Name: a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19
Uploaded: 2022-07-05T13:00:00
Duration: 6 min 46 s
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この研究は、JDRF助成金2-SRA-2019-695-S-B、2-SRA-2020-965-S-B、1-SRA-2017-564-M_N、NIH助成金DK32083、および糖尿病研究センター(DRC)助成金P30 DK116073によってサポートされました。

研究プロトコルは、コロラド州複数の施設内審査委員会によって承認されました。
1. バッファー調製
<ol><li>標識バッファー(2x PBS、pH 7.9)を調製する:100 mLの10x PBSを400 mLの蒸留水に加え、NaOHを使用してpHを7.9に調整します。</li>
	<li>3 mMのビオチンとRuスルホ-NHSを作る:1 mgのビオチンを588 μLの標識バッファーに溶解し、150 nmolのRu Sulfo-NHSを50 μLの標識バッファーに溶解します。</li>
	<li>抗原バッファー(1%BSA)の調製:5 gのウシ血清アルブミン(BSA)を500 mLの1x PBSに溶解します。</li>
	<li>コーティングバッファー(3%ブロッカーA)を調製します:15 gのブロッカーAを500 mLの1x PBSに溶解します。</li>
	<li>最初の洗浄バッファー(0.05%トゥイーン20、PBST)を準備します:2.5 mLのトゥイーン20を5,000 mLの1x PBSに混合します。</li>
	<li>2 つ目の洗浄バッファー (0.4 M NaCl) を準備します。 50 mL の 5 M NaCl を 575 mL の蒸留水に混合して、0.4 M NaCl 溶液を作ります。 注:効率的なラベリングのために、常に新しく調製されたビオチンおよびRu Sulfo-NHS溶液を使用し、以前に作成したものは保存しないでください。</li>
</ol>2.ビオチンとRuスルホ-NHSによる抗原タンパク質標識
注:より高い標識効率を得るには、抗原タンパク質≥0.5 mg/mLの濃度が高いことが推奨されます。
<ol><li>プロインスリン、GAD-65、IA-2、ZnT8、TG、およびSARS-CoV-2のスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)を含む6つの標的抗原タンパク質溶液を調製します。分子量に応じて各抗原タンパク質のモル数を計算し、ビオチンまたはRu Sulfo-NHSの適切なモル比を作成します。ビオチンまたはRuスルホ-NHSの合計に対する抗原の比率は、プロインスリンタンパク質などの小分子抗原(分子量≤10 kd)では1:5になります。ZnT8などの中分子抗原(分子量10〜50 kd)の場合、比率は1:10に調整されます。GADなどの高分子量の抗原(分子量>50 kd)の場合、モル比は1:20になります。</li>
	<li>抗原タンパク質を2等分し、ステップ2.1で計算したモル比を使用してビオチンおよびRu Sulfo-NHSと別々に混合します。混合物を室温(RT)で1.5時間インキュベートし、光を避けます。 注:抗原タンパク質のバッファーに含まれるトリスやグリシンなどの還元性化学物質はすべて、2x PBS(pH 7.9)のバッファーでプライミングしたサイジングスピンカラムで除去する必要があります。</li>
	<li>スピンカラムを2x PBSでプライミングします(スピンカラムのサイズ、2 mLまたは5 mL、標識抗原タンパク質の容量によって異なります):1 mlの2x PBSバッファーをスピンカラムに加え、1,000 x g で2分間遠心分離し、さらに2回ステップを繰り返します。</li>
	<li>抗原タンパク質-ビオチンまたは-Ruスルホ-NHS混合物をプライミングスピンカラムに1回通して(カラムを1,000 x g で2分間遠心分離)、精製して標識反応を停止させます。</li>
	<li>スピンカラムから溶出した標識抗原タンパク質の最終体積を測定し、ビオチンまたはルスルホ-NHS標識抗原タンパク質の濃度を計算する。標識抗原タンパク質のアリコート(50 μL/チューブ)を小さくし、-80°Cで保存して長期間使用します。 注:各スピンカラム後のタンパク質のカバレッジは、約90%〜95%の保持率になります。</li>
</ol>3. 6-Plex ECLアッセイ(チェッカーボードアッセイ)用のビオチンおよびRuスルホNHS標識抗原の最適な濃度と比率の定義
注:各抗原のチェッカーボードアッセイは、マルチプレックスアッセイに統合する前に必要です。
<ol><li>チェッカーボードアッセイを抗原ごとに個別に適用します。 メモ: 手順 3.2.-3.7.簡単な例としてTGAを使用します。TGAチェッカーボードアッセイプロセスは、アッセイプロセスをシミュレートすることですが、1種類の抗原のみを使用します。</li>
	<li>ビオチン化tTGおよびRuスルホ-NHS標識tTGの段階希釈を行います。最初の混合溶液の推奨使用濃度は、ビオチン化およびRuスルホ-NHS標識tTGの両方で240 ng / mLから始まります。元のビオチン化tTGとRuスルホNHS標識tTGの両方の濃度が1.0 μg/μLであると仮定します。 元のRuスルホ-NHS標識tTGの10倍希釈と、元のビオチン化tTGの5%BSA希釈を行います。</li>
	<li>4 μLのビオチン化tTGタンパク質を156 μLの5%BSA(抗原バッファー)および240 μLのストレプトアビジン結合リンカーと1本のチューブで混合し、溶液をRTで30分間インキュベートします。その後、160 μLのストップ溶液を加え、RTでさらに30分間インキュベートします。400 μLの混合物を取り、2 mLの停止液と混合します。混合物中のビオチン化tTGの濃度は240 ng/mLです。</li>
	<li>ビオチン標識ZnT8抗原の段階希釈を行うには、さらに5本の新しいチューブを準備し、ステップ3.3で混合物から1 mLのアリコートを取ります。新しいチューブで1 mLのストップ溶液と混合し、120 ng / mLの濃度の混合物を取得します。この手順を繰り返し、連続1:1希釈を行い、ビオチン標識tTGを60 ng/mL、30 ng/mL、15 ng/mL、および7.5 ng/mLで取得します。</li>
	<li>4 μLのRuスルホNHS標識tTGと1.6 mLの停止液を加え、240 ng/mLの濃度でRuスルホ-NHS標識tTGの混合物を得る。3.4.と同じステップで、連続1:1希釈を行い、60 ng / mL、30 ng / mL、15 ng / mL、7.5 ng / mL、および3.75 ng / mLでRuスルホ-NHS標識ZnT8抗原を取得します。最終濃度は0 ng/mLで、停止液のみで、Ruスルホ-NHS標識抗原は含まれていません。</li>
	<li>tTGポジティブコントロールおよびネガティブコントロール血清サンプル(単一のECL tTGアッセイによって事前認定および標準化済み)および96ウェルPCRプレートを調製します。陽性および陰性対照血清サンプルをプレートの左半分および右半分にそれぞれ分注し、各ウェルに7 μLを入れます。プレートに1x PBSを加え、ウェルあたり33 μLを使用します。</li>
	<li>PCRプレートの左半分に、24 μLの段階希釈ビオチン標識tTGリンカー溶液を各ウェル、1カラム、1濃度の高いものから低いものの順に添加します。同様に、16 μLの段階希釈Ru Sulfo-NHS標識tTG抗原を各ウェルに1列ずつ1濃度で添加し、完全に混合します。PCRプレートの右半分で手順を繰り返します。</li>
	<li>ステップ5.3.-9.1で説明されている残りのアッセイステップを続行します。生のカウントデータが得られるまで。</li>
	<li>対応する負の制御信号に対する正の制御信号の比率を計算します。陰性対照サンプルのビオチン標識抗原とRu Sulfo-NHS標識抗原の比値が高く、バックグラウンドが低い最適な濃度を決定します。ビオチンおよびRuスルホ-NHS標識抗原タンパク質の最適な使用濃度を以下に示します:GAD65の場合は16.0 ng / mLおよび8.0 ng / mL、SARS-CoV-2 RBDの場合は18.8 ng / mLおよび9.4 ng / mL、IA-2の場合は42.0 ng / mLおよび42.0 ng / mL、tTGの場合は60.0 ng / mLおよび60.0 ng / mL、ZnT8の場合は4.2 ng / mLおよび4.2 ng / mL。 プロインスリンの場合は31.3 ng / mLおよび31.3 ng / mLです。</li>
</ol>4. リンカー共役型抗原溶液の作成
<ol><li>ビオチンおよびRuスルホNHS標識抗原を5%BSAで希釈して、ステップ3.9に従って最適な使用濃度にします。</li>
	<li>事前に選択されたリンカーを各ビオチン化抗原タンパク質に結合します。1回の96ウェルプレートアッセイでは、4 μLのビオチン化GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8、およびプロインスリン抗原タンパク質を156 μLの1% BSAを含む別のチューブに加え、240 μLの対応するストレプトアビジン結合リンカー1、2、3、8、9、および10と混合します(図1)。混合物をRTで30分間インキュベートします。</li>
	<li>各チューブに160 μLのストップ溶液を分注し、混合物をRTで30分間インキュベートします。各チューブから400 μLの混合溶液を取り出し、それらを混ぜ合わせます。</li>
	<li>上記の混合物に4 μLのRuスルホ-NHS標識GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8、およびプロインスリン抗原を加え、次に1.6 mLの停止液と3.2 mLの1x PBSを加えて混合します。これで、抗原溶液をアッセイに使用する準備が整いました。</li>
</ol>5. 血清サンプルを標識抗原でインキュベートする
<ol><li>96ウェルPCRプレートにウェルあたり7 μLの血清を分注し、シーリングフィルムで覆います。血清をPCRマシンで56°Cで30分間予熱します。プレートを100 x g で1分間短時間遠心分離します。</li>
	<li>ウェルあたり63 μLの抗原溶液(ステップ4.4で調製)を加え、血清と混合します。光を避けるために、PCRプレートをシーリングホイルで覆います。</li>
	<li>プレートをシェーカーで450rpm、室温で2時間振とうし、次にプレートを4°Cで18〜24時間インキュベートします。</li>
</ol>6.6プレックスプレートを準備します
<ol><li>4°Cの冷蔵庫から6プレックスプレートを取り出し、プレートをRTにします。 6-Plexプレートの各ウェルに150 μLの3%ブロッカーAを加えます。</li>
	<li>プレートを4°Cの冷蔵庫に戻し、光を避けてホイルでプレートを覆い、一晩インキュベートします。 注:1日目のアッセイステップには、セクション4.-6が含まれます。</li>
</ol>7. 血清/抗原インキュベートを6-Plexプレートに移します。
<ol><li>翌日、インキュベーション中の6-Plexプレートを冷蔵庫から取り出し、プレートからすべてのバッファーを捨てます。プレートをペーパータオルに軽くたたいて乾かします。</li>
	<li>6-Plexプレートをウェルあたり150 μLの洗浄バッファーで毎回3回洗浄します。プレートをペーパータオルで乾かし、一晩インキュベートするPCRプレートの各ウェルから血清/抗原インキュベートを6-Plexプレートの2つのウェルに分注します(複製の場合はウェルあたり30 μL)。</li>
	<li>プレートをホイルで覆い、プレートシェーカーに置き、RTで450rpmの速度で1時間振とうします。</li>
</ol>8. 6プレックスプレートを洗浄し、読み取りバッファーを追加します
<ol><li>溶液を6-Plexプレートにダンプし、毎回ウェルあたり150 μLの0.4 M NaCl洗浄バッファーでプレートを3回洗浄します。</li>
	<li>3回目の洗浄が完了したら、プレートをペーパータオルで乾かし、150 μLの読み取りバッファーを各ウェルに加えます。 注意: 井戸内の気泡はプレートリーダーマシンの精度に影響を与えるため、絶対に避ける必要があります。</li>
</ol>9.プレートを読み、データを分析します
<ol><li>電気化学発光分析装置でプレートを数えます。読み取り結果は、カウント/秒(CPS)の値とともに表示されます。各特異的抗体の内部標準陽性および陰性対照のCPSに対するリーディングマシンから得られた生CPSを用いて各サンプルの相対抗体指数を算出する(指数値=[CPS(サンプル)-CPS(陰性標準)]/[CPS(陽性標準)-CPS(陰性標準)])。</li>
	<li>ASK研究からの555陰性対照サンプルの99.5番目 から99.8パー センタイルで確立されたカットオフ値を使用して、陰性または陽性の抗体結果を決定します(糖尿病または他のタイプの自己免疫疾患の病歴または家族歴のないすべての抗体陰性サンプル)。 注:2日目のアッセイステップには、セクション7〜9が含まれます。</li>
</ol>

<ol>
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(159), e61160 (2020).</li></ol>

著者は開示するものは何もありません。

T1Dへの介入はT1D以前の時代に入り、T1Dの国内および国際的な大規模なスクリーニングプログラムが進行中であり、臨床T1Dへの進行を廃止または遅らせるためにステージ1T1Dで活況を呈している臨床試験が適用されています12,13。単一のIAbアッセイフォーマットで現在の標準RBAを使用して4つのIAbを測定することは、マススクリーニングプログラムにとって面倒で非効率的です。ハイスループットマルチプレックスIAbsアッセイの緊急需要に伴い、マルチプレックスECLアッセイ、3スクリーンICA ELISA、および凝集PCR(ADAP)による抗体検出が現在競争力のある技術として浮上しています。ドイツの幼児集団におけるT1Dのスクリーニングに関するFr1da研究では、3つのIAbs(GADA、IA-2A、およびZnT8A)を組み合わせた3スクリーンICA ELISAが主な試験として使用されました14。3スクリーンICA ELISAの主な制限はIAAの欠如であり、これは主にT1Dの幼児に高い有病率で現れる最初のIAbです。さらに、アッセイでは、3つのIAbのどれが陽性シグナルと陽性シグナルであるかを区別することができず、確認のためにすべての陽性サンプルを3回の単一アッセイで繰り返す必要があります。ADAP15は、GADA、IA-2A、およびIAAを組み合わせて、IASPワークショップで高いアッセイ感度と特異性を示しましたが、IASPワークショップでは決定できないT1D研究の集団ベースのスクリーニングにおける予測に関するデータが不足しています。本研究のマルチプレックスECLアッセイは、TrailNet9,16、DAISY17,18,19、ASK 4,20,21などの複数の臨床試験で現在の標準RBAに対して検証された単一のECLアッセイのプラットフォーム上に構築されています。 勉強。本アッセイは、ASK試験の参加者からの880血清サンプルを用いて、RBAおよび単一のECLアッセイの両方に対して検証されています。図2および図3に示すように、6-Plexと単一ECLの間、または6-PlexとRBAの間の抗体レベルは、抗体の陽性性について互いにほぼ一致していました。RBAと6-PlexでテストされたIAbの一致率は91.7%-97.8%であり、単一のECLと6-PlexでテストされたIAbの一致率は95.3%-99.2%でした。ECLアッセイとRBAの不一致は、主に単一のIAbを有するものからであった。6-Plexと単一ECL(r = 0.6431-0.9434、すべてp < 0.0001)および6-PlexとRBA(r = 0.5775-0.8576、すべてp < 0.0001)でテストしたIAbのレベルも良好に相関していました。6-PlexアッセイでテストされたTGAは、RBA(99.4%)および単一のECLアッセイ(99.4%)の両方の結果と高い相関がありました。さらに、6-PlexによってテストされたCOVID-19Aは、単一のECLアッセイの結果に対して99.8%のコンプライアンスに達しました。
その結果、6-Plex ECLアッセイは、進行中のASK試験の主要なスクリーニング方法として正式に受け入れられ、標準のRBA22に取って代わりました。このアッセイは、標準的なRBAと比較して、より高いスループット、より低いコスト、およびより少ない血清量で、その優れた感度と特異性を示しました。
T1Dスクリーニング研究では、IAb陽性の大部分を占めるRBAによって検出された単一のIAbは、親和性が低く、疾患リスクが低く、全体的に低い中率をもたらしたことが記録されています19、21、23、24、25、26。このような低リスク予測は、フォローアップ訪問の莫大な追加コストを引き起こし、T1D予防研究を困難にしました。確立されたECLアッセイプラットフォームは、複数の臨床試験で、高親和性IAbとRBAによって生成された低親和性IAbを区別し、特に単一のIAb陽性の場合、4つのIAbすべての予測値を大幅に向上させることが実証されています16,17,18,21。.マルチプレックスECLアッセイ技術は、単一のECLアッセイのプラットフォーム上に構築されており、高親和性Abの検出というこの明確な利点があります。本研究では、6-Plex ECLアッセイは、感度と特異性において、対応する単一のECLアッセイとの類似性を示しました。
複数のPlexプレートを使用するマルチプレックスECLアッセイのいくつかの制限および技術的懸念は、以前の出版物27、28ですでにカバーされています。1つのウェルに6つの標識抗原がある場合、異なる抗原間に何らかの影響がある可能性があり、同じウェルにマルチプレックス用の各抗体アッセイを追加すると、アッセイのバックグラウンドが増加する可能性があります。各抗体アッセイの感度と特異性を維持するために、アッセイ条件を調整するために、特に各抗原のチェッカーボードアッセイに基づいて各標識抗原タンパク質の最終濃度を調整するために、大量のアッセイ最適化作業が必要です。以前の研究27,28で述べたように、少数のサンプル(<1%)は、明確な根本的な理由なしに、複数のプレックスプレートで偽の陽性をもたらします。すべての肯定的な結果は、ルーチンの実験室品質保証として、単一のECLアッセイによって繰り返され、確認されるべきです。通常、誤検知は削除されます。以前の7-Plex ECLアッセイ27,28で観察された「プロゾーン効果」によって引き起こされた偽陰性の結果は、本研究では観察されなかった。ここで説明するアッセイでは、前のプロトコルから血清サンプルの酸処理のステップを削除しました。代わりに、血清サンプルを56°Cで30分間予熱しました(ステップ5.1)。プレート洗浄の2日目には、通常の洗浄バッファーの代わりに0.4 M NaClを含む洗浄バッファーを使用し(ステップ8.1.)、プレートをより厳密に洗浄しました。これらの変更により、マルチプレックスECLアッセイがよりシンプルになり、アッセイ感度を失うことなくバックグラウンドが低下しました。
結論として、このアッセイは、4つのIAb、TGA、およびCOVID-19Aを同時に検出するための優れた性能を備えています。マルチプレックス機能、ならびに高スループット、低コスト、および少量の血清容量要件により、一般集団におけるT1Dおよび付随疾患の大規模なスクリーニングがはるかに実現可能になります。T1Dまたは自己免疫疾患の患者は、他の自己免疫疾患のリスクがはるかに高くなります。マルチプレックスECLアッセイは、T1Dと複数の自己免疫疾患を同時にスクリーニングするための優れたプラットフォームを提供します。

世界中の大規模な疫学研究は、1型糖尿病(T1D)の発生率が毎年3%〜5%急速に増加しており、T1Dの有病率は過去20年間で、特に幼児で2倍になっていることを示しています1,2。膵島自己抗体(IAb)は通常、臨床症状の何年も前に出現し、現在、T1D3の最も信頼性の高い予測および診断バイオマーカーです。T1D自己抗体のスクリーニングは、臨床T1Dに進行するリスクのある人々を特定し、一般の人々を教育し、ケトアシドーシスの生命を脅かす合併症を大幅に軽減し、予防療法の臨床試験に利益をもたらすことができます。T1Dの世界的な予防努力が進行中であり、臨床T1Dへの進行を遅らせるためにIAbs陽性の被験者の間で複数の介入試験が実施されており、バーバラデイビス糖尿病センターは、2016年にT1Dおよびセリアック病の一般集団を対象としたスクリーニングの最初の米国臨床試験を開始しました。.セリアック病(CD)は、免疫および遺伝的要因に関連する慢性腸炎症性疾患です。T1Dの小児におけるCDの有病率は最大24.5%に達する可能性があります5。CD患者の半数以上は、プレゼンテーション6で典型的な症状を示さない可能性があるため、セリアック病の血清学的スクリーニングが非常に必要です。
コロナウイルス病2019(COVID-19)のパンデミックが始まって以来、世界中で2億件以上の症例が報告されており、検査室で確認された症例の最大16%を子供が占めています7。多くの研究がCOVID-19感染の重症度と致死率に対する既存のT1Dの影響を示しています8が、COVID-19感染がT1Dの発症に与える影響は明らかではありません。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-COV-2)抗体の決定による一般集団におけるCOVID-19感染の総感染率の調査と、COVID-19感染とT1D自己免疫の誘発またはT1D進行の加速との関連の研究が緊急に必要であり、非常に重要ですが、進行中のASK研究はこのための優れたプラットフォームです。単一のアッセイ形式と低親和性抗体陽性の割合が高いため、標準的な放射性結合アッセイ(RBA)は、効率の低さと疾患特異性の低さというボトルネックを満たしています9。本論文では、セリアック病に対するトランスグルタミナーゼ(TGA)に対する自己抗体であるインスリン(IAA)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ-65(GADA)、インスリノーマ抗原-2(IA-2A)、亜鉛輸送-8(ZnT8A)の4つの主要なIAbすべてを含む、マルチプレックスプレートを使用して、以前のマルチプレックスECLアッセイプラットフォーム上に構築された新しい6-Plex電気化学発光(ECL)アッセイを1つのウェルに組み合わせます。 およびSARS-CoV-2受容体結合ドメイン(RBD)抗体(COVID-19A)。これは、4つの主要なIAbの完全なパネルを募集し、これをTGAおよびCOVID-19Aとさらに組み合わせた最初のマルチプレックスアッセイです。これは、ASK試験の標準RBAに代わる主要なスクリーニングツールとして検証され、正式に受け入れられています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mM NaCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1070832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PI21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker A</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R93AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top 500 ml-Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974064A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAD65 protein</td>
			<td>Diamyd Medical</td>
			<td>10-65702-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IA-2 protein (aa 605-979)</td>
			<td>Creative BioMart</td>
			<td>283309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MESO QuickPlex SQ120</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R31QQ-3</td>
			<td>Electrochemiluminescence analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proinsulin protein</td>
			<td>AmideBio</td>
			<td>20160118B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer B</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0800019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 RBD protein</td>
			<td>Creative Biomart</td>
			<td>Spike-190V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0090019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-TAG</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tTG protein</td>
			<td>Diarect AG</td>
			<td>15201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Plex 6-Assay SECTOR plate</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Z00U0142E</td>
			<td>6-plex plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 1</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 10</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 2</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0020015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 3</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0030018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 8</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0080018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 9</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0090014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeBa Column</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89892</td>
			<td>Spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnT8 protein</td>
			<td>Research Laboratory</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19

進行中の臨床試験である子供のための自己免疫スクリーニング(ASK)は、米国における1型糖尿病(T1D)およびセリアック病の一般集団における最初のスクリーニング研究です。コロナウイルス病2019(COVID-19)のパンデミックに伴い、一般集団におけるCOVID-19の疫学と、COVID-19感染とT1D発症との関連に関する知識が緊急に必要とされています。現在標準的な放射線結合アッセイ(RBA)のスクリーニング法は、単一のアッセイフォーマットでは効率が低く、スクリーニングで生成される低親和性抗体の割合が高いため疾患特異性が低いという2つの大きな課題に直面しています。以前に確立したマルチプレックス電気化学発光(ECL)アッセイのプラットフォームを使用して、T1D用のインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD65)、インスリノーマ抗原2(IA-2)、亜鉛トランスポーター8(ZnT8)に対する4つの膵島自己抗体(IAb)、セリアック病に対するトランスグルタミナーゼ自己抗体(TGA)、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)受容体結合ドメイン(RBD)抗体を1つのウェルに組み合わせた新しい6-Plex ECLアッセイを開発しました。 covid-19。このアッセイは、ASK試験からの880サンプル(325の陽性サンプルと555のすべての抗体陰性サンプルを含む)を使用して盲検で検証され、標準RBAおよび単一のECLアッセイと比較されました。高効率、低コスト、低血清量という利点により、このアッセイはASK研究の主要なスクリーニングツールとして受け入れられています。

表1、表2、及び表3に代表的な結果を示す。読み取り機から得られた生のCPSを表1に示します。表2において、生CPSは、6つのリンカーおよび対応する抗体によって配置および選別された。表3は、アッセイプロトコールに記載されるようにCPSを用いて計算された指数値を示す。不正な重複によって引き起こされる誤った最終インデックス結果を回避するために、すべての生のカウント値をチェックする必要があります。表1には、表3の最終的な指数計算でエラーが発生した不正な重複の例が示されています。
このアッセイは、325のIAbs陽性サンプルと555のすべてのAbs陰性サンプルを含むASK研究から選択された880サンプルを使用して盲検的に検証されました。880サンプルの6-Plex ECLアッセイからの自己抗体のレベルを、対応する単一ECLアッセイのレベル(図2)および対応する単一標準RBA(図3)とポイントごとに比較しました。各抗体のカットオフ、感度、および特異度を 表4 に列挙する。このECL-COVID-19Aアッセイの感度と特異度は、それぞれ100%と99.9%であることが確認されています10。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig01.jpg"> 図1:6-Plex ECLアッセイの図。 血清自己抗体は、Ruスルホ-NHS標識抗原をビオチン化抗原に結合させ、ビオチン化抗原と結合し、抗原-抗体-抗原-リンカーの複合体を形成します。複合体は、各特定のリンカーを介して6-Plexプレートの特定のスポットに捕捉されます。各抗原について、特定のリンカー番号が割り当てられました:GAD-リンカー-1、Covid-19-リンカー-2、IA-2-リンカー-3、tTG-リンカー-8、ZnT8-リンカー-9、およびプロインスルリン-10。この図は、Heらの許可を得て修正されています11。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig02.jpg"> 図2:ASK試験の880サンプル中の6つの抗体レベルを、単一ECLアッセイと6-Plex ECLアッセイで比較したものです。 パネルには、それぞれGADA、IAA、IA-2A、ZnT8A、TGA、およびCOVID-19Aの抗体レベルの比較が表示されます(COVID-19Aのインデックスは(100 x計算されたインデックス値)として提示されました)。点線は、各抗体アッセイのアッセイカットオフを表す。この図は、Heらの許可を得て修正されています11。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig03.jpg"> 図3:ASK試験の880サンプル中の5つの抗体レベルをRBAと6-Plex ECLアッセイで比較 。パネルには、それぞれGADA、IAA、IA-2A、ZnT8A、およびTGAの抗体レベルの比較が表示されます。点線は、各抗体アッセイのアッセイカットオフを表す。この図は、Heらの許可を得て修正されています11。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:生のCPSカウント(プレートの左半分)。 アッセイプレートの左半分から取得した生のCPSカウント。各サンプルは重複して実行されます。同じ列(A1、A2、A3など)内の各CPSカウントは、同じウェル内の10個のスポットからのリーディングデータを表します(対応するリンカー番号がマークされています)。不正な重複の例は、行 D リンカー 3 の列 5 と列 6 に示すように、灰色で強調表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%201.zip" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:表1のデータの配置を、6つのリンカーでソートした。 表1のCPS値を再配置し、CPSの重複読み取り値の平均値を計算し、リンカー4〜7の未使用の値を削除しました。各自己抗体アッセイの内部標準高陽性、低陽性、および陰性コントロールの値は、濃い太字でマークされています。PC、ポジティブコントロール。NC、ネガティブコントロール。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%202.zip" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表 3: インデックス値の結果。 6つの抗体全てについて各サンプルについての指標値を、対応する陽性および陰性対照に対して計算した。カットオフ値より大きいインデックス値は正として定義され、濃い太字でマークされています。 表1の行D-リンカー3列5および6の悪い重複CPS値は、サンプル11の正のIA-2Aインデックス値(灰色で強調表示)につながり、おそらく偽陽性の結果でした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table_3.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表4:325のIAbs陽性サンプルと555のすべての抗体陰性サンプルを含む880のASKサンプルにおけるGADA、IA-2A、ZnT8A、IAA、およびTGAのアッセイカットオフ、感度、および特異性。 GADA、IA−2A、ZnT8A、IAA、およびTGAアッセイの最適なカットオフ指数値は、555個の正常対照サンプルの少なくとも99パーセンタイルに設定されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%204.zip" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19

1型糖尿病、セリアック病、コロナウイルス病2019のスクリーニングの緊急の必要性に沿って、4つの膵島自己抗体、組織トランスグルタミナーゼ自己抗体、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2の受容体結合ドメインに対する抗体をすべて同時に検出するハイスループット6-Plex電気化学発光アッセイを開発しました。

1型糖尿病、セリアック病、およびCOVID-19のハイスループット多重化スクリーニング

An ongoing clinical trial, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), is the first screening study in the general population for type 1 diabetes (T1D) and ...

新しい6-Plex ECLアッセイは、検証され、現在、一般集団スクリーニングの臨床試験に適用されている最初のマルチプレックスアッセイです。1型糖尿病、セリアック病、COVID-19を大規模な集団でスクリーニングするのに適した6つの自己抗体アッセイを同時に組み合わせています。現在の標準的な自己抗体アッセイと比較して、この技術は、複数の自己免疫疾患に対する複数の自己抗体を同時により効率的にスクリーニングすることができる。この技術の意味は、大規模なスクリーニングをより実行可能で疾患特異的なものにし、予防のための早期疾患予測と治療のためのより正確な診断につながります。まず、4マイクロリットルのビオチン化GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8、およびプロインスリン抗原タンパク質を156マイクロリットルの1%BSAを含むチューブに加え、240マイクロリットルの対応するストレプトアビジン結合リンカー1、2、3、8、9、および10と混合します。次いで、混合物を室温で30分間インキュベートする。160マイクロリットルの停止液を各チューブに分注し、混合物を室温で30分間インキュベートします。次に、各チューブから400マイクロリットルの混合溶液を取り出し、それらを混ぜ合わせます。4マイクロリットルのルテニウム標識GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8、およびプロインスリン抗原を混合物に追加します。次に、1.6ミリリットルのストップ溶液と3.2ミリリットルのPBSを追加します。すべての成分をよく混ぜます。そして今、抗原溶液はアッセイで使用する準備ができています。96ウェルPCRプレートの場合、ウェルあたり7マイクロリットルの血清を分注し、プレートをシーリングフィルムで覆います。次に、血清をPCRマシンで摂氏56度で30分間予熱し、プレートを100倍Gで1分間短時間遠心分離します。調製した抗原溶液をウェルあたり63マイクロリットル加え、血清と混合し、PCRプレートをシーリングホイルで覆い、光を避けます。プレートをシェーカー上で450rpmの速度で室温で2時間振とうする。次に、プレートを摂氏4度で18〜24時間インキュベートします。摂氏4度の冷蔵庫から6プレックスプレートを取り出し、プレートを室温に戻します。次に、150マイクロリットルの3%ブロッカーAを6-Plexプレートの各ウェルに追加します。光を避けるためにプレートをホイルで覆います。プレートを摂氏4度の冷蔵庫に戻し、一晩インキュベートします。インキュベーションの最後に、プレートが冷蔵庫から取り出されたら、プレートからすべてのバッファーを取り出します。プレートをペーパータオルの上に軽くたたいて乾かし、毎回ウェルあたり150マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄します。プレートをペーパータオル上で乾燥させ、一晩インキュベートPCRプレートの各ウェルから30マイクロリットルの血清抗原インキュベートを6-Plexプレートの2つのウェルに分注します。プレートをホイルで覆い、プレートシェーカーに置き、室温で450rpmの速度で1時間振とうします。6-Plexプレートに存在する溶液をダンプし、ウェルあたり150マイクロリットルの0.4 M塩化ナトリウム洗浄バッファーでプレートを3回洗浄します。3回目の洗浄が完了したら、プレートをペーパータオルで乾かし、150マイクロリットルの読み取りバッファーを各ウェルに加えます。6-Plex ECLアッセイからのGADA、IAA、IA-2A、ZnT8A、TGA、およびCOVID-19Aに対する6つの自己抗体のレベルは、対応する6つの単一ECLアッセイおよび現在の標準的な放射性結合アッセイとよく相関していました。6つの抗体全てについて各サンプルについての指標値を、対応する陽性および陰性対照に対して計算した。カットオフ値よりも大きい指標値が観察され、これは肯定的な結果を示した。血清中の自己抗体は、ビオチン化抗原に対するルテニウム標識抗原を破り、特異的リンカーとの複合体を形成してマルチプレックスプラットフォームを構築した。この戦術により、1型糖尿病および付随する疾患の一般集団における大規模なスクリーニングがより実行可能かつ効率的になり、疾患の早期予測と予防につながります。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

糖尿病CD4の養子移入+ T細胞によるマウスの加速された1型糖尿病の誘導

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNAウイルスの広域スペクトルの化学抑制剤のためのハイスループットスクリーニング

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em&gt;緑膿菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

高密度リポタンパク質の脂質過酸化反応の高スループット測定用無細胞生化学的蛍光酵素試金

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

高スループットの Cre Lox 活性化ウイルスの膜融合アッセイの HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別するために

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

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A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

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Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

2型糖尿病と関連した非アルコール性脂肪性肝炎のための高度なマウスモデル

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