Name: a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19
Uploaded: 2022-07-05T13:00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19 at JoVE.com

Studien ble støttet av JDRF-stipend 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, NIH-stipend DK32083 og Diabetes Research Center (DRC) stipend P30 DK116073.

Forskningsprotokollen ble godkjent av Colorado Multiple Institutional Review Board.
1. Forberedelse av buffer
<ol><li>Forbered merkebufferen (2x PBS, pH 7,9): Tilsett 100 ml 10x PBS til 400 ml destillert vann og juster pH ved hjelp av NaOH til 7,9.</li>
	<li>Lag 3 mM biotin og Ru Sulfo-NHS: Oppløs 1 mg biotin i 588 μL merkebuffer og oppløs 150 nmol Ru Sulfo-NHS i 50 μL merkebuffer.</li>
	<li>Forbered antigenbufferen (1% BSA): Løs opp 5 g bovint serumalbumin (BSA) i 500 ml 1x PBS.</li>
	<li>Forbered beleggbufferen (3% blokkering A): Oppløs 15 g blokkering A i 500 ml 1x PBS.</li>
	<li>Forbered den første vaskebufferen (0,05 % Tween 20, PBST): Bland 2,5 ml Tween 20 i 5000 ml 1x PBS.</li>
	<li>Forbered den andre vaskebufferen (0,4 M NaCl): Bland 50 ml 5 M NaCl i 575 ml destillert vann for å lage 0,4 M NaCl-oppløsningen. MERK: For effektiv merking, bruk alltid nytilberedte biotin- og Ru Sulfo-NHS-løsninger og ikke lagrede som er laget tidligere.</li>
</ol>2. Antigenproteinmerking med biotin og Ru Sulfo-NHS separat
MERK: En høyere konsentrasjon av antigenprotein ≥0,5 mg / ml anbefales for høyere merkingseffektivitet.
<ol><li>Forbered seks målrettede antigenproteinløsninger, inkludert proinsulin, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG og reseptorbindende domene (RBD) av piggproteinet til SARS-CoV-2. Beregn molene til hvert antigenprotein i henhold til dets molekylvekt og gjør passende molare forhold mellom biotin eller Ru Sulfo-NHS. Forholdet mellom antigen og summen av biotin eller Ru Sulfo-NHS vil være 1: 5 for små molekylære antigener (molekylvekt ≤10 kd), slik som proinsulinprotein. For medium molekylære antigener (molekylvekt 10-50 kd), slik som ZnT8, vil forholdet justere seg til 1:10. For store molekylvektantigener (molekylvekt >50 kd), slik som GAD, vil molforholdet være 1:20.</li>
	<li>Del antigenproteinet i to like deler og bland det separat med biotin og Ru Sulfo-NHS ved hjelp av det beregnede molforholdet i trinn 2.1. Inkuber blandingen ved romtemperatur (RT) i 1,5 timer, unngå lys. MERK: Alle reduserende kjemikalier som Tris eller glycin i bufferen av antigenprotein må fjernes ved en dimensjoneringsspinnkolonne primet med en buffer på 2x PBS (pH 7,9).</li>
	<li>Prime spinnkolonnene med 2x PBS (størrelsen på spinnkolonnen, 2 ml eller 5 ml, avhenger av volumet av merkingsantigenproteinet): Tilsett 1 ml 2x PBS-buffer i spinnkolonnen, sentrifuger den ved 1,000 x g i 2 minutter, og gjenta trinn 2x mer.</li>
	<li>La antigenprotein-biotin eller -Ru Sulfo-NHS-blandingen gå gjennom den primede spinnkolonnen 1x (sentrifuger kolonnen ved 1000 x g i 2 minutter) for å rense og stoppe merkingsreaksjonen.</li>
	<li>Mål det endelige volumet av det merkede antigenproteinet eluert fra spinnkolonnene, og beregne konsentrasjonene av biotin- eller Ru Sulfo-NHS-merket antigenprotein. Lag mindre aliquots av merket antigenprotein (50 μL / rør) og lagre dem ved -80 ° C for langvarig bruk. MERK: Dekningen av protein etter hver spinnkolonne vil være en omtrentlig 90% -95% retensjonsrate.</li>
</ol>3. Definer den beste konsentrasjonen og forholdene for biotin- og Ru Sulfo-NHS-merkede antigener for 6-Plex ECL-analysen (sjakkbrettanalyse)
MERK: Sjakkbrettanalysen for hvert antigen er nødvendig før integrering i den multipleksede analysen.
<ol><li>Påfør sjakkbrettanalysen for hvert antigen separat. MERK: Trinn 3.2.-3.7. vil bruke TGA som et kort eksempel. TGA checkerboard assay-prosessen er å simulere analyseprosessen, men med bare en type antigen.</li>
	<li>Gjør seriell fortynning av biotinylert tTG og Ru Sulfo-NHS-merket tTG. De anbefalte arbeidskonsentrasjonene av den første blandingsoppløsningen starter fra 240 ng / ml for både biotinylert og Ru Sulfo-NHS-merket tTG. Anta at konsentrasjonene av både original biotinylert og Ru Sulfo-NHS-merket tTG er 1,0 μg / μL. Lag en 10x fortynning av den opprinnelige Ru Sulfo-NHS-merkede tTG og en 5x fortynning av den opprinnelige biotinylerte tTG med 5% BSA.</li>
	<li>Bland 4 μL biotinylert tTG-protein med 156 μL 5% BSA (antigenbuffer) og 240 μL av den streptavidinkonjugerte linkeren i ett rør og inkuber løsningen ved RT i 30 minutter. Tilsett deretter 160 μL stoppløsning, og inkuber ved RT i ytterligere 30 minutter. Ta 400 μL av blandingen og bland med 2 ml stoppoppløsning. Konsentrasjonen av biotinylert tTG i blandingen er 240 ng / ml.</li>
	<li>For å lage en seriell fortynning for biotinmerket ZnT8-antigen, lag ytterligere fem nye rør, ta 1 ml av en aliquot fra blandingen i trinn 3.3. og bland med 1 ml stoppløsning i et nytt rør, og få blandingen med en konsentrasjon på 120 ng / ml. Gjenta dette trinnet, lag serielle 1: 1 fortynninger, og få biotinmerket tTG ved 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml og 7,5 ng / ml.</li>
	<li>Tilsett 4 μL Ru Sulfo-NHS-merket tTG med 1,6 ml stoppløsning, og få en blanding av Ru Sulfo-NHS-merket tTG i en konsentrasjon på 240 ng / ml. Med de samme trinnene på 3.4., lag serielle 1: 1 fortynninger og få Ru Sulfo-NHS-merket ZnT8-antigen ved 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml, 7,5 ng / ml og 3,75 ng / ml. Den siste konsentrasjonen er 0 ng / ml, med bare stoppløsning og ikke noe Ru Sulfo-NHS-merket antigen.</li>
	<li>Forbered tTG-positive kontroll- og negative kontrollserumprøver (prekvalifisert og standardisert av en enkelt ECL tTG-analyse) og en 96-brønns PCR-plate. Aliquot de positive og negative kontrollserumprøvene til henholdsvis venstre halvdel og høyre halvdel av platen, med 7 μL i hver brønn. Tilsett 1x PBS på platen, med 33 μL per brønn.</li>
	<li>På venstre halvdel av PCR-platen tilsettes 24 μL av den seriefortynnede biotinmerkede tTG-linkerløsningen til hver brønn, en kolonne med en konsentrasjon i rekkefølge fra høyeste til laveste. På samme måte tilsettes 16 μL av serielt fortynnet Ru Sulfo-NHS merket tTG-antigen til hver brønn, en rad med en konsentrasjon, og blandes deretter grundig. Gjenta trinnet på høyre halvdel av PCR-platen.</li>
	<li>Fortsett resten av analysetrinnene som er beskrevet i trinn 5.3.-9.1. til råtellingsdataene er oppnådd.</li>
	<li>Beregn forholdet mellom positive styresignaler og tilsvarende negative styresignaler. Bestem den beste konsentrasjonen for det biotinmerkede antigenet og Ru Sulfo-NHS-merket antigen med høyere forholdsverdier og lavere bakgrunn for den negative kontrollprøven. De optimale arbeidskonsentrasjonene av biotin og Ru Sulfo-NHS merket antigenprotein er vist nedenfor: 16,0 ng / ml og 8,0 ng / ml for GAD65, 18,8 ng / ml og 9,4 ng / ml for SARS-CoV-2 RBD, 42,0 ng / ml og 42,0 ng / ml for IA-2, 60,0 ng / ml og 60,0 ng / ml for tTG, 4,2 ng / ml og 4,2 ng / ml for ZnT8, og 31,3 ng/ml og 31,3 ng/ml for proinsulin.</li>
</ol>4. Lag linker-koblet antigenløsning
<ol><li>Fortynn biotin- og Ru Sulfo-NHS-merkede antigener med 5% BSA til de optimale arbeidskonsentrasjonene i henhold til trinn 3.9.</li>
	<li>Bind forhåndsvalgte linkere til hvert biotinylert antigenprotein. For en 96-brønns plateanalyse, tilsett 4 μL biotinylert GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 og proinsulinantigenprotein i et separat rør som inneholder 156 μL 1% BSA og bland med 240 μL tilsvarende streptavidinkonjugerte linkere 1, 2, 3, 8, 9 og 10 (figur 1). Inkuber blandingen i 30 minutter ved RT.</li>
	<li>Aliquot 160 μL stoppløsning i hvert rør og inkuber blandingen ved RT i 30 minutter. Ta ut 400 μL av blandingsoppløsningen fra hvert rør og kombiner dem sammen.</li>
	<li>Tilsett 4 μL Ru Sulfo-NHS merket GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 og proinsulinantigen til blandingen ovenfor, og tilsett deretter 1,6 ml stoppløsning og 3,2 ml 1x PBS og bland. Nå er antigenoppløsningen klar til bruk i analysen.</li>
</ol>5. Inkuber serumprøver med det merkede antigenet
<ol><li>Aliquot 7 μL serum per brønn for en 96-brønns PCR-plate og deksel med tetningsfilm. Forvarm seraen ved 56 °C i 30 minutter på en PCR-maskin. Sentrifuger platen kort ved 100 x g i 1 min.</li>
	<li>Tilsett 63 μL antigenoppløsning (fremstilt i trinn 4.4) per brønn, og bland med sera. Dekk PCR-platen med tetningsfolie for å unngå lys.</li>
	<li>Rist platen på en shaker ved 450 o / min ved RT i 2 timer og inkuber deretter platen ved 4 ° C i 18-24 timer.</li>
</ol>6. Forbered 6-Plex-platen
<ol><li>Ta en 6-Plex plate fra 4 ° C kjøleskapet, slik at platen kommer til RT. Tilsett 150 μL 3% blokkering A til hver brønn på 6-plex-platen.</li>
	<li>Sett platen tilbake i 4 °C kjøleskap, dekk platen med folie og inkuber over natten. MERK: Analysetrinnene i dag 1 omfatter avsnitt 4.-6.</li>
</ol>7. Overfør serum/antigen inkuberer til 6-plex-platen
<ol><li>Neste dag, ta den rugende 6-Plex-platen fra kjøleskapet og dump all bufferen ut av platen. Klapp tallerkenen på tørkepapir for å tørke ut.</li>
	<li>Vask 6-Plex-platen 3x med 150 μL vaskebuffer per brønn hver gang. Tørk tallerkenen på tørkepapir, og aliquot serum/antigen inkuberer fra hver brønn i den inkuberende PCR-platen over natten i to brønner av 6-Plex-platen (30 μL per brønn for duplikater).</li>
	<li>Dekk platen med folie, legg deretter platen på en plateskaker, og rist med en hastighet på 450 o / min ved RT i 1 time.</li>
</ol>8. Vask 6-Plex-platen og legg til lesebuffer
<ol><li>Dump løsningen i 6-Plex-platen og vask platen 3x med 150 μL 0,4 M NaCl vaskebuffer per brønn hver gang.</li>
	<li>Etter at den tredje vasken er fullført, tørk platen mot papirhåndkleet og tilsett 150 μL lesebuffer i hver brønn. MERK: Luftbobler i brønnen påvirker nøyaktigheten til platelesermaskinen og bør unngås for enhver pris.</li>
</ol>9. Les platen og analyser dataene
<ol><li>Tell platen på en elektrokjemiluminescensanalysator. Leseresultatene vil bli presentert med verdiene i antall per sekund (CPS). Beregn den relative antistoffindeksen for hver prøve ved hjelp av rå CPS oppnådd fra lesemaskinen mot CPS for den interne standard positive og negative kontrollen av hvert spesifikt antistoff (Indeksverdi = [CPS (utvalg) - CPS (negativ standard)] / [CPS (positiv standard) - CPS (negativ standard)]).</li>
	<li>Bestem negative eller positive antistoffresultater ved hjelp av grenseverdiene som er etablert ved 99,5th til 99,8th persentiler av 555 negative kontrollprøver fra ASK-studien (alle antistoffer negative prøver uten historie eller familiehistorie av diabetes eller annen type autoimmun sykdom). MERK: Analysetrinnene på dag 2 omfatter §§ 7-9.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Group, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Environmental+Determinants+of+Diabetes+in+the+Young+(TEDDY)+Study.">The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY) Study.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1150, 1-13 (2008).</li><li>Vehik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+incidence+of+type+1+diabetes+in+0-+to+17-year-old+Colorado+youth.">Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth.</a> Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).</li><li>Insel, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+presymptomatic+type+1+diabetes:+a+scientific+statement+of+JDRF,+the+Endocrine+Society,+and+the+American+Diabetes+Association.">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li><li>Stahl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+screening+for+celiac+disease:+The+autoimmunity+screening+for+kids+study.">Mass screening for celiac disease: The autoimmunity screening for kids study.</a> The American Journal of Gastroenterology. 116 (1), 180-187 (2021).</li><li>Al-Hussaini, A., Sulaiman, N., Al-Zahrani, M., Alenizi, A., El Haj, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+celiac+disease+among+Saudi+children+with+type+1+diabetes:+A+prospective+cross-sectional+study.">High prevalence of celiac disease among Saudi children with type 1 diabetes: A prospective cross-sectional study.</a> BMC Gastroenterology. 12, 180 (2012).</li><li>Agardh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+features+of+celiac+disease:+A+prospective+birth+cohort.">Clinical features of celiac disease: A prospective birth cohort.</a> Pediatrics. 135 (4), 627-634 (2015).</li><li>COVID-19: Clinical manifestations and diagnosis in children. UpToDate Available from: <a target="_blank" href="https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print">https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print</a> (2021)</li><li>Barron, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+type+1+and+type+2+diabetes+with+COVID-19-related+mortality+in+England:+a+whole-population+study.">Associations of type 1 and type 2 diabetes with COVID-19-related mortality in England: a whole-population study.</a> The Lancet Diabetes &amp; Endocrinology. 8 (10), 813-822 (2020).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemiluminescence+assays+for+insulin+and+glutamic+acid+decarboxylase+autoantibodies+improve+prediction+of+type+1+diabetes+risk.">Electrochemiluminescence assays for insulin and glutamic acid decarboxylase autoantibodies improve prediction of type 1 diabetes risk.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).</li><li>Jia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+SARS-CoV-2+antibodies+in+children+and+adults+with+Type+1+diabetes.">Prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in children and adults with Type 1 diabetes.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 23 (7), 517-521 (2021).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multiplex+electrochemiluminescence+assay+applicable+to+general+population+screening+for+type+1+diabetes+and+celiac+disease.">High-throughput multiplex electrochemiluminescence assay applicable to general population screening for type 1 diabetes and celiac disease.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. , (2022).</li><li>McQueen, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+and+cost-effectiveness+of+large-scale+screening+for+type+1+diabetes+in+Colorado.">Cost and cost-effectiveness of large-scale screening for type 1 diabetes in Colorado.</a> Diabetes Care. 43 (7), 1496-1503 (2020).</li><li>Insel, R. A., Dunne, J. L., Ziegler, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+population+screening+for+type+1+diabetes:+has+its+time+come.">General population screening for type 1 diabetes: has its time come.</a> Current Opinion in Endocrinology &amp; Diabetes and Obesity. 22 (4), 270-276 (2015).</li><li>Ziegler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+Screen+ELISA+for+high-throughput+detection+of+beta+cell+autoantibodies+in+capillary+blood.">3 Screen ELISA for high-throughput detection of beta cell autoantibodies in capillary blood.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).</li><li>Cortez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+multiple+islet+autoantibodies+in+type+1+diabetes+using+small+sample+volumes+by+agglutination-PCR.">Sensitive detection of multiple islet autoantibodies in type 1 diabetes using small sample volumes by agglutination-PCR.</a> PLoS One. 15 (11), 0242049 (2020).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL-IAA+and+ECL-GADA+can+identify+high-risk+single+autoantibody-positive+relatives+in+the+TrialNet+pathway+to+prevention+study.">ECL-IAA and ECL-GADA can identify high-risk single autoantibody-positive relatives in the TrialNet pathway to prevention study.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinsulin/Insulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity.">Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes.">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk:+Nonradioactive+bivalent+proinsulin/insulin+autoantibody+assay.">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: Nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+sensitivity+and+earlier+identification+of+celiac+disease+autoimmunity+by+a+nonradioactive+assay+for+transglutaminase+autoantibodies.">Higher sensitivity and earlier identification of celiac disease autoimmunity by a nonradioactive assay for transglutaminase autoantibodies.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 2904563 (2016).</li><li>Jia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+ZnT8+autoantibodies+by+electrochemiluminescence+assay+improve+risk+prediction+for+type+1+diabetes.">High-affinity ZnT8 autoantibodies by electrochemiluminescence assay improve risk prediction for type 1 diabetes.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (12), 3455-3463 (2021).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete-panel+islet+autoantibody+multiplex+ECL+assay.">A complete-panel islet autoantibody multiplex ECL assay.</a> Diabetes. 70, 158 (2021).</li><li>Achenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+high-affinity+immune+responses+to+(pro)insulin+anticipate+the+autoimmune+cascade+that+leads+to+type+1+diabetes.">Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (4), 589-597 (2004).</li><li>Schlosser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+insulin-autoantibody-positive+children+from+the+general+population,+antibody+affinity+identifies+those+at+high+and+low+risk.">In insulin-autoantibody-positive children from the general population, antibody affinity identifies those at high and low risk.</a> Diabetologia. 48 (9), 1830-1832 (2005).</li><li>Mayr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD+autoantibody+affinity+and+epitope+specificity+identify+distinct+immunization+profiles+in+children+at+risk+for+type+1+diabetes.">GAD autoantibody affinity and epitope specificity identify distinct immunization profiles in children at risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 56 (6), 1527-1533 (2007).</li><li>Siljander, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+insulin+autoantibody+affinity+as+a+predictive+marker+for+type+1+diabetes+in+young+children+with+HLA-conferred+disease+susceptibility.">Role of insulin autoantibody affinity as a predictive marker for type 1 diabetes in young children with HLA-conferred disease susceptibility.</a> Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 25 (7), 615-622 (2009).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multiplexed+autoantibody+detection+to+screen+type+1+diabetes+and+multiple+autoimmune+diseases+simultaneously.">High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously.</a> Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).</li><li>Jia, X., He, L., Gu, Y., High, H., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+electrochemiluminescence+7-plex+assay+simultaneously+screening+for+type+1+diabetes+and+multiple+autoimmune+diseases.">A high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e61160 (2020).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Intervensjonen for T1D har gått inn i pre-T1D-æraen, med pågående nasjonale og internasjonale storskala screeningsprogrammer for T1D og blomstrende kliniske studier som brukes i trinn 1 T1D for å oppheve eller bremse progresjonen til kliniskT1D 12,13. Målinger av fire IAb-er ved bruk av gjeldende standard RBA med et enkelt IAb-analyseformat er arbeidskrevende og ineffektivt for et massescreeningsprogram. Med den presserende etterspørselen etter en multiplekset IAbs-analyse med høy gjennomstrømning, har multiplekset ECL-analyse, 3-Screen ICA ELISA og antistoffdeteksjon ved agglutinerings-PCR (ADAP) dukket opp som for tiden konkurransedyktige teknologier. I Fr1da-studien av screening for T1D i en populasjon av små barn i Tyskland, ble 3-Screen ICA ELISA kombinere 3 IAbs (GADA, IA-2A og ZnT8A) brukt som hovedtest14. En stor begrensning av 3-Screen ICA ELISA er mangelen på IAA, som for det meste er den første IAb som vises med høy prevalens hos små barn med T1D. Videre er analysen ikke i stand til å skille hvilken av de tre IAbene som er positiv fra et positivt signal, og hver positiv prøve må gjentas med tre enkeltanalyser for bekreftelse. ADAP15 kombinerer GADA, IA-2A og IAA og illustrerte høy analysefølsomhet og spesifisitet i IASP-verkstedet, men mangler data om hvor prediktivt det er i populasjonsbasert screening for T1D-studier, som IASP-verkstedet ikke er i stand til å bestemme. Multiplex ECL-analysen i denne studien er bygget på plattformen av en enkelt ECL-analyse som er validert mot gjeldende standard RBA i flere kliniske studier som TrailNet 9,16, DAISY17,18,19 og ASK 4,20,21 studium. Den foreliggende analysen er validert mot både RBA- og enkelt-ECL-analyse ved bruk av 880 serumprøver fra deltakerne i ASK-studien. Som vist i figur 2 og figur 3 var antistoffnivåer mellom 6-plex og enkelt ECL eller mellom 6-plex og RBA for det meste kongruente med hverandre for positiviteten til antistoffer. Tilfeldighetsratene for IAbs testet av RBA og 6-Plex var 91,7% -97,8%, og tilfeldighetsratene for IAbs testet av enkelt ECL og 6-Plex var 95,3% -99,2%. Uenighet mellom ECL-analysen og RBA var hovedsakelig fra de med enkelt IAb. Nivåene av IAbs testet av 6-Plex og enkelt ECL (r = 0,6431-0,9434, alle p < 0,0001) og 6-Plex og RBA (r = 0,5775-0,8576, alle p < 0,0001) var også godt korrelert. TGA testet med 6-plex analyse var sterkt korrelert med resultatene av både RBA (99,4 %) og enkelt ECL-analyse (99,4 %). I tillegg oppnådde COVID-19A testet av 6-Plex 99,8 % samsvar med resultatene av den enkle ECL-analysen.
Som et resultat har 6-Plex ECL-analysen formelt blitt akseptert som den primære screeningmetoden for den pågående ASK-studien og erstattet standarden RBA22. Denne analysen viste sin utmerkede følsomhet og spesifisitet med høyere gjennomstrømning, lavere kostnader og mindre volum serum sammenlignet med standard RBA.
Det er dokumentert at i T1D-screeningstudien var enkelt IAb oppdaget av RBA, som tok opp en stor andel av IAb-positiviteter, av lav affinitet, med lav sykdomsrisiko, og resulterte i samlet lav prediktiv verdi 19,21,23,24,25,26. Slike lav risiko prediksjon forårsaket store ekstra kostnader for oppfølgingsbesøk og resulterte i vanskeligheter for T1D forebyggende studier. Den etablerte ECL-analyseplattformen har blitt demonstrert i flere kliniske studier for å diskriminere IAb-er med høy affinitet fra IAb-er med lav affinitet generert av RBA og forbedre de prediktive verdiene for alle fire IAb-ene, spesielt med enkelt IAb-positivitet16,17,18,21 . Multiplex ECL-analyseteknologien ble bygget på plattformen til den enkle ECL-analysen, med denne distinkte fordelen med deteksjon av abs med høy affinitet. I denne studien illustrerte 6-Plex ECL-analysen dens likhet med de tilsvarende enkelt-ECL-analysene i sensitivitet og spesifisitet.
Noen begrensninger og de tekniske bekymringene til multipleks-ECL-analysen ved bruk av flere Plex-plater er allerede dekket i tidligere publikasjoner27,28. Med seks merkede antigener i en brønn kan det være noen påvirkninger mellom forskjellige antigener, og analysebakgrunnen kan øke når man legger til hver antistoffanalyse for multipleksing i samme brønn. En stor mengde analyseoptimaliseringsarbeid er nødvendig for å justere analysebetingelsene, spesielt for å justere de endelige konsentrasjonene av hvert merket antigenprotein basert på sjakkbrettanalysen for hvert antigen, for å opprettholde følsomheten og spesifisiteten for hver antistoffanalyse. Som nevnt i tidligere studier27,28, resulterer et lite antall prøver (<1%) i falsk positivitet på flere Plex-plater uten en klar underliggende årsak. Alle positive resultater bør gjentas og bekreftes med en enkelt ECL-analyse som rutinemessig laboratoriekvalitetssikring; Vanligvis vil de falske positivene bli fjernet. Falske negative resultater forårsaket av "prozoneffekten" observert i den forrige 7-Plex ECL-analysen27,28 ble ikke observert i denne studien. I analysen beskrevet her fjernet vi trinnet i syrebehandlingen av serumprøver fra forrige protokoll; i stedet forvarmet vi serumprøvene ved 56 °C i 30 minutter (trinn 5.1.). På den andre dagen av platevask brukte vi en vaskebuffer som inneholdt 0,4 M NaCl (trinn 8,1.) i stedet for vanlig vaskebuffer for å vaske platen strengere. Disse modifikasjonene gjorde multipleksen ECL-analysen enklere og senket bakgrunnen uten å miste analysefølsomheten.
Avslutningsvis har denne analysen enestående ytelse for å oppdage fire IAbs, TGA og COVID-19A samtidig. Multipleksingsfunksjonen, samt høy gjennomstrømning, lave kostnader og lite serumvolumkrav, gjør storskala screening for T1D og samtidige sykdommer mye mer gjennomførbart i befolkningen generelt. Pasienter med T1D eller noen autoimmune sykdommer har en mye høyere risiko for andre autoimmune sykdommer. Multiplex ECL-analysen gir en utmerket plattform for å skjerme for T1D og flere autoimmune sykdommer samtidig.

Store epidemiologiske studier over hele verden viser at forekomsten av type 1 diabetes (T1D) har økt raskt med 3% -5% årlig, og forekomsten av T1D har doblet seg de siste 20 årene, spesielt hos små barn 1,2. Islet autoantistoffer (IAbs) vises vanligvis år før kliniske symptomer og er for tiden de mest pålitelige prediktive og diagnostiske biomarkørene for T1D3. Screening for T1D-autoantistoffer kan identifisere personer i fare for å utvikle seg til klinisk T1D, utdanne publikum, i stor grad redusere livstruende komplikasjon av ketoacidose og dra nytte av kliniske studier for forebyggende terapier. Verdensomspennende forebyggende innsats for T1D pågår, og flere intervensjonsforsøk utføres blant personer med IAbs positive for å forsinke progresjonen til klinisk T1D, og Barbara Davis Center for Diabetes lanserte den første amerikanske kliniske studien av screening i befolkningen generelt i 2016 for T1D og cøliaki, Autoimmunity Screening for the Kids (ASK)4 . Cøliaki (CD) er en kronisk intestinal inflammatorisk sykdom relatert til immun og genetiske faktorer. Utbredelsen av CD hos barn med T1D kan nå opptil 24,5%5. Mer enn halvparten av personer med CD kan ikke ha typiske symptomer ved presentasjon6, så serologisk screening for cøliaki er ganske nødvendig.
Siden pandemien med koronavirussykdom 2019 (COVID-19) startet, har over 200 millioner tilfeller blitt rapportert globalt, og barn står for opptil 16% av laboratoriebekreftede tilfeller7. Mange studier har vist virkningen av eksisterende T1D på alvorlighetsgraden og dødsfallet av COVID-19-infeksjon8, mens virkningen av COVID-19-infeksjon på T1D-utvikling ikke er klar. Undersøkelsen av den totale frekvensen av COVID-19-infeksjon i befolkningen generelt ved bestemmelse av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-COV-2) antistoffer og studien av sammenhengen mellom COVID-19-infeksjon og utløsende T1D-autoimmunitet eller akselererende T1D-progresjon er presserende og svært viktig, mens den pågående ASK-studien er en utmerket plattform for dette. På grunn av enkeltanalyseformatet og genereringen av en stor andel av antistoffpositivitet med lav affinitet, har standard radiobindende analyse (RBA) møtt en flaskehals med lav effektivitet og lav sykdomsspesifisitet9. I dette papiret presenterer vi en ny 6-plexed elektrokjemiluminescens (ECL) analyse bygget på vår forrige multiplex ECL-analyseplattform ved hjelp av en multiple-Plex-plate, som kombinerer seks autoantistoffanalyser i en enkelt brønn, inkludert alle fire store IAbs til insulin (IAA), glutaminsyredekarboksylase-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) og sinktransport-8 (ZnT8A), autoantistoffer mot transglutaminase (TGA) for cøliaki, og SARS-CoV-2 reseptorbindende domene (RBD) antistoffer (COVID-19A). Dette er den første multipleksanalysen som rekrutterte et komplett panel på fire store IAb-er og videre kombinerte dette med TGA og COVID-19A. Det er validert og formelt akseptert som det primære screeningverktøyet som erstatter standard RBA i ASK-studien.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mM NaCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1070832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PI21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker A</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R93AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top 500 ml-Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974064A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAD65 protein</td>
			<td>Diamyd Medical</td>
			<td>10-65702-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IA-2 protein (aa 605-979)</td>
			<td>Creative BioMart</td>
			<td>283309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MESO QuickPlex SQ120</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R31QQ-3</td>
			<td>Electrochemiluminescence analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proinsulin protein</td>
			<td>AmideBio</td>
			<td>20160118B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer B</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0800019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 RBD protein</td>
			<td>Creative Biomart</td>
			<td>Spike-190V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0090019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-TAG</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tTG protein</td>
			<td>Diarect AG</td>
			<td>15201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Plex 6-Assay SECTOR plate</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Z00U0142E</td>
			<td>6-plex plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 1</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 10</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 2</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0020015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 3</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0030018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 8</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0080018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 9</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0090014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeBa Column</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89892</td>
			<td>Spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnT8 protein</td>
			<td>Research Laboratory</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19

En pågående klinisk studie, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), er den første screeningstudien i befolkningen for type 1 diabetes (T1D) og cøliaki i USA. Med koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) -pandemien er det presserende behov for epidemiologien til COVID-19 i befolkningen generelt og kunnskap om sammenhengen mellom COVID-19-infeksjon og T1D-utvikling. Den nåværende standard screeningmetoden for radiobindingsanalysen (RBA) har møtt to store utfordringer: lav effektivitet med et enkelt analyseformat og lav sykdomsspesifisitet med en stor andel lavaffinitetsantistoffer generert i screening. Med plattformen til multiplekselektrokjemiluminescensanalysen (ECL) vi etablerte tidligere, ble det utviklet en ny 6-Plex ECL-analyse som kombinerer, i en enkelt brønn, alle fire holme autoantistoffer (IAbs) til insulin, glutaminsyredekarboksylase (GAD65), insulinomantigen 2 (IA-2) og sinktransportør 8 (ZnT8) for T1D, transglutaminase autoantistoffer (TGA) for cøliaki og alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) reseptorbindende domene (RBD) antistoffer for COVID-19. Analysen ble validert i blinde ved hjelp av 880 prøver fra ASK-studien, inkludert 325 positive prøver og 555 alle antistoffnegative prøver, og sammenlignet med standard RBA og en enkelt ECL-analyse. Med fordelene med høy effektivitet, lave kostnader og lavt serumvolum har denne analysen blitt akseptert som det primære screeningverktøyet for ASK-studien.

Tabell 1, tabell 2 og tabell 3 illustrerer de representative resultatene. Rå CPS hentet fra lesemaskinen er illustrert i tabell 1. I tabell 2 ble rå CPS ordnet og sortert etter de seks linkerne og tilsvarende antistoffer. Tabell 3 viser de beregnede indeksverdiene med CPS som beskrevet i analyseprotokollen. Alle rå telleverdier bør kontrolleres for å unngå feil endelige indeksresultater forårsaket av dårlige duplikater. I tabell 1 er det gitt eksempler på dårlige duplikater, noe som resulterte i en feil i den endelige indeksberegningen i tabell 3.
Denne analysen ble validert på en blind måte ved hjelp av 880 utvalgte prøver fra ASK-studien med 325 IAbs positive prøver og 555 alle Abs negative prøver. Nivåene av autoantistoffer fra 6-Plex ECL-analyse for de 880 prøvene ble sammenlignet punkt for punkt med nivåene av tilsvarende enkelt-ECL-analyser (figur 2) og med tilsvarende enkeltstandard RBA (figur 3). Avskjæring, sensitivitet og spesifisitet for hvert antistoff er listet opp i tabell 4. Sensitiviteten og spesifisiteten til denne ECL-COVID-19A-analysen er identifisert som henholdsvis100 % og 99,9 %.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig01.jpg"> Figur 1: Illustrasjon av 6-plex ECL-analysen. Serumautoantistoffer gjør forbindelsen av Ru Sulfo-NHS-merket antigen til det biotinylerte antigenet, som er kombinert med en spesifikk linker og danner et kompleks av antigen-antistoff-antigen-linker. Kompleksene fanges gjennom hver spesifikke linker på de spesifikke stedene i 6-Plex-platen. For hvert antigen ble de spesifikke linkernumrene tildelt: GAD-linker-1, Covid-19-linker-2, IA-2-linker-3, tTG-linker-8, ZnT8-linker-9 og Proinslulin-linker-10. Dette tallet er endret med tillatelse fra He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig02.jpg"> Figur 2: Sammenligning av seks antistoffnivåer i 880 prøver fra ASK-studien mellom den enkle ECL-analysen og 6-plex ECL-analysen. Panelene viser sammenligninger av antistoffnivåer for henholdsvis GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA og COVID-19A (indeks for COVID-19A ble presentert som (100 x beregnet indeksverdi)). De stiplede linjene representerer analyseavskjæringene for hver antistoffanalyse. Dette tallet er endret med tillatelse fra He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig03.jpg"> Figur 3: Sammenligning av fem antistoffnivåer i 880 prøver fra ASK-studien mellom RBA og 6-Plex ECL-analysen. Panelene viser sammenligninger av antistoffnivåer for henholdsvis GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A og TGA. De stiplede linjene representerer analyseavskjæringene for hver antistoffanalyse. Dette tallet er endret med tillatelse fra He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Tabell 1: Rå CPS-antall (venstre halvdel av platen). Rå CPS-tellinger ervervet fra venstre halvdel av en analyseplate. Hver prøve utføres i duplikat. Hvert CPS-antall i samme kolonne (A1, A2, A3 osv.) representerer lesedataene fra de 10 stedene i samme brønn (tilsvarende koblingsnumre er merket). Eksempler på ugyldige duplikater er uthevet i grått, som vist i rad D-linker 3 kolonne 5 og kolonne 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%201.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 2: Arrangement av tabell 1-dataene, sortert med seks linkere. CPS-verdier fra tabell 1 ble omorganisert, gjennomsnittsverdier for duplikatavlesninger av CPS og sletting av ubrukte verdier for linkere 4-7. Verdiene for den interne standarden høy positiv, lav positiv og negativ kontroll av hver autoantistoffanalyse er merket med mørk fet skrift. PC, positiv kontroll. NC, negativ kontroll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%202.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 3: Resultater av indeksverdier. Indeksverdier for hver prøve for alle seks antistoffene ble beregnet mot de tilsvarende positive og negative kontrollene. En indeksverdi større enn grenseverdien ble definert som positiv, markert med mørk fet skrift. De dårlige dupliserte CPS-verdiene i tabell 1, rad D-linker 3-kolonne 5 og 6, førte til en positiv IA-2A-indeksverdi på utvalg 11 (uthevet i grått), som sannsynligvis var et falskt positivt resultat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table_3.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 4: Analyseavskjæring, sensitivitet og spesifisitet for GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA og TGA blant 880 ASK-prøver, inkludert 325 IAbs positive prøver og 555 alle antistoffer negative prøver. Den optimale grenseindeksverdien for GADA-, IA-2A-, ZnT8A-, IAA- og TGA-analysen ble satt til minst 99-prosentilen av de 555 normale kontrollprøvene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%204.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19 at JoVE.com

A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19

I tråd med det presserende behovet for screening for type 1 diabetes, cøliaki og koronavirussykdom 2019, utviklet vi en høy gjennomstrømning 6-Plex elektrokjemiluminescensanalyse for samtidig å oppdage alle fire øyautoantistoffer, vevstransglutaminaseautoantistoffer og antistoffer mot reseptorbindingsdomenet for alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2.

En multiplekset screening med høy gjennomstrømning for type 1 diabetes, cøliaki og COVID-19

An ongoing clinical trial, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), is the first screening study in the general population for type 1 diabetes (T1D) and ...

Den nye 6-Plex ECL-analysen er den første multipleksanalysen som er validert og nå brukt i klinisk studie for generell populasjonsscreening. Den kombinerer samtidig seks autoantistoffanalyser som er egnet for screening av type 1 diabetes, cøliaki og COVID-19 i en stor befolkning. Sammenlignet med dagens standard autoantistoffanalyse, kan denne teknikken mer effektivt skjerme flere autoantistoffer for flere autoimmune sykdommer samtidig.Implikasjonen av denne teknikken vil gjøre storskala screening mer gjennomførbar og sykdomsspesifikk, noe som fører til tidlig sykdomsprediksjon for forebygging og mer presis diagnose for terapi. Til å begynne med, tilsett fire mikroliter biotinylert GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 og proinsulinantigenprotein i et rør som inneholder 156 mikroliter 1% BSA og bland med 240 mikroliter tilsvarende streptavidin-konjugerte linkere, 1, 2, 3, 8, 9 og 10. Inkuber deretter blandingen i 30 minutter ved romtemperatur.Aliquot 160 mikroliter stoppløsning i hvert rør og inkuber blandingen ved romtemperatur i 30 minutter. Ta nå 400 mikroliter av blandingsløsningen fra hvert rør og kombiner dem sammen. Tilsett fire mikroliter rutheniummerket GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 og proinsulinantigen til blandingen.Deretter tilsettes 1,6 milliliter stoppløsning og 3,2 milliliter PBS. Bland alle komponentene grundig. Og nå er antigenløsningen klar til bruk i analysen.For en 96-brønns PCR-plate, aliquot syv mikroliter serum per brønn og dekk platen med en tetningsfilm. Forvarm deretter sera ved 56 grader Celsius i 30 minutter på en PCR-maskin og sentrifuger platen kort ved 100 ganger G i ett minutt. Tilsett 63 mikroliter tilberedt antigenoppløsning per brønn, bland med sea og dekk PCR-platen med tetningsfolie for å unngå lys.Rist platen på en shaker med en hastighet på 450 o / min i to timer ved romtemperatur. Og så, inkuber platen ved fire grader Celsius i 18 til 24 timer. Ta en 6-Plex-plate fra kjøleskapet på fire grader Celsius, slik at platen kommer til romtemperatur.Tilsett deretter 150 mikroliter 3% blokkering A til hver brønn på 6-plex-platen. Dekk platen med folie for å unngå lys. Sett platen tilbake i et fire grader Celsius kjøleskap og inkuber over natten.På slutten av inkubasjonen, når platen er fjernet fra kjøleskapet, fjern all bufferen fra platen. Klapp tallerkenen på papirhåndklærne for å tørke ut, og vask den tre ganger med 150 mikroliter vaskebuffer per brønn hver gang. Tørk platen på papirhåndkleet og aliquot 30 mikroliter serumantigen inkuberer fra hver brønn i den inkuberende PCR-platen over natten i to brønner på 6-Plex-platen.Dekk platen med folie, legg deretter platen på en plateshaker og rist med en hastighet på 450 o / min ved romtemperatur i en time. Dump løsningen i 6-Plex-platen og vask platen tre ganger med 150 mikroliter 0,4 M natriumkloridvaskebuffer per brønn. Etter at den tredje vasken er fullført, tørk platen mot papirhåndkleet og tilsett 150 mikroliter lesebuffer i hver brønn.Nivåene av seks autoantistoffer for GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA og COVID-19A fra 6-Plex ECL-analysen var godt korrelert med deres tilsvarende seks enkelt ECL-analyse, og den nåværende standard radiobindende analysen. Indeksverdier for hver prøve for alle seks antistoffene ble beregnet mot de tilsvarende positive og negative kontrollene. En indeksverdi større enn grenseverdien ble observert, noe som indikerte et positivt resultat.Autoantistoffer i serum brøt det rutheniummerkede antigenet til det biotinylerte antigenet, og dannet et kompleks med en spesifikk linker for å bygge en multipleksingsplattform. Denne taktikken gjør storskala screening mer gjennomførbar og mer effektiv i befolkningen for type en diabetes og samtidige sykdommer, noe som fører til tidlig prediksjon og forebygging av sykdommene.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Akselerert Type 1 Diabetes Induksjon i Mus ved Adoptive Overføring av diabetogenic CD4 + T celler

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fenotypisk analyse for kvantifisering av intracellulær mykobakterier tilpasset høygjennomstrømning / screening av høyt innhold

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Høy gjennomstrømming Screening for Bredspektret Chemical hemmere av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Etablering av en High-throughput Oppsett for screening små molekyler som modulerer c-di-GMP signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

En fluorescens-basert lymfocyttkontroll analyse Egnet for høy gjennomstrømming screening av små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Cell-free biokjemiske Fluorometric enzymatisk analysen for høy gjennomstrømming-måling av Lipid Peroxidation in høy tetthet Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

En høy gjennomstrømming grobunn-Lox aktivert Viral membran Fusion analysen for å identifisere hemmere av HIV-1 Viral membran Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høy gjennomstrømming plattform for Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høy gjennomstrømming Shigella-spesifikke bakteriedrepende analysen

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

En avansert murine modell for alkoholfrie steatohepatitis i samarbeid med type 2 diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...