Name: a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19
Uploaded: 2022-07-05T13:00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19 at JoVE.com

O estudo foi apoiado pela concessão JDRF 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, NIH grant DK32083 e Diabetes Research Center (DRC) grant P30 DK116073.

O protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Colorado Multiple Institutional Review Board.
1. Preparação do buffer
<ol><li>Prepare o tampão de marcação (2x PBS, pH 7,9): Adicione 100 mL de PBS 10x a 400 mL de água destilada e ajuste o pH usando NaOH para 7,9.</li>
	<li>Fazer 3 mM de biotina e Ru Sulfo-NHS: Dissolver 1 mg de biotina em 588 μL de tampão de marcação e dissolver 150 nmol de Ru Sulfo-NHS em 50 μL de tampão de rotulagem.</li>
	<li>Preparar o tampão antigénio (1% BSA): Dissolver 5 g de albumina sérica bovina (BSA) em 500 ml de 1x PBS.</li>
	<li>Preparar o tampão de revestimento (Bloqueador A a 3%): Dissolva 15 g de Bloqueador A em 500 mL de 1x PBS.</li>
	<li>Preparar o primeiro tampão de lavagem (0,05 % Tween 20, PBST): Misture 2,5 mL de Tween 20 em 5.000 mL de 1x PBS.</li>
	<li>Preparar o segundo tampão de lavagem (0,4 M NaCl): Misture 50 mL de 5 M NaCl em 575 mL de água destilada para fazer a solução de NaCl 0,4 M. NOTA: Para uma rotulagem eficiente, use sempre soluções de biotina e Ru Sulfo-NHS preparadas na hora e não as armazenadas feitas anteriormente.</li>
</ol>2. Marcação de proteínas antigênicas com biotina e Ru Sulfo-NHS separadamente
NOTA: Recomenda-se uma maior concentração de proteína antigénica ≥0,5 mg/ml para uma maior eficiência de marcação.
<ol><li>Prepare seis soluções proteicas de antígeno direcionadas, incluindo proinsulina, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG e domínio de ligação ao receptor (RBD) da proteína spike do SARS-CoV-2. Calcular os moles de cada proteína antigénica de acordo com o seu peso molecular e fazer proporções molares adequadas de biotina ou Ru Sulfo-NHS. A proporção de antígeno para a soma de biotina ou Ru Sulfo-NHS será de 1:5 para antígenos moleculares pequenos (peso molecular ≤10 kd), como a proteína proinsulina. Para antígenos moleculares médios (peso molecular 10-50 kd), como ZnT8, a proporção se ajustará para 1:10. Para antígenos de grande peso molecular (peso molecular >50 kd), como o TAG, a razão molar será de 1:20.</li>
	<li>Divida a proteína do antígeno em duas partes iguais e misture-a separadamente com biotina e Ru Sulfo-NHS usando a razão molar calculada na etapa 2.1. Incubar a mistura à temperatura ambiente (RT) durante 1,5 h, evitando a luz. NOTA: Todos os produtos químicos redutores, como o Tris ou a glicina, no tampão da proteína do antígeno, precisam ser removidos por uma coluna de spin de dimensionamento preparada com um tampão de 2x PBS (pH 7,9).</li>
	<li>Prepare as colunas de spin com 2x PBS (o tamanho da coluna de spin, 2 mL ou 5 mL, depende do volume da proteína do antígeno de marcação): Adicione 1 ml de tampão PBS 2x à coluna de spin, centrifuga-a a 1.000 x g por 2 minutos e repita a etapa 2x mais.</li>
	<li>Deixe a mistura antígeno proteína-biotina ou -Ru Sulfo-NHS passar pela coluna de spin preparada 1x (centrifugar a coluna a 1.000 x g por 2 min) para purificação e parar a reação de rotulagem.</li>
	<li>Medir o volume final da proteína do antígeno marcada eluída das colunas de spin, calculando as concentrações de proteína do antígeno marcada com biotina ou Ru Sulfo-NHS. Faça alíquotas menores de proteína de antígeno marcada (50 μL/tubo) e armazene-as a -80 °C para uso a longo prazo. NOTA: A cobertura de proteína após cada coluna de spin será uma taxa de retenção aproximada de 90% a 95%.</li>
</ol>3. Definir a melhor concentração e proporções para antígenos marcados com biotina e Ru Sulfo-NHS para o ensaio de ECL de 6-Plex (ensaio quadriculado)
NOTA: O ensaio quadriculado para cada antígeno é necessário antes da integração no ensaio multiplexado.
<ol><li>Aplicar o ensaio quadriculado para cada antigénio separadamente. NOTA: Passos 3.2.-3.7. usará a TGA como um breve exemplo. O processo de ensaio quadriculado TGA é simular o processo de ensaio, mas com apenas um tipo de antígeno.</li>
	<li>Fazer a diluição em série do tTG biotinilado e do tTG marcado com Ru Sulfo-NHS. As concentrações de trabalho recomendadas da primeira solução de mistura começam a partir de 240 ng/mL para tTG biotinilado e marcado com Ru Sulfo-NHS. Suponha que as concentrações de tTG original biotinilado e marcado com Ru Sulfo-NHS sejam de 1,0 μg/μL. Faça uma diluição de 10x do tTG original marcado com Ru Sulfo-NHS e uma diluição de 5x do tTG biotinilado original com 5% de BSA.</li>
	<li>Misturar 4 μL de proteína tTG biotinilada com 156 μL de BSA a 5% (tampão antigénio) e 240 μL do ligante conjugado com estreptavidina num tubo e incubar a solução em RT durante 30 min. Em seguida, adicione 160 μL de solução de parada e incube em RT por mais 30 min. Tomar 400 μL da mistura e misturar com 2 ml de solução de paragem. A concentração do tTG biotinilado na mistura é de 240 ng/mL.</li>
	<li>Para fazer uma diluição em série para o antígeno ZnT8 marcado com biotina, prepare outros cinco novos tubos, pegue 1 mL de uma alíquota da mistura na etapa 3.3. e misturar com 1 mL de solução stop em um novo tubo e obter a mistura com uma concentração de 120 ng/mL. Repita esta etapa, faça diluições seriadas de 1:1 e obtenha o tTG marcado com biotina a 60 ng/mL, 30 ng/mL, 15 ng/mL e 7,5 ng/mL.</li>
	<li>Adicione 4 μL de tTG marcado com Ru Sulfo-NHS com 1,6 mL de solução stop e obtenha uma mistura de tTG marcado com Ru Sulfo-NHS a uma concentração de 240 ng/mL. Com as mesmas etapas de 3.4., faça diluições seriadas de 1:1 e obtenha o antígeno ZnT8 marcado com Ru Sulfo-NHS a 60 ng/mL, 30 ng/mL, 15 ng/mL, 7,5 ng/mL e 3,75 ng/mL. A última concentração é de 0 ng/mL, com apenas solução de parada e sem antígeno marcado com Ru Sulfo-NHS.</li>
	<li>Preparar amostras de soro tTG de controle positivo e controle negativo (pré-qualificadas e padronizadas por um único ensaio de tTG de ECL) e uma placa de PCR de 96 poços. Aliquotar as amostras de soro controle positivo e negativo para a metade esquerda e a metade direita da placa, respectivamente, com 7 μL em cada poço. Adicione 1x PBS à placa, com 33 μL por poço.</li>
	<li>Na metade esquerda da placa de PCR, adicionar 24 μL da solução de ligador tTG diluída em série marcada com biotina a cada alvéolo, uma coluna com uma concentração por ordem da mais alta para a mais baixa. Da mesma forma, adicione 16 μL do antígeno tTG tTG diluído em série e diluído em série a cada poço, uma linha com uma concentração e, em seguida, misture completamente. Repita o passo na metade direita da placa de PCR.</li>
	<li>Continue o restante das etapas de ensaio descritas nas etapas 5.3.-9.1. até que os dados brutos de contagem sejam obtidos.</li>
	<li>Calcule as proporções de sinais de controle positivos para sinais de controle negativos correspondentes. Determinar a melhor concentração para o antígeno marcado com biotina e o antígeno marcado com Ru Sulfo-NHS com valores de razão mais altos e menor fundo para a amostra de controle negativo. As concentrações ideais de trabalho de biotina e proteína do antígeno marcada com Ru Sulfo-NHS são mostradas abaixo: 16,0 ng/mL e 8,0 ng/mL para GAD65, 18,8 ng/mL e 9,4 ng/mL para SARS-CoV-2 RBD, 42,0 ng/mL e 42,0 ng/mL para IA-2, 60,0 ng/mL e 60,0 ng/mL para tTG, 4,2 ng/mL e 4,2 ng/mL para ZnT8, e 31,3 ng/mL e 31,3 ng/mL para proinsulina.</li>
</ol>4. Criar solução de antígeno acoplado ao ligador
<ol><li>Diluir os antígenos marcados com biotina e Ru Sulfo-NHS com 5% de BSA para as concentrações ideais de trabalho de acordo com a etapa 3.9.</li>
	<li>Ligar ligadores pré-selecionados a cada proteína de antígeno biotinilado. Para um ensaio de placa de 96 poços, adicionar 4 μL de proteína de antígeno biotinilado GAD65, SARS-CoV-2, IA-2, tTG, ZnT8 e proteína do antígeno proinsulina em um tubo separado contendo 156 μL de 1% de BSA e misturar com 240 μL dos correspondentes ligantes conjugados com estreptavidina 1, 2, 3, 8, 9 e 10 (Figura 1). Incubar a mistura por 30 min no RT.</li>
	<li>Aliquot 160 μL de solução de paragem em cada tubo e incubar a mistura a RT durante 30 min. Retire 400 μL da solução de mistura de cada tubo e combine-os.</li>
	<li>Adicione 4 μL de Ru Sulfo-NHS marcados com GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 e antígeno proinsulina à mistura acima e, em seguida, adicione 1,6 mL de solução stop e 3,2 mL de 1x PBS e misture. Agora a solução de antígeno está pronta para uso no ensaio.</li>
</ol>5. Incubar amostras de soro com o antigénio marcado
<ol><li>Aliquota 7 μL de soro por poço para uma placa de PCR de 96 poços e tampa com filme de vedação. Pré-aqueça os soros a 56 °C durante 30 minutos numa máquina de PCR. Centrifugar brevemente a placa a 100 x g durante 1 min.</li>
	<li>Adicionar 63 μL de solução antigénica (preparada na fase 4.4) por alvéolo e misturar com os soros. Cubra a placa de PCR com folha de vedação para evitar a luz.</li>
	<li>Agitar a placa num agitador a 450 rpm a RT durante 2 h e, em seguida, incubar a placa a 4 °C durante 18-24 h.</li>
</ol>6. Prepare a placa 6-Plex
<ol><li>Pegue uma placa de 6-Plex da geladeira de 4 °C, permitindo que a placa chegue ao RT. Adicione 150 μL de 3% de Bloqueador A a cada poço da placa de 6-Plex.</li>
	<li>Coloque a placa de volta no frigorífico a 4 °C, cubra a placa com papel alumínio evitando a luz e incube durante a noite. NOTA: As etapas do ensaio no Dia 1 incluem as seções 4.-6.</li>
</ol>7. Transferir soro/antígeno incuba para a placa 6-Plex
<ol><li>No dia seguinte, retire a placa 6-Plex de incubação da geladeira e despeje todo o tampão da placa. Coloque o prato em toalhas de papel para secar.</li>
	<li>Lave a placa de 6-Plex 3x com 150 μL de tampão de lavagem por poço de cada vez. Seque a placa em toalhas de papel e o soro/antígeno alíquota incuba de cada poço da placa de PCR de incubação durante a noite em dois poços da placa 6-Plex (30 μL por poço para duplicatas).</li>
	<li>Cubra a placa com papel alumínio, depois coloque a placa em um agitador de placas e agite com uma velocidade de 450 rpm a RT por 1 h.</li>
</ol>8. Lave a placa 6-Plex e adicione o tampão de leitura
<ol><li>Despeje a solução na placa 6-Plex e lave a placa 3x com 150 μL de tampão de lavagem NaCl 0,4 M por poço de cada vez.</li>
	<li>Após a conclusão da terceira lavagem, seque o prato contra o papel toalha e adicione 150 μL de tampão de leitura em cada poço. NOTA: As bolhas de ar no poço afetam a precisão da máquina leitora de placas e devem ser evitadas a todo custo.</li>
</ol>9. Leia a placa e analise os dados
<ol><li>Conte a placa em um analisador de eletroquimioluminescência. Os resultados da leitura serão apresentados com os valores em contagens por segundo (CPS). Calcular o índice relativo de anticorpos de cada amostra usando o CPS bruto obtido da máquina de leitura contra o CPS dos controles positivos e negativos do padrão interno de cada anticorpo específico (Valor do índice = [CPS (amostra) - CPS (padrão negativo)] / [CPS (padrão positivo) - CPS (padrão negativo)]).</li>
	<li>Determine os resultados negativos ou positivos de anticorpos usando os valores de corte que foram estabelecidosnos percentis 99,5a 99,8 de 555 amostras de controle negativas do estudo ASK (todas as amostras negativas de anticorpos sem história ou história familiar de diabetes ou qualquer outro tipo de doença autoimune). NOTA: As etapas do ensaio no Dia 2 incluem as seções 7-9.</li>
</ol>

<ol>
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(159), e61160 (2020).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A intervenção para DM1 entrou na era pré-DM1, com programas de rastreamento em larga escala nacionais e internacionais em andamento para DM1 e ensaios clínicos em expansão sendo aplicados no estágio 1 do DM1 para revogar ou retardar a progressão para DM1 clínica12,13. Medições de quatro IAbs usando o RBA padrão atual com um único formato de ensaio IAb são trabalhosas e ineficientes para um programa de triagem em massa. Com a demanda urgente por um ensaio IAbs multiplexado de alto rendimento, o ensaio de ECL multiplexado, o ELISA ICA de 3 telas e a detecção de anticorpos por PCR de aglutinação (ADAP) emergiram como tecnologias atualmente competitivas. No estudo Fr1da de rastreamento para DM1 em uma população de crianças pequenas na Alemanha, o ELISA ICA de 3 telas combinando 3 IAbs (GADA, IA-2A e ZnT8A) foi usado como teste principal14. Uma grande limitação do ELISA ICA de 3 telas é a falta de AIA, que é principalmente o primeiro IAb a aparecer com alta prevalência em crianças pequenas com DM1. Além disso, o ensaio não é capaz de distinguir qual dos três IAbs é positivo de um sinal positivo, e cada amostra positiva precisa ser repetida com três ensaios únicos para confirmação. O ADAP15 combina GADA, IA-2A e IAA e ilustrou alta sensibilidade e especificidade do ensaio no workshop do IASP, mas carece de dados sobre o quão preditivo é na triagem de base populacional para estudos de DM1, que o workshop do IASP não é capaz de determinar. O ensaio de ECL multiplex no presente estudo é construído sobre a plataforma de um único ensaio de ECL que foi validado em relação ao RBA padrão atual em vários ensaios clínicos como TrailNet9,16, DAISY17,18,19 e o ASK 4,20,21 estudar. O presente ensaio foi validado contra o ensaio de RBA e ECL único usando 880 amostras de soro de participantes do estudo ASK. Como mostrado na Figura 2 e na Figura 3, os níveis de anticorpos entre 6-Plex e ECL única ou entre 6-Plex e RBA foram em sua maioria congruentes entre si para a positividade dos anticorpos. As taxas de coincidência de IAbs testadas por RBA e 6-Plex foram de 91,7%-97,8%, e as taxas de coincidência de IAbs testadas por ECL único e 6-Plex foram de 95,3%-99,2%. A discordância entre o ensaio de ECL e a RBA foi principalmente daqueles com IAb único. Os níveis de IAbs testados por 6-Plex e ECL único (r = 0,6431-0,9434, todos p < 0,0001) e 6-Plex e RBA (r = 0,5775-0,8576, todos p < 0,0001) também foram bem correlacionados. As TGA testadas pelo ensaio 6-Plex foram altamente correlacionadas com os resultados tanto da RBA (99,4%) quanto do ensaio de ECL único (99,4%). Além disso, o COVID-19A testado pela 6-Plex atingiu 99,8% de conformidade com os resultados do ensaio único de ECL.
Como resultado, o ensaio de ECL 6-Plex foi formalmente aceito como o principal método de triagem para o estudo ASK em andamento e substituiu o RBApadrão 22. Este ensaio demonstrou sua excelente sensibilidade e especificidade com maior rendimento, menor custo e menor volume de soro em comparação com a RBA padrão.
Foi documentado que, no estudo de triagem de DM1, IAb único detectado por RBA, que ocupou uma grande proporção de positividades de IAb, foram de baixa afinidade, com baixo risco de doença e resultaram em baixo valor preditivo geral 19,21,23,24,25,26. Essa predição de baixo risco causou enormes custos extras de visitas de acompanhamento e resultou em dificuldades para estudos preventivos de DM1. A plataforma de ensaio de ECL estabelecida foi demonstrada em vários ensaios clínicos para discriminar IAbs de alta afinidade de IAbs de baixa afinidade gerados por RBA e melhorar significativamente os valores preditivos para todos os quatro IAbs, especialmente com positividade única IAb16,17,18,21 . A tecnologia de ensaio de ECL multiplex foi construída sobre a plataforma do ensaio de ECL único, com essa vantagem distinta da detecção de abdominais de alta afinidade. No presente estudo, o ensaio de ECL 6-Plex ilustrou sua semelhança com os ensaios de ECL único correspondentes em sensibilidade e especificidade.
Algumas limitações e as preocupações técnicas do ensaio multiplex ECL utilizando múltiplas placas Plex já foram abordadas em publicações anteriores27,28. Com seis antígenos marcados em um poço, pode haver algumas influências entre diferentes antígenos, e o fundo do ensaio pode aumentar ao adicionar cada ensaio de anticorpos para multiplexação no mesmo poço. Uma grande quantidade de trabalho de otimização do ensaio é necessária para ajustar as condições do ensaio, especialmente para ajustar as concentrações finais de cada proteína do antígeno rotulada com base no ensaio quadriculado para cada antígeno, para manter a sensibilidade e a especificidade para cada ensaio de anticorpos. Como mencionado em estudos anteriores27,28, um pequeno número de amostras (<1%) resulta em falsa positividade na placa múltipla de Plex sem uma razão subjacente clara. Todos os resultados positivos devem ser repetidos e confirmados por um único ensaio de ECL como garantia de qualidade laboratorial de rotina; normalmente, os falsos positivos serão removidos. Resultados falso-negativos causados pelo "efeito prozona" observado no ensaio prévio de 7-Plex ECL27,28 não foram observados no presente estudo. No ensaio aqui descrito, retirou-se a etapa do tratamento ácido das amostras de soro do protocolo anterior; em vez disso, pré-aquecemos as amostras de soro a 56 °C por 30 min (etapa 5.1.). No segundo dia de lavagem da placa, usamos um tampão de lavagem contendo NaCl 0,4 M (etapa 8.1.) em vez de um tampão de lavagem regular para lavar a placa de forma mais rigorosa. Essas modificações tornaram o ensaio ECL multiplex mais simples e com fundo mais baixo, sem perder a sensibilidade do ensaio.
Em conclusão, este ensaio tem um excelente desempenho para detectar quatro IAbs, TGA e COVID-19A simultaneamente. O recurso de multiplexação, bem como o alto rendimento, o baixo custo e a pequena necessidade de volume sérico, tornam a triagem em larga escala para DM1 e doenças concomitantes muito mais viável na população em geral. Pacientes com DM1 ou qualquer doença autoimune têm um risco muito maior de outras doenças autoimunes. O ensaio de ECL multiplex fornece uma excelente plataforma para rastrear DM1 e múltiplas doenças autoimunes simultaneamente.

Grandes estudos epidemiológicos em todo o mundo demonstram que a incidência de diabetes tipo 1 (DM1) vem aumentando rapidamente em 3%-5% ao ano, e a prevalência de DM1 tem dobrado nos últimos 20 anos, especialmente em crianças pequenas 1,2. Os autoanticorpos das ilhotas (IAbs) geralmente aparecem anos antes dos sintomas clínicos e são atualmente os biomarcadores preditivos e diagnósticos mais confiáveis para DM13. A triagem para autoanticorpos DM1 pode identificar pessoas em risco de progredir para DM1 clínica, educar o público, reduzir em grande parte a complicação com risco de vida da cetoacidose e beneficiar ensaios clínicos para terapias de prevenção. Esforços mundiais de prevenção para DM1 estão em andamento e vários ensaios intervencionistas estão sendo realizados entre indivíduos com IAbs positivo para retardar a progressão para DM1 clínica, e o Barbara Davis Center for Diabetes lançou o primeiro ensaio clínico dos EUA de triagem na população em geral em 2016 para DM1 e doença celíaca, Autoimmunity Screening for the Kids (ASK)4 . A doença celíaca (DC) é uma doença inflamatória intestinal crônica relacionada a fatores imunológicos e genéticos. A prevalência de DC em crianças com DM1 pode chegar a até 24,5%5. Mais da metade dos indivíduos com DC pode não apresentar sintomas típicos na apresentação6, portanto, o rastreamento sorológico para doença celíaca é bastante necessário.
Desde o início da pandemia da doença por coronavírus 2019 (COVID-19), mais de 200 milhões de casos foram relatados globalmente, e as crianças representam até 16% dos casos confirmados laboratorialmente7. Muitos estudos demonstraram o impacto do DM1 existente na gravidade e letalidade da infecção por COVID-198, enquanto o impacto da infecção por COVID-19 no desenvolvimento de DM1 não é claro. A investigação da taxa total de infecção por COVID-19 na população em geral pela determinação de anticorpos contra o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-COV-2) e o estudo da associação entre a infecção por COVID-19 e o desencadeamento da autoimunidade por DM1 ou a aceleração da progressão do DM1 são urgentemente necessários e muito importantes, enquanto o estudo ASK em andamento é uma excelente plataforma para isso. Devido ao formato de ensaio único e à geração de uma grande proporção de positividade de anticorpos de baixa afinidade, o ensaio padrão de radioligação (RBA) encontrou um gargalo de baixa eficiência e baixa especificidade da doença9. No presente artigo, apresentamos um novo ensaio de eletroquimioluminescência (ECL) de 6 plexos construído em nossa plataforma de ensaio de ECL multiplex anterior usando uma placa multiple-Plex, combinando seis ensaios de autoanticorpos em um único poço, incluindo todos os quatro principais IAbs para insulina (IAA), ácido glutâmico descarboxilase-65 (GADA), antígeno de insulinoma-2 (IA-2A) e transporte de zinco-8 (ZnT8A), autoanticorpos para transglutaminase (TGA) para doença celíaca, e anticorpos do domínio de ligação ao receptor (RBD) do SARS-CoV-2 (COVID-19A). Este é o primeiro ensaio multiplex que recrutou um painel completo de quatro grandes IAbs e combinou isso com TGA e COVID-19A. Foi validado e formalmente aceito como a principal ferramenta de triagem substituindo a RBA padrão no estudo ASK.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mM NaCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1070832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PI21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker A</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R93AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top 500 ml-Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974064A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAD65 protein</td>
			<td>Diamyd Medical</td>
			<td>10-65702-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IA-2 protein (aa 605-979)</td>
			<td>Creative BioMart</td>
			<td>283309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MESO QuickPlex SQ120</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R31QQ-3</td>
			<td>Electrochemiluminescence analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proinsulin protein</td>
			<td>AmideBio</td>
			<td>20160118B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer B</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0800019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 RBD protein</td>
			<td>Creative Biomart</td>
			<td>Spike-190V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0090019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-TAG</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tTG protein</td>
			<td>Diarect AG</td>
			<td>15201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Plex 6-Assay SECTOR plate</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Z00U0142E</td>
			<td>6-plex plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 1</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 10</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 2</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0020015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 3</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0030018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 8</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0080018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 9</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0090014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeBa Column</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89892</td>
			<td>Spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnT8 protein</td>
			<td>Research Laboratory</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19

Um ensaio clínico em andamento, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), é o primeiro estudo de triagem na população em geral para diabetes tipo 1 (DM1) e doença celíaca nos Estados Unidos. Com a pandemia da doença do coronavírus 2019 (COVID-19), a epidemiologia da COVID-19 na população em geral e o conhecimento sobre a associação entre a infecção por COVID-19 e o desenvolvimento de DM1 são urgentemente necessários. O método de triagem atualmente padrão do ensaio de radioligação (RBA) enfrentou dois grandes desafios: baixa eficiência com um único formato de ensaio e baixa especificidade da doença com uma grande proporção de anticorpos de baixa afinidade gerados na triagem. Com a plataforma do ensaio de eletroquimioluminescência multiplex (ECL) que estabelecemos anteriormente, foi desenvolvido um novo ensaio de ECL 6-Plex que combina, em um único poço, todos os quatro autoanticorpos de ilhotas (IAbs) para insulina, ácido glutâmico descarboxilase (GAD65), antígeno de insulinoma 2 (IA-2) e transportador de zinco 8 (ZnT8) para DM1, autoanticorpos transglutaminase (TGA) para doença celíaca e anticorpos de domínio de ligação ao receptor (RBD) do coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2) para anticorpos de domínio de ligação ao receptor (RBD) para DM1, autoanticorpos transglutaminase (TGA) para doença celíaca e síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) anticorpos de domínio de ligação ao receptor (RBD) para COVID-19. O ensaio foi validado em cegos usando 880 amostras do estudo ASK, incluindo 325 amostras positivas e 555 todas as amostras negativas para anticorpos, e comparado com os RBAs padrão e um único ensaio ECL. Com as vantagens de alta eficiência, baixo custo e baixo volume sérico, este ensaio foi aceito como a principal ferramenta de triagem para o estudo ASK.

A Tabela 1, a Tabela 2 e a Tabela 3 ilustram os resultados representativos. Os CPS brutos obtidos da máquina de leitura estão ilustrados na Tabela 1. Na Tabela 2, a CPS bruta foi disposta e classificada pelos seis ligadores e anticorpos correspondentes. A Tabela 3 mostra os valores do índice calculado com CPS conforme descrito no protocolo de ensaio. Todos os valores brutos de contagem devem ser verificados para evitar resultados de índice finais errados causados por duplicatas incorretas. Na Tabela 1, são apresentados exemplos de duplicatas incorretas, o que resultou em um erro para o cálculo do índice final na Tabela 3.
Este ensaio foi validado de forma cega utilizando 880 amostras selecionadas do estudo ASK com 325 amostras positivas para IAbs e 555 amostras para todas as amostras para Abs negativas. Os níveis de autoanticorpos do ensaio de ECL 6-Plex para as 880 amostras foram comparados ponto a ponto com os níveis dos ensaios de ECL único correspondentes (Figura 2) e com o RBA padrão único correspondente (Figura 3). O ponto de corte, a sensibilidade e a especificidade de cada anticorpo estão listados na Tabela 4. A sensibilidade e a especificidade deste ensaio ECL-COVID-19A foram identificadas como 100% e 99,9%, respectivamente10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig01.jpg"> Figura 1: Ilustração do ensaio ECL 6-Plex. Os autoanticorpos séricos fazem a conexão do antígeno marcado com Ru Sulfo-NHS com o antígeno biotinilado, que é acoplado a um ligador específico e forma um complexo de antígeno-anticorpo-antígeno-ligador. Os complexos são capturados através de cada ligador específico para os pontos específicos na placa 6-Plex. Para cada antígeno, os números específicos do ligador foram atribuídos: GAD-linker-1, Covid-19-linker-2, IA-2-linker-3, tTG-linker-8, ZnT8-linker-9 e Proinslulin-linker-10. Essa figura foi modificada com a permissão de He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig02.jpg"> Figura 2: Comparação de seis níveis de anticorpos em 880 amostras do estudo ASK entre o ensaio de ECL único e o ensaio de ECL de 6-Plex. Os painéis exibem comparações dos níveis de anticorpos para GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA e COVID-19A, respectivamente (o índice de COVID-19A foi apresentado como (100 x valor do índice calculado)). As linhas pontilhadas representam os pontos de corte do ensaio para cada ensaio de anticorpos. Essa figura foi modificada com a permissão de He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig03.jpg"> Figura 3: Comparação de cinco níveis de anticorpos em 880 amostras do estudo ASK entre o ensaio RBA e o ensaio ECL 6-Plex. Os painéis exibem comparações dos níveis de anticorpos para GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A e TGA, respectivamente. As linhas pontilhadas representam os pontos de corte do ensaio para cada ensaio de anticorpos. Essa figura foi modificada com a permissão de He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Contagens brutas de CPS (metade esquerda da placa). Contagens brutas de CPS adquiridas da metade esquerda de uma placa de ensaio. Cada amostra é executada em duplicata. Cada contagem de CPS dentro da mesma coluna (A1, A2, A3, etc.) representa os dados de leitura dos 10 pontos no mesmo poço (os números correspondentes do vinculador são marcados). Exemplos de duplicatas incorretas são destacados em cinza, como visto na linha D-linker 3 coluna 5 e coluna 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%201.zip" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 2: Disposição dos dados da Tabela 1, classificados com seis vinculadores. Os valores de CPS da Tabela 1 foram reorganizados, calculando-se os valores médios para leituras duplicadas de CPS e excluindo-se os valores não utilizados para os vinculadores 4-7. Os valores do padrão interno de controles altos positivos, baixos positivos e negativos de cada ensaio de autoanticorpos são marcados em negrito escuro. PC, controle positivo. NC, controle negativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%202.zip" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 3: Resultados dos valores do índice. Os valores do índice para cada amostra para todos os seis anticorpos foram calculados em relação aos controles positivos e negativos correspondentes. Um valor de índice maior que o valor de corte foi definido como positivo, marcado em negrito escuro. Os valores de CPS duplicados inválidos na Tabela 1, linha D-linker 3-colunas 5 e 6, levaram a um valor positivo do índice IA-2A da amostra 11 (destacado em cinza), o que provavelmente foi um resultado falso-positivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table_3.xlsx" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 4: Ponto de corte, sensibilidade e especificidade do ensaio para GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA e TGA entre 880 amostras ASK, incluindo 325 amostras positivas para IAbs e 555 amostras negativas para anticorpos. O valor ótimo do índice de corte do ensaio GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA e TGA foi ajustado para pelo menos o percentil 99 das 555 amostras de controle normais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%204.zip" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

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A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19

Em linha com a necessidade urgente de triagem para diabetes tipo 1, doença celíaca e doença por coronavírus 2019, desenvolvemos um ensaio de eletroquimioluminescência 6-Plex de alto rendimento para detectar simultaneamente todos os quatro autoanticorpos de ilhotas, autoanticorpos de transglutaminase tecidual e anticorpos para o domínio de ligação ao receptor do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave.

Uma triagem multiplexada de alto rendimento para diabetes tipo 1, doenças celíacas e COVID-19

An ongoing clinical trial, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), is the first screening study in the general population for type 1 diabetes (T1D) and ...

O novo ensaio ECL 6-Plex é o primeiro ensaio multiplex validado e agora aplicado em ensaios clínicos para triagem da população em geral. Ele combina simultaneamente seis ensaios de autoanticorpos adequados para a triagem de diabetes tipo 1, doença celíaca e COVID-19 em uma grande população. Em comparação com o atual ensaio padrão de autoanticorpos, essa técnica pode rastrear de forma mais eficiente vários autoanticorpos para múltiplas doenças autoimunes simultaneamente.A implicação dessa técnica tornará o rastreamento em larga escala mais viável e específico da doença, levando à predição precoce da doença para prevenção e diagnóstico mais preciso para a terapia. Para começar, adicione quatro microlitros de proteína de antígeno biotinilado GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 e proinsulina em um tubo contendo 156 microlitros de 1% de BSA e misture com 240 microlitros de ligantes conjugados com treptavidina correspondentes, 1, 2, 3, 8, 9 e 10. Em seguida, incubar a mistura por 30 minutos à temperatura ambiente.Aliquot 160 microlitros de solução de parada em cada tubo e incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos. Agora, pegue 400 microlitros da solução de mistura de cada tubo e combine-os. Adicione quatro microlitros de GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 e antígeno proinsulina marcados com rutênio à mistura.Em seguida, adicione 1,6 mililitros de solução de parada e 3,2 mililitros de PBS. Misture bem todos os componentes. E agora, a solução de antígeno está pronta para uso no ensaio.Para uma placa de PCR de 96 poços, alíquota de sete microlitros de soro por poço e cubra a placa com um filme de vedação. Em seguida, pré-aqueça os soros a 56 graus Celsius por 30 minutos em uma máquina de PCR e centrifugar brevemente a placa a 100 vezes G por um minuto. Adicione 63 microlitros de solução de antígeno preparada por poço, misture com os soros e cubra a placa de PCR com folha de vedação para evitar a luz.Agite a placa num agitador a uma velocidade de 450 rpm durante duas horas à temperatura ambiente. E então, incube a placa a quatro graus Celsius por 18 a 24 horas. Pegue uma placa de 6 Plex da geladeira de quatro graus Celsius, permitindo que a placa atinja a temperatura ambiente.Em seguida, adicione 150 microlitros de 3%Blocker A a cada poço da placa 6-Plex. Cubra a placa com papel alumínio para evitar a luz. Coloque a placa de volta em uma geladeira de quatro graus Celsius e incube durante a noite.No final da incubação, uma vez que a placa é removida da geladeira, remova todo o tampão da placa. Coloque o prato nas toalhas de papel para secar e lave-o três vezes com 150 microlitros de tampão de lavagem por poço de cada vez. Seque a placa na toalha de papel e alíquota 30 microlitros de antígeno sérico incubar de cada poço da placa de PCR de incubação durante a noite em dois poços da placa de 6-Plex.Cubra a placa com papel alumínio, depois coloque a placa num agitador de placas e agite com uma velocidade de 450 rpm à temperatura ambiente durante uma hora. Despeje a solução presente na placa 6-Plex e lave a placa três vezes com 150 microlitros de tampão de lavagem de cloreto de sódio 0,4 M por poço. Após a conclusão da terceira lavagem, seque o prato contra o papel toalha e adicione 150 microlitros de tampão de leitura em cada poço.Os níveis de seis autoanticorpos para GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA e COVID-19A do ensaio de ECL 6-Plex foram bem correlacionados com seus seis ensaios de ECL únicos correspondentes e o ensaio padrão de ligação por rádio atual. Os valores do índice para cada amostra para todos os seis anticorpos foram calculados em relação aos controles positivos e negativos correspondentes. Observou-se um valor de índice maior que o valor de corte, o que indicou um resultado positivo.Os autoanticorpos no soro romperam o antígeno marcado com rutênio para o antígeno biotinilado, formando um complexo com um ligador específico para construir uma plataforma de multiplexação. Essa tática torna o rastreamento em larga escala mais viável e mais eficiente na população em geral para diabetes tipo um e doenças concomitantes, levando à previsão precoce e prevenção das doenças.

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