मक नमूने और 555 सभी एंटीबॉडी नकारात्मक नमूने शामिल हैं। जीएडीए, आईए -2 ए, जेडएनटी 8 ए, आईएए और टीजीए परख का इष्टतम कटऑफ इंडेक्स मूल्य 555 सामान्य नियंत्रण नमूनों के कम से कम 99 वें प्रतिशत पर सेट किया गया था। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%204.zip" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19 at JoVE.com

A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19

टाइप 1 मधुमेह, सीलिएक रोग और कोरोनावायरस रोग 2019 के लिए स्क्रीनिंग की तत्काल आवश्यकता के अनुरूप, हमने एक उच्च थ्रूपुट 6-प्लेक्स इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस परख विकसित की है, जो एक साथ सभी चार आइलेट ऑटोएंटीबॉडी, ऊतक ट्रांसग्लूटामिनेज ऑटोएंटीबॉडीज और गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 के रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन के एंटीबॉडी का पता लगाती है।

टाइप 1 मधुमेह, सीलिएक रोगों और सीओवीआईडी -19 के लिए एक उच्च-थ्रूपुट मल्टीप्लेक्स स्क्रीनिंग

An ongoing clinical trial, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), is the first screening study in the general population for type 1 diabetes (T1D) and ...

नोवेल 6-प्लेक्स ईसीएल परख पहला मल्टीप्लेक्स परख है जिसे मान्य किया गया है और अब सामान्य जनसंख्या स्क्रीनिंग के लिए नैदानिक परीक्षण में लागू किया गया है। इसमें एक साथ एक बड़ी आबादी में टाइप 1 मधुमेह, सीलिएक रोग और सीओवीआईडी -19 की जांच के लिए उपयुक्त छह ऑटोएंटीबॉडी परख शामिल हैं। वर्तमान मानक ऑटोएंटीबॉडी परख की तुलना में, यह तकनीक एक साथ कई ऑटोइम्यून बीमारी के लिए कई ऑटोएंटीबॉडी को अधिक कुशलता से स्क्रीन कर सकती है।इस तकनीक का निहितार्थ बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग को अधिक व्यवहार्य और रोग-विशिष्ट बना देगा, जिससे रोकथाम के लिए प्रारंभिक रोग की भविष्यवाणी और चिकित्सा के लिए अधिक सटीक निदान होगा। शुरू करने के लिए, बायोटिनिलेटेड जीएडी 65, सार्स-सीओवी-2 आरबीडी, आईए -2, टीटीजी, जेडएनटी 8, और प्रोइन्सुलिन एंटीजन प्रोटीन के चार माइक्रोलीटर को एक ट्यूब में जोड़ें जिसमें 1% बीएसए के 156 माइक्रोलीटर होते हैं और संबंधित स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित लिंकर, 1, 2, 3, 8, 9 और 10 के 240 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं। फिर, मिश्रण को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।प्रत्येक ट्यूब में स्टॉप सॉल्यूशन के 160 माइक्रोलीटर एलिकोट करें और मिश्रण को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। अब, प्रत्येक ट्यूब से मिश्रण समाधान के 400 माइक्रोलीटर लें और उन्हें एक साथ मिलाएं। मिश्रण में रूथेनियम लेबल वाले जीएडी 65, सार्स-सीओवी-2 आरबीडी, आईए-2, टीटीजी, जेडएनटी 8 और प्रोइन्सुलिन एंटीजन के चार माइक्रोलीटर जोड़ें।फिर, 1.6 मिलीलीटर स्टॉप समाधान और 3.2 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें। सभी घटकों को अच्छी तरह से मिलाएं। और अब, एंटीजन समाधान परख में उपयोग के लिए तैयार है।96-वेल पीसीआर प्लेट के लिए, प्रति कुएं सीरम के सात माइक्रोलीटर एलिकोट करें और प्लेट को सीलिंग फिल्म के साथ कवर करें। इसके बाद, पीसीआर मशीन पर 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर सेरा को प्रीहीट करें और एक मिनट के लिए 100 गुना जी पर प्लेट को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें। प्रति अच्छी तरह से तैयार एंटीजन समाधान के 63 माइक्रोलीटर जोड़ें, सेरा के साथ मिलाएं, और प्रकाश से बचने के लिए पीसीआर प्लेट को सीलिंग पन्नी के साथ कवर करें।कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए 450 आरपीएम की गति से शेकर पर प्लेट को हिलाएं। और फिर, प्लेट को 18 से 24 घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। चार डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से 6-प्लेक्स प्लेट लें, जिससे प्लेट कमरे के तापमान पर आ सके।फिर, 6-प्लेक्स प्लेट के प्रत्येक कुएं में 3% ब्लॉकर ए के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्रकाश से बचने के लिए प्लेट को पन्नी से कवर करें। प्लेट को चार डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में वापस रखें और रात भर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के अंत में, एक बार जब प्लेट को रेफ्रिजरेटर से हटा दिया जाता है, तो प्लेट से सभी बफर को हटा दें। प्लेट को सूखने के लिए पेपर तौलिए पर थपथपाएं, और हर बार इसे 150 माइक्रोलीटर वॉशिंग बफर के साथ तीन बार धोएं। प्लेट को पेपर टॉवल पर सुखाएं और सीरम एंटीजन के 30 माइक्रोलीटर सीरम एंटीजन इनक्यूबेट को रात भर पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुएं से 6-प्लेक्स प्लेट के दो कुओं में डालें।प्लेट को पन्नी से कवर करें, फिर प्लेट को प्लेट शेकर पर रखें और एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 450 आरपीएम की गति से हिलाएं। 6-प्लेक्स प्लेट में मौजूद घोल को डंप करें और प्लेट को प्रति अच्छी तरह से 0.4 एम सोडियम क्लोराइड वॉशिंग बफर के 150 माइक्रोलीटर के साथ तीन बार धोएं। तीसरा धोने के बाद, पेपर टॉवल के खिलाफ प्लेट को सुखाएं और प्रत्येक कुएं में 150 माइक्रोलीटर रीडिंग बफर जोड़ें।6-प्लेक्स ईसीएल परख से जीएडीए, आईएए, आईए -2 ए, जेडएनटी 8 ए, टीजीए और सीओवीआईडी -19 ए के लिए छह ऑटोएंटीबॉडी के स्तर उनके संबंधित छह एकल ईसीएल परख और वर्तमान मानक रेडियो-बाइंडिंग परख के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध थे। सभी छह एंटीबॉडी के लिए प्रत्येक नमूने के लिए सूचकांक मूल्यों की गणना संबंधित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों के खिलाफ की गई थी। कटऑफ मूल्य से अधिक सूचकांक मूल्य देखा गया, जिसने सकारात्मक परिणाम का संकेत दिया।सीरम में ऑटोएंटीबॉडीज ने रूथेनियम-लेबल एंटीजन को बायोटिनिलेटेड एंटीजन में तोड़ दिया, जिससे मल्टीप्लेक्सिंग प्लेटफॉर्म बनाने के लिए एक विशिष्ट लिंकर के साथ एक कॉम्प्लेक्स बन गया। यह रणनीति टाइप 1 मधुमेह और सहवर्ती बीमारियों के लिए सामान्य आबादी में बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग को अधिक व्यवहार्य और अधिक कुशल बनाती है, जिससे रोगों की प्रारंभिक भविष्यवाणी और रोकथाम होती है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

मधुमेहजनक सीडी 4 की दत्तक स्थानांतरण से चूहे में त्वरित टाइप 1 मधुमेह प्रेरण + टी कोशिकाओं

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

उच्च थ्रूपुट/उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित इंट्रासेलुलर माइकोबैक्टीरिया के क्वांटिफिकेशन के लिए एक सूक्ष्म फेनोटाइपिक परख

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

आरएनए वायरस के व्यापक स्पेक्ट्रम रासायनिक inhibitors के लिए उच्च throughput प्रदर्शन

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

छोटे अणुओं मिलाना सी-di-जीएमपी में संकेत है कि जांच के लिए एक उच्च throughput सेटअप की स्थापना<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

एक प्रतिदीप्ति आधारित लिम्फोसाइट परख छोटे अणुओं के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन में लिपिड Peroxidation के उच्च प्रवाह माप के लिए सेल मुक्त जैव रासायनिक Fluorometric एंजाइमी परख

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

एक उच्च प्रवाह Cre-लोक्स सक्रिय वायरल झिल्ली फ्यूजन परख एचआईवी के अवरोधकों की पहचान के लिए-1 वायरल झिल्ली संलयन

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

साल्मोनेला एसपीपी की स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च प्रवाह मंच./शिगेला एसपीपी.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

एक उच्च थ्र्रपुट शिगेला-विशिष्ट जीवाणुनाशक परख

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

प्रकार 2 मधुमेह के साथ सहयोग में Nonalcoholic Steatohepatitis के लिए एक उन्नत Murine मॉडल

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...