Name: a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19
Uploaded: 2022-07-05T13:00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19 at JoVE.com

Исследование было поддержано грантом JDRF 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, грантом NIH DK32083 и грантом Центра исследований диабета (DRC) P30 DK116073.

Протокол исследования был одобрен Колорадским советом по множественному институциональному обзору.
1. Подготовка буфера
<ol><li>Подготовьте буфер маркировки (2x PBS, pH 7,9): Добавьте 100 мл 10x PBS к 400 мл дистиллированной воды и отрегулируйте pH с помощью NaOH до 7,9.</li>
	<li>Сделать 3 мМ биотина и Ru Sulfo-NHS: Растворить 1 мг биотина в 588 мкл буфера маркировки и растворить 150 нмоль Ru Sulfo-NHS в 50 мкл буфера маркировки.</li>
	<li>Подготовьте буфер антигена (1% BSA): Растворите 5 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 500 мл 1x PBS.</li>
	<li>Подготовьте буфер покрытия (3% Блокатор А): Растворите 15 г блокатора А в 500 мл 1x PBS.</li>
	<li>Подготовьте первый промывочный буфер (0,05 % Tween 20, PBST): Смешайте 2,5 мл Tween 20 в 5000 мл 1x PBS.</li>
	<li>Подготовьте второй промывочный буфер (0,4 М NaCl): Смешайте 50 мл 5 М NaCl в 575 мл дистиллированной воды, чтобы получить раствор 0,4 М NaCl. ПРИМЕЧАНИЕ: Для эффективной маркировки всегда используйте свежеприготовленные растворы биотина и Ru Sulfo-NHS, а не хранящиеся, изготовленные ранее.</li>
</ol>2. Маркировка белка антигена биотином и Ru Sulfo-NHS отдельно
ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения эффективности маркировки рекомендуется более высокая концентрация белка антигена ≥0,5 мг/мл.
<ol><li>Готовят шесть целевых белковых растворов антигена, включая проинсулин, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG и рецептор-связывающий домен (RBD) спайкового белка SARS-CoV-2. Рассчитайте моли каждого белка антигена в соответствии с его молекулярной массой и сделайте соответствующие молярные соотношения биотина или Ru Sulfo-NHS. Отношение антигена к сумме биотина или Ru Sulfo-NHS составит 1:5 для малых молекулярных антигенов (молекулярная масса ≤10 kd), таких как белок проинсулина. Для среднемолекулярных антигенов (молекулярная масса 10-50 кд), таких как ZnT8, соотношение будет корректироваться до 1:10. Для больших молекулярно-весовых антигенов (молекулярная масса >50 кд), таких как GAD, молярное соотношение составит 1:20.</li>
	<li>Разделите белок антигена на две равные части и отдельно смешайте его с биотином и Ru Sulfo-NHS, используя рассчитанное молярное соотношение на этапе 2.1. Инкубировать смесь при комнатной температуре (RT) в течение 1,5 ч, избегая света. ПРИМЕЧАНИЕ: Все восстанавливающие химические вещества, такие как Трис или глицин в буфере белка антигена, должны быть удалены размерной спиновой колонкой, загрунтованной буфером 2x PBS (рН 7,9).</li>
	<li>Загрунтуйте спиновые колонки 2x PBS (размер спиновой колонки, 2 мл или 5 мл, зависит от объема белка антигена маркировки): Добавьте 1 мл 2x буфера PBS в спиновую колонку, центрифугируйте его при 1000 x g в течение 2 мин и повторите шаг еще в 2 раза.</li>
	<li>Пусть антигенный белок-биотин или смесь -Ru Sulfo-NHS проходят через загрунтованную спиновую колонку 1x (центрифугировать колонку на 1000 х г в течение 2 мин) для очистки и остановки реакции маркировки.</li>
	<li>Измерьте конечный объем меченого белка антигена, элюированного из спиновых колонок, рассчитав концентрации биотин- или Ru Sulfo-NHS-меченого белка антигена. Сделайте меньшие аликвоты меченого антигенного белка (50 мкл / пробирка) и храните их при -80 ° C для длительного использования. ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие белка после каждой спиновой колонки будет составлять приблизительно 90%-95% коэффициент удержания.</li>
</ol>3. Определите наилучшую концентрацию и соотношение для антигенов, меченных биотином и Ru Sulfo-NHS, для анализа 6-Plex ECL (шахматный анализ)
ПРИМЕЧАНИЕ: Шахматный анализ для каждого антигена необходим перед интеграцией в мультиплексированный анализ.
<ol><li>Нанесите шахматный анализ на каждый антиген отдельно. ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.2.-3.7. будет использовать TGA в качестве краткого примера. Процесс шахматного анализа TGA предназначен для моделирования процесса анализа, но только с одним видом антигена.</li>
	<li>Производят серийное разведение биотинилированного tTG и Ru Sulfo-NHS-меченого tTG. Рекомендуемые рабочие концентрации первого раствора смеси начинаются от 240 нг/мл как для биотинилированных, так и для tTG, меченных Ru Sulfo-NHS. Предположим, что концентрации как оригинального биотинилированного, так и меченого Ru Sulfo-NHS tTG составляют 1,0 мкг/мкл. Сделайте 10-кратное разведение оригинального Ru Sulfo-NHS-меченого tTG и 5-кратное разведение исходного биотинилированного tTG с 5% BSA.</li>
	<li>Смешайте 4 мкл биотинилированного белка tTG со 156 мкл 5% BSA (антигенный буфер) и 240 мкл стрептавидин-конъюгированного линкера в одной пробирке и инкубируйте раствор на RT в течение 30 мин. Затем добавляют 160 мкл стоп-раствора и инкубируют на RT еще 30 мин. Взять 400 мкл смеси и смешать с 2 мл стоп-раствора. Концентрация биотинилированного тТГ в смеси составляет 240 нг/мл.</li>
	<li>Чтобы сделать серийное разведение для биотин-меченого антигена ZnT8, подготовьте еще пять новых пробирок, возьмите 1 мл аликвоты из смеси на стадии 3.3. и смешать с 1 мл стоп-раствора в новой пробирке, и получить смесь с концентрацией 120 нг/мл. Повторите этот шаг, сделайте последовательные разведения 1:1 и получите меченый биотином tTG при 60 нг/мл, 30 нг/мл, 15 нг/мл и 7,5 нг/мл.</li>
	<li>Добавьте 4 мкл меченого Ru Sulfo-NHS tTG с 1,6 мл стоп-раствора и получите смесь Ru Sulfo-NHS-меченого tTG в концентрации 240 нг/мл. С теми же шагами 3,4. сделайте последовательные разведения 1:1 и получите антиген ZnT8 с маркировкой Ru Sulfo-NHS при 60 нг/мл, 30 нг/мл, 15 нг/мл, 7,5 нг/мл и 3,75 нг/мл. Последняя концентрация составляет 0 нг/мл, только стоп-раствор и без антигена, меченного Ru Sulfo-NHS.</li>
	<li>Подготовьте tTG положительные контрольные и отрицательные контрольные образцы сыворотки (предварительно сертифицированные и стандартизированные одним анализом ECL tTG) и 96-луночную ПЦР-пластину. Аликвот положительных и отрицательных контрольных образцов сыворотки на левую половину и правую половину пластины, соответственно, с 7 мкл в каждой лунке. Добавьте в тарелку 1 pBS с 33 мкл на лунку.</li>
	<li>На левую половину пластины ПЦР добавляют 24 мкл серийного разбавленного раствора tTG-линкера с меткой биотина в каждую лунку, одну колонку с одной концентрацией в порядке от самой высокой до самой низкой. Таким же образом добавляют 16 мкл серийного разбавленного антигена Ru Sulfo-NHS, меченного tTG, в каждую лунку, один ряд с одной концентрацией, а затем тщательно перемешивают. Повторите шаг на правой половине пластины ПЦР.</li>
	<li>Продолжите остальные этапы анализа, описанные в шагах 5.3.-9.1. до получения необработанных данных подсчета.</li>
	<li>Рассчитайте отношение положительных управляющих сигналов к соответствующим отрицательным управляющим сигналам. Определить наилучшую концентрацию для антигена, меченного биотином, и антигена, меченного Ru Sulfo-NHS, с более высокими значениями соотношения и более низким фоном для отрицательного контрольного образца. Оптимальные рабочие концентрации биотина и меченого антигена Ru Sulfo-NHS показаны ниже: 16,0 нг/мл и 8,0 нг/мл для GAD65, 18,8 нг/мл и 9,4 нг/мл для SARS-CoV-2 RBD, 42,0 нг/мл и 42,0 нг/мл для IA-2, 60,0 нг/мл и 60,0 нг/мл для tTG, 4,2 нг/мл и 4,2 нг/мл для ZnT8, и 31,3 нг/мл и 31,3 нг/мл для проинсулина.</li>
</ol>4. Создание раствора антигена, связанного с линкером
<ol><li>Разбавьте биотин- и Ru-сульфо-NHS-меченые антигены с 5% BSA до оптимальных рабочих концентраций в соответствии с этапом 3.9.</li>
	<li>Связывают предварительно выбранные линкеры с каждым биотинилированным антигенным белком. Для одного 96-луночного пластинчатого анализа добавьте 4 мкл биотинилированного GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 и белка проинсулинового антигена в отдельную пробирку, содержащую 156 мкл 1% BSA, и смешайте с 240 мкл соответствующих стрептавидин-конъюгированных линкеров 1, 2, 3, 8, 9 и 10 (рисунок 1). Инкубировать смесь в течение 30 мин при РТ.</li>
	<li>Аликвот 160 мкл стоп-раствора в каждой пробирке и инкубируют смесь на RT в течение 30 мин. Выньте 400 мкл раствора смеси из каждой пробирки и соедините их вместе.</li>
	<li>Добавьте 4 мкл Ru Sulfo-NHS с маркировкой GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 и проинсулиновый антиген к смеси выше, а затем добавьте 1,6 мл стоп-раствора и 3,2 мл 1x PBS и перемешайте. Теперь раствор антигена готов к использованию в анализе.</li>
</ol>5. Инкубация образцов сыворотки с меченым антигеном
<ol><li>Аликвота 7 мкл сыворотки на лунку для 96-луночной ПЦР-пластины и покрытия герметизирующей пленкой. Разогрейте сыворотки при 56 °C в течение 30 мин на аппарате ПЦР. Кратковременно центрифугируют пластину при 100 х г в течение 1 мин.</li>
	<li>Добавьте 63 мкл раствора антигена (приготовленного на стадии 4,4) на лунку и смешайте с сыворотками. Накройте пластину ПЦР уплотнительной фольгой, чтобы избежать света.</li>
	<li>Встряхните пластину на шейкере при 450 об/мин при RT в течение 2 ч, а затем инкубируйте пластину при 4 °C в течение 18-24 ч.</li>
</ol>6. Подготовьте плиту 6-Plex
<ol><li>Возьмите плиту 6-Plex из холодильника с температурой 4 °C, чтобы пластина попала в RT. Добавьте 150 мкл 3% Blocker A к каждой лунке пластины 6-Plex.</li>
	<li>Поместите тарелку обратно в холодильник при температуре 4 °C, накройте тарелку фольгой, избегая света, и высиживайте в течение ночи. ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы анализа в День 1 включают разделы 4.-6.</li>
</ol>7. Перенос инкубации сыворотки/антигена в пластину 6-Plex
<ol><li>На следующий день возьмите инкубационную 6-plex плиту из холодильника и выбросьте весь буфер из тарелки. Похлопайте тарелку по бумажным полотенцам, чтобы высохнуть.</li>
	<li>Мойте 6-Plex пластину 3x с 150 мкл промывочного буфера на лунку каждый раз. Высушите пластину на бумажных полотенцах, и аликвотная сыворотка/антиген инкубируется из каждой лунки ночной инкубирующей ПЦР-пластины в две лунки 6-plex пластины (30 мкл на лунку для дубликатов).</li>
	<li>Накройте пластину фольгой, затем положите пластину на шейкер и встряхните со скоростью 450 об/мин при RT в течение 1 ч.</li>
</ol>8. Вымойте пластину 6-Plex и добавьте буфер считывания
<ol><li>Высыпьте раствор в пластину 6-Plex и промойте пластину 3x с 150 мкл 0,4 M NaCl промывочного буфера на каждую лунку каждый раз.</li>
	<li>После завершения третьей стирки высушите пластину на бумажном полотенце и добавьте 150 мкл буфера для считывания в каждую лунку. ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха в скважине влияют на точность пластинчатого считывателя, и их следует избегать любой ценой.</li>
</ol>9. Прочитайте пластину и проанализируйте данные
<ol><li>Подсчитайте пластину на электрохемилюминесцентном анализаторе. Результаты чтения будут представлены со значениями в счетчиках в секунду (CPS). Рассчитать относительный индекс антител каждого образца с помощью сырого CPS, полученного из считывающей машины, против CPS внутреннего стандарта положительного и отрицательного контроля каждого специфического антитела (Значение индекса = [CPS (образец) - CPS (отрицательный стандарт)] / [CPS (положительный стандарт) - CPS (отрицательный стандарт)]).</li>
	<li>Определить отрицательные или положительные результаты антител, используя пороговые значения, которые были установлены на99,5-99,8-м процентилях 555 отрицательных контрольных образцов из исследования ASK (все отрицательные образцы антител без истории или семейной истории диабета или любого другого типа аутоиммунного заболевания). ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы анализа в День 2 включают разделы 7-9.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Group, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Environmental+Determinants+of+Diabetes+in+the+Young+(TEDDY)+Study.">The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY) Study.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1150, 1-13 (2008).</li><li>Vehik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+incidence+of+type+1+diabetes+in+0-+to+17-year-old+Colorado+youth.">Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth.</a> Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).</li><li>Insel, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+presymptomatic+type+1+diabetes:+a+scientific+statement+of+JDRF,+the+Endocrine+Society,+and+the+American+Diabetes+Association.">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li><li>Stahl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+screening+for+celiac+disease:+The+autoimmunity+screening+for+kids+study.">Mass screening for celiac disease: The autoimmunity screening for kids study.</a> The American Journal of Gastroenterology. 116 (1), 180-187 (2021).</li><li>Al-Hussaini, A., Sulaiman, N., Al-Zahrani, M., Alenizi, A., El Haj, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+celiac+disease+among+Saudi+children+with+type+1+diabetes:+A+prospective+cross-sectional+study.">High prevalence of celiac disease among Saudi children with type 1 diabetes: A prospective cross-sectional study.</a> BMC Gastroenterology. 12, 180 (2012).</li><li>Agardh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+features+of+celiac+disease:+A+prospective+birth+cohort.">Clinical features of celiac disease: A prospective birth cohort.</a> Pediatrics. 135 (4), 627-634 (2015).</li><li>COVID-19: Clinical manifestations and diagnosis in children. UpToDate Available from: <a target="_blank" href="https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print">https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print</a> (2021)</li><li>Barron, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+type+1+and+type+2+diabetes+with+COVID-19-related+mortality+in+England:+a+whole-population+study.">Associations of type 1 and type 2 diabetes with COVID-19-related mortality in England: a whole-population study.</a> The Lancet Diabetes &amp; Endocrinology. 8 (10), 813-822 (2020).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemiluminescence+assays+for+insulin+and+glutamic+acid+decarboxylase+autoantibodies+improve+prediction+of+type+1+diabetes+risk.">Electrochemiluminescence assays for insulin and glutamic acid decarboxylase autoantibodies improve prediction of type 1 diabetes risk.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).</li><li>Jia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+SARS-CoV-2+antibodies+in+children+and+adults+with+Type+1+diabetes.">Prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in children and adults with Type 1 diabetes.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 23 (7), 517-521 (2021).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multiplex+electrochemiluminescence+assay+applicable+to+general+population+screening+for+type+1+diabetes+and+celiac+disease.">High-throughput multiplex electrochemiluminescence assay applicable to general population screening for type 1 diabetes and celiac disease.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. , (2022).</li><li>McQueen, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+and+cost-effectiveness+of+large-scale+screening+for+type+1+diabetes+in+Colorado.">Cost and cost-effectiveness of large-scale screening for type 1 diabetes in Colorado.</a> Diabetes Care. 43 (7), 1496-1503 (2020).</li><li>Insel, R. A., Dunne, J. L., Ziegler, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+population+screening+for+type+1+diabetes:+has+its+time+come.">General population screening for type 1 diabetes: has its time come.</a> Current Opinion in Endocrinology &amp; Diabetes and Obesity. 22 (4), 270-276 (2015).</li><li>Ziegler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+Screen+ELISA+for+high-throughput+detection+of+beta+cell+autoantibodies+in+capillary+blood.">3 Screen ELISA for high-throughput detection of beta cell autoantibodies in capillary blood.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).</li><li>Cortez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+multiple+islet+autoantibodies+in+type+1+diabetes+using+small+sample+volumes+by+agglutination-PCR.">Sensitive detection of multiple islet autoantibodies in type 1 diabetes using small sample volumes by agglutination-PCR.</a> PLoS One. 15 (11), 0242049 (2020).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL-IAA+and+ECL-GADA+can+identify+high-risk+single+autoantibody-positive+relatives+in+the+TrialNet+pathway+to+prevention+study.">ECL-IAA and ECL-GADA can identify high-risk single autoantibody-positive relatives in the TrialNet pathway to prevention study.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinsulin/Insulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity.">Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes.">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk:+Nonradioactive+bivalent+proinsulin/insulin+autoantibody+assay.">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: Nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+sensitivity+and+earlier+identification+of+celiac+disease+autoimmunity+by+a+nonradioactive+assay+for+transglutaminase+autoantibodies.">Higher sensitivity and earlier identification of celiac disease autoimmunity by a nonradioactive assay for transglutaminase autoantibodies.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 2904563 (2016).</li><li>Jia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+ZnT8+autoantibodies+by+electrochemiluminescence+assay+improve+risk+prediction+for+type+1+diabetes.">High-affinity ZnT8 autoantibodies by electrochemiluminescence assay improve risk prediction for type 1 diabetes.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (12), 3455-3463 (2021).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete-panel+islet+autoantibody+multiplex+ECL+assay.">A complete-panel islet autoantibody multiplex ECL assay.</a> Diabetes. 70, 158 (2021).</li><li>Achenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+high-affinity+immune+responses+to+(pro)insulin+anticipate+the+autoimmune+cascade+that+leads+to+type+1+diabetes.">Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (4), 589-597 (2004).</li><li>Schlosser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+insulin-autoantibody-positive+children+from+the+general+population,+antibody+affinity+identifies+those+at+high+and+low+risk.">In insulin-autoantibody-positive children from the general population, antibody affinity identifies those at high and low risk.</a> Diabetologia. 48 (9), 1830-1832 (2005).</li><li>Mayr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD+autoantibody+affinity+and+epitope+specificity+identify+distinct+immunization+profiles+in+children+at+risk+for+type+1+diabetes.">GAD autoantibody affinity and epitope specificity identify distinct immunization profiles in children at risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 56 (6), 1527-1533 (2007).</li><li>Siljander, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+insulin+autoantibody+affinity+as+a+predictive+marker+for+type+1+diabetes+in+young+children+with+HLA-conferred+disease+susceptibility.">Role of insulin autoantibody affinity as a predictive marker for type 1 diabetes in young children with HLA-conferred disease susceptibility.</a> Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 25 (7), 615-622 (2009).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multiplexed+autoantibody+detection+to+screen+type+1+diabetes+and+multiple+autoimmune+diseases+simultaneously.">High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously.</a> Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).</li><li>Jia, X., He, L., Gu, Y., High, H., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+electrochemiluminescence+7-plex+assay+simultaneously+screening+for+type+1+diabetes+and+multiple+autoimmune+diseases.">A high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e61160 (2020).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Вмешательство для T1D вступило в эру до T1D, с продолжающимися национальными и международными крупномасштабными программами скрининга для T1D и быстро развивающимися клиническими испытаниями, применяемыми на стадии 1 T1D, чтобы отменить или замедлить прогрессирование до клинического T1D12,13. Измерения четырех IAb с использованием текущего стандарта RBA с одним форматом анализа IAb являются трудоемкими и неэффективными для программы массового скрининга. С острым спросом на высокопроизводительный мультиплексированный анализ IAbs, мультиплексированный анализ ECL, 3-Screen ICA ELISA и обнаружение антител с помощью агглютинации-ПЦР (ADAP) стали в настоящее время конкурентоспособными технологиями. В исследовании Fr1da скрининга на СД1 в популяции маленьких детей в Германии в качестве основного теста14 использовался 3-Screen ICA ELISA, объединяющий 3 IAbs (GADA, IA-2A и ZnT8A). Основным ограничением 3-Screen ICA ELISA является отсутствие IAA, который в основном является первым IAb, который появляется с высокой распространенностью у маленьких детей с СД1. Кроме того, анализ не в состоянии отличить, какой из трех IAb является положительным от положительного сигнала, и каждый положительный образец должен быть повторен с тремя одиночными анализами для подтверждения. ADAP15 сочетает в себе GADA, IA-2A и IAA и иллюстрирует высокую чувствительность и специфичность анализа на семинаре IASP, но не имеет данных о том, насколько он прогностичен в популяционном скрининге для исследований T1D, которые семинар IASP не в состоянии определить. Мультиплексный анализ ECL в настоящем исследовании построен на платформе одного анализа ECL, который был проверен на соответствие текущему стандарту RBA в нескольких клинических испытаниях, таких как TrailNet 9,16, DAISY 17,18,19 и ASK 4,20,21 изучать. Настоящий анализ был проверен как по RBA, так и по одному анализу ECL с использованием 880 образцов сыворотки от участников исследования ASK. Как показано на рисунках 2 и 3, уровни антител между 6-Plex и одним ECL или между 6-Plex и RBA были в основном конгруэнтны друг другу для положительности антител. Частота совпадений IAbs, протестированных RBA и 6-Plex, составила 91,7%-97,8%, а частота совпадений IAbs, протестированных одним ECL и 6-Plex, составила 95,3%-99,2%. Несоответствие между анализом ECL и RBA было в основном от тех, у кого был единственный IAb. Уровни IAbs, протестированные 6-Plex и одним ECL (r = 0,6431-0,9434, все p < 0,0001) и 6-Plex и RBA (r = 0,5775-0,8576, все p < 0,0001), также были хорошо коррелированы. TGA, протестированные с помощью анализа 6-Plex, были сильно коррелированы с результатами как RBA (99,4%), так и одного анализа ECL (99,4%). Кроме того, covid-19A, протестированный 6-Plex, достиг 99,8% соответствия результатам единого анализа ECL.
В результате анализ 6-Plex ECL был официально принят в качестве основного метода скрининга для текущего исследования ASK и заменил стандартный RBA22. Этот анализ продемонстрировал его отличную чувствительность и специфичность с более высокой пропускной способностью, более низкой стоимостью и меньшим объемом сыворотки по сравнению со стандартным RBA.
Было задокументировано, что в скрининговом исследовании T1D один IAb, обнаруженный RBA, который занимал большую долю позитивов IAb, имел низкое сродство с низким риском заболевания и приводил к общей низкой прогностической ценности 19,21,23,24,25,26. Такое прогнозирование низкого риска вызвало огромные дополнительные расходы на последующие посещения и привело к трудностям для профилактических исследований СД1. Установленная платформа анализа ECL была продемонстрирована в нескольких клинических испытаниях, чтобы отличить высокоаффинные IAbs от низкородных IAbs, генерируемых RBA, и значительно повысить прогностические значения для всех четырех IAb, особенно с одной положительностью IAb 16,17,18,21 . Мультиплексная технология анализа ECL была построена на платформе одного анализа ECL, с этим явным преимуществом обнаружения высокоаффинного Abs. В настоящем исследовании анализ 6-Plex ECL проиллюстрировал его сходство с соответствующими одиночными анализами ECL по чувствительности и специфичности.
Некоторые ограничения и технические проблемы мультиплексного анализа ECL с использованием нескольких пластин Plex уже были освещены в предыдущих публикациях27,28. С шестью мечеными антигенами в одной лунке могут быть некоторые влияния между различными антигенами, и фон анализа может увеличиваться при добавлении каждого анализа антител для мультиплексирования в одной и той же лунке. Большой объем работы по оптимизации анализа необходим для корректировки условий анализа, особенно для корректировки конечных концентраций каждого меченого белка антигена на основе шахматного анализа для каждого антигена, для поддержания чувствительности и специфичности для каждого анализа антител. Как упоминалось в предыдущих исследованиях27,28, небольшое количество образцов (<1%) приводит к ложной позитивности на множественной пластине Plex без четкой основной причины. Все положительные результаты должны быть повторены и подтверждены одним ECL-анализом в качестве обычного лабораторного обеспечения качества; как правило, ложные срабатывания удаляются. Ложноотрицательные результаты, вызванные «прозональным эффектом», наблюдаемым в предыдущем анализе 7-Plex ECL 27,28, не наблюдались в настоящем исследовании. В анализе, описанном здесь, мы удалили этап кислотной обработки образцов сыворотки из предыдущего протокола; вместо этого мы предварительно нагревали образцы сыворотки при 56 °C в течение 30 мин (шаг 5.1.). На второй день мытья пластин мы использовали буфер для мытья, содержащий 0,4 M NaCl (шаг 8.1.) вместо обычного буфера для мытья, чтобы мыть пластину более строго. Эти модификации упростили мультиплексный анализ ECL и снизили фон без потери чувствительности анализа.
В заключение, этот анализ имеет выдающуюся производительность для обнаружения четырех IAbs, TGA и COVID-19A одновременно. Функция мультиплексирования, а также высокая пропускная способность, низкая стоимость и малый объем сыворотки делают крупномасштабный скрининг на СД1 и сопутствующие заболевания гораздо более осуществимым среди населения в целом. Пациенты с СД1 или любыми аутоиммунными заболеваниями имеют гораздо более высокий риск других аутоиммунных заболеваний. Мультиплексный анализ ECL обеспечивает отличную платформу для скрининга СД1 и нескольких аутоиммунных заболеваний одновременно.

Крупные эпидемиологические исследования во всем мире показывают, что заболеваемость диабетом 1 типа (СД1) быстро растет на 3-5% ежегодно, а распространенность СД1 удвоилась за последние 20 лет, особенно у маленьких детей 1,2. Островковые аутоантитела (IAbs) обычно появляются за годы до клинических симптомов и в настоящее время являются наиболее надежными прогностическими и диагностическими биомаркерами для T1D3. Скрининг на аутоантитела T1D может идентифицировать людей, подверженных риску прогрессирования до клинического T1D, просвещать общественность, в значительной степени уменьшать опасные для жизни осложнения кетоацидоза и приносить пользу клиническим испытаниям для профилактической терапии. Во всем мире предпринимаются усилия по профилактике СД1, и проводятся многочисленные интервенционные испытания среди субъектов с положительным IAbs, чтобы задержать прогрессирование клинического СД1, а Центр диабета Барбары Дэвис запустил первое в США клиническое испытание скрининга среди населения в целом в 2016 году на СД1 и целиакию, аутоиммунный скрининг для детей (ASK)4 . Целиакия (БК) является хроническим кишечным воспалительным заболеванием, связанным с иммунными и генетическими факторами. Распространенность БК у детей с СД1 может достигать до 24,5%5. Более половины людей с БК могут не иметь типичных симптомов при презентации6, поэтому серологический скрининг на целиакию совершенно необходим.
С начала пандемии коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19) во всем мире зарегистрировано более 200 миллионов случаев заболевания, а на детей приходится до 16% лабораторно подтвержденных случаев7. Многие исследования продемонстрировали влияние существующего СД1 на тяжесть и летальность инфекции COVID-198, в то время как влияние инфекции COVID-19 на развитие СД1 неясно. Исследование общего уровня заражения COVID-19 в общей популяции путем определения антител к коронавирусу 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-COV-2) и изучение связи между инфекцией COVID-19 и запуском аутоиммунитета T1D или ускорением прогрессирования T1D срочно необходимы и очень важны, в то время как продолжающееся исследование ASK является отличной платформой для этого. Благодаря единому формату анализа и генерации значительной доли положительности антител с низким сродством, стандартный радиосвязывающий анализ (RBA) столкнулся с узким местом низкой эффективности и низкой специфичности заболевания9. В настоящей статье мы представляем новый 6-плексированный электрохемилюминесцентный анализ (ECL), построенный на нашей предыдущей мультиплексной платформе анализа ECL с использованием пластины multiple-Plex, объединяющей шесть анализов аутоантител в одной лунке, включая все четыре основных IAbs к инсулину (IAA), декарбоксилазе глутаминовой кислоты-65 (GADA), антигену инсулиномы-2 (IA-2A) и транспорту цинка-8 (ZnT8A), аутоантителаминазе к трансглутаминазе (TGA) для целиакии, и антитела к SARS-CoV-2 рецептор-связывающему домену (RBD) (COVID-19A). Это первый мультиплексный анализ, который набрал полную группу из четырех основных IAb и в дальнейшем объединил это с TGA и COVID-19A. Он был подтвержден и официально принят в качестве основного инструмента скрининга, заменяющего стандартный RBA в исследовании ASK.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mM NaCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1070832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PI21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker A</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R93AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top 500 ml-Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974064A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAD65 protein</td>
			<td>Diamyd Medical</td>
			<td>10-65702-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IA-2 protein (aa 605-979)</td>
			<td>Creative BioMart</td>
			<td>283309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MESO QuickPlex SQ120</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R31QQ-3</td>
			<td>Electrochemiluminescence analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proinsulin protein</td>
			<td>AmideBio</td>
			<td>20160118B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer B</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0800019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 RBD protein</td>
			<td>Creative Biomart</td>
			<td>Spike-190V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0090019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-TAG</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tTG protein</td>
			<td>Diarect AG</td>
			<td>15201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Plex 6-Assay SECTOR plate</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Z00U0142E</td>
			<td>6-plex plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 1</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 10</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 2</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0020015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 3</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0030018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 8</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0080018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 9</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0090014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeBa Column</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89892</td>
			<td>Spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnT8 protein</td>
			<td>Research Laboratory</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19

Продолжающееся клиническое испытание, аутоиммунный скрининг для детей (ASK), является первым скрининговым исследованием среди населения в целом на диабет 1 типа (T1D) и целиакию в Соединенных Штатах. С пандемией коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19) срочно необходимы эпидемиология COVID-19 среди населения в целом и знания о связи между инфекцией COVID-19 и развитием СД1. В настоящее время стандартный метод скрининга радиосвязывающего анализа (RBA) столкнулся с двумя серьезными проблемами: низкой эффективностью при одном формате анализа и низкой специфичностью заболевания с большой долей низкоаффинных антител, генерируемых при скрининге. С помощью платформы мультиплексного анализа электрохемилюминесценции (ECL), который мы установили ранее, был разработан новый анализ ECL 6-Plex, который объединяет в одной лунке все четыре островковых аутоантитела (IAbs) с инсулином, декарбоксилазой глутаминовой кислоты (GAD65), антигеном инсулиномы 2 (IA-2) и транспортером цинка 8 (ZnT8) для T1D, трансглутаминазными аутоантителами (TGA) для целиакии и тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2) рецептор-связывающих доменов (RBD) антител для антител к рецептор-связывающему домену (RBD) тяжелого острого респираторного синдрома COVID-19. Анализ был проверен вслепую с использованием 880 образцов из исследования ASK, включая 325 положительных образцов и 555 всех отрицательных образцов на антитела, и сравнивался со стандартными RBA и одним анализом ECL. Благодаря преимуществам высокой эффективности, низкой стоимости и низкого объема сыворотки, этот анализ был принят в качестве основного инструмента скрининга для исследования ASK.

Таблица 1, Таблица 2 и Таблица 3 иллюстрируют репрезентативные результаты. Необработанные CPS, полученные из считывающей машины, проиллюстрированы в таблице 1. В таблице 2 необработанные CPS были организованы и отсортированы по шести линкерам и соответствующим антителам. В таблице 3 показаны рассчитанные значения индекса с помощью CPS, как описано в протоколе анализа. Все необработанные значения подсчета должны быть проверены, чтобы избежать неправильных конечных результатов индекса, вызванных плохими дубликатами. В таблице 1 приведены примеры плохих дубликатов, которые привели к ошибке при окончательном расчете индекса в таблице 3.
Этот анализ был проверен слепым способом с использованием 880 отобранных образцов из исследования ASK с 325 положительными образцами IAbs и 555 всеми abs-отрицательными образцами. Уровни аутоантител из анализа 6-Plex ECL для 880 образцов сравнивали точечно с уровнями соответствующих одиночных анализов ECL (рисунок 2) и с соответствующим единым стандартом RBA (рисунок 3). Отсечение, чувствительность и специфичность для каждого антитела перечислены в таблице 4. Чувствительность и специфичность этого анализа ECL-COVID-19A были идентифицированы как 100% и 99,9% соответственно10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig01.jpg"> Рисунок 1: Иллюстрация анализа ECL 6-Plex. Сывороточные аутоантитела образуют соединение меченого Ru Sulfo-NHS антигена с биотинилированным антигеном, который соединен со специфическим линкером и образует комплекс антиген-антитело-антиген-линкер. Комплексы захватываются через каждый конкретный линкер на определенные точки в пластине 6-Plex. Для каждого антигена были присвоены специфические номера линкера: GAD-linker-1, Covid-19-linker-2, IA-2-linker-3, tTG-linker-8, ZnT8-linker-9 и Proinslulin-linker-10. Эта цифра была изменена с разрешения He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig02.jpg"> Рисунок 2: Сравнение шести уровней антител в 880 образцах из исследования ASK между одним анализом ECL и анализом 6-Plex ECL. Панели отображают сравнение уровней антител для GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA и COVID-19A соответственно (индекс COVID-19A был представлен как (100-кратное расчетное значение индекса)). Пунктирные линии представляют собой отсечки анализа для каждого анализа антител. Эта цифра была изменена с разрешения He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig03.jpg"> Рисунок 3: Сравнение пяти уровней антител в 880 образцах из исследования ASK между RBA и 6-Plex ECL анализом. Панели отображают сравнение уровней антител для GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A и TGA соответственно. Пунктирные линии представляют собой отсечки анализа для каждого анализа антител. Эта цифра была изменена с разрешения He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Таблица 1: Необработанные подсчеты CPS (левая половина пластины). Необработанные подсчеты CPS получены из левой половины пробирной пластины. Каждый образец выполняется в двух экземплярах. Каждый счетчик CPS в одном столбце (A1, A2, A3 и т. Д.) Представляет данные чтения из 10 точек в одной и той же скважине (отмечены соответствующие номера компоновщика). Примеры плохих дубликатов выделены серым цветом, как показано в строке D-linker 3, столбце 5 и столбце 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%201.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Таблица 2: Расположение данных таблицы 1, отсортированных с помощью шести компоновщиков. Значения CPS из таблицы 1 были перегруппированы, вычисляя средние значения для повторяющихся показаний CPS и удаляя неиспользуемые значения для компоновщиков 4-7. Значения внутреннего стандарта высоких положительных, низких положительных и отрицательных контрольных значений каждого анализа аутоантител выделены темным жирным шрифтом. ПК, положительный контроль. NC, отрицательный контроль. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%202.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Таблица 3: Результаты значений индексов. Значения индекса для каждой выборки для всех шести антител были рассчитаны по соответствующим положительным и отрицательным контрольным показателям. Значение индекса, превышающее значение отсечения, было определено как положительное, выделенное жирным шрифтом. Плохое дублирование значений CPS в таблице 1, строка D-linker 3-столбцы 5 и 6, привело к положительному значению индекса IA-2A выборки 11 (выделено серым цветом), что, вероятно, было ложноположительным результатом. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table_3.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Таблица 4: Отсечение анализа, чувствительность и специфичность для GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA и TGA среди 880 образцов ASK, включая 325 положительных образцов IAbs и 555 всех отрицательных образцов антител. Оптимальное значение индекса отсечения GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA и TGA было установлено по крайней мере на 99-й процентиль из 555 нормальных контрольных образцов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%204.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19 at JoVE.com

A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19

В соответствии с настоятельной необходимостью скрининга диабета 1 типа, целиакии и коронавирусной болезни 2019 года мы разработали высокопроизводительный электрохемилюминесцентный анализ 6-Plex для одновременного обнаружения всех четырех островковых аутоантител, аутоантител тканевой трансглутаминазы и антител к рецепторсвязывающему домену коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2.

Высокопроизводительный мультиплексированный скрининг на диабет 1 типа, целиакию и COVID-19

An ongoing clinical trial, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), is the first screening study in the general population for type 1 diabetes (T1D) and ...

Новый 6-Plex ECL-анализ является первым мультиплексным анализом, проверенным и в настоящее время применяемым в клинических испытаниях для скрининга населения в целом. Он одновременно объединяет шесть анализов аутоантител, подходящих для скрининга диабета 1 типа, целиакии и COVID-19 в большой популяции. По сравнению с текущим стандартным анализом аутоантител, этот метод может более эффективно проверять несколько аутоантител для нескольких аутоиммунных заболеваний одновременно.Использование этого метода сделает крупномасштабный скрининг более осуществимым и специфичным для заболевания, что приведет к раннему прогнозированию заболеваний для профилактики и более точной диагностике для терапии. Для начала добавьте четыре микролитра биотинилированного gad65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 и проинсулиновый антигенный белок в пробирку, содержащую 156 микролитров 1% BSA, и смешайте с 240 микролитрами соответствующих стрептавидин-конъюгированных линкеров, 1, 2, 3, 8, 9 и 10. Затем инкубировать смесь в течение 30 минут при комнатной температуре.Aliquot 160 микролитров стоп-раствора в каждую пробирку и инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 30 минут. Теперь возьмите 400 микролитров раствора смеси из каждой трубки и соедините их вместе. Добавьте в смесь четыре микролитра меченого рутением GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 и проинсулинового антигена.Затем добавляют 1,6 миллилитра стоп-раствора и 3,2 миллилитра PBS. Тщательно перемешайте все компоненты. И теперь раствор антигена готов к использованию в анализе.Для 96-луночной ПЦР-пластины аликвотьте семь микролитров сыворотки на лунку и накройте пластину герметизирующей пленкой. Затем разогрейте сыворотки при 56 градусах Цельсия в течение 30 минут на аппарате ПЦР и кратковременно центрифугируйте пластину в 100 раз G в течение одной минуты. Добавьте 63 микролитра приготовленного раствора антигена на лунку, смешайте с сыворотками и накройте пластину ПЦР герметизирующей фольгой, чтобы избежать света.Встряхните пластину на шейкере со скоростью 450 об/мин в течение двух часов при комнатной температуре. А затем высиживать пластину при четырех градусах Цельсия в течение 18-24 часов. Возьмите плиту 6-Plex из холодильника с четырьмя градусами Цельсия, чтобы пластина достигла комнатной температуры.Затем добавьте 150 микролитров 3%Blocker A к каждой лунке пластины 6-Plex. Накройте пластину фольгой, чтобы избежать света. Положите тарелку обратно в холодильник с температурой четыре градуса Цельсия и высиживайте на ночь.В конце инкубации, как только тарелка будет извлечена из холодильника, снимите весь буфер с тарелки. Похлопайте тарелку по бумажным полотенцам, чтобы они высохли, и мойте ее трижды 150 микролитрами стирального буфера на каждую лунку каждый раз. Высушите пластину на бумажном полотенце и аликвотьте 30 микролитров сывороточного антигена, инкубируемого из каждой лунки ночной инкубирующей ПЦР-пластины в две лунки 6-Plex пластины.Накройте тарелку фольгой, затем положите пластину на шейкер и встряхните со скоростью 450 об/мин при комнатной температуре в течение одного часа. Сбросьте раствор, присутствующий в пластине 6-Plex, и промыть пластину три раза 150 микролитрами промывочного буфера 0,4 М хлорида натрия на скважину. После завершения третьей стирки высушите пластину на бумажном полотенце и добавьте в каждую лунку по 150 микролитров считывающего буфера.Уровни шести аутоантител для GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA и COVID-19A из анализа 6-Plex ECL были хорошо коррелированы с их соответствующими шестью одиночными анализами ECL и текущим стандартным радиосвязывающим анализом. Значения индекса для каждой выборки для всех шести антител были рассчитаны по соответствующим положительным и отрицательным контрольным показателям. Наблюдалось значение индекса, превышающее значение отсечения, что указывало на положительный результат.Аутоантитела в сыворотке крови нарушили меченый рутением антиген к биотинилированному антигену, образовав комплекс со специфическим линкером для построения мультиплексирующей платформы. Эта тактика делает крупномасштабный скрининг более осуществимым и более эффективным среди населения в целом на диабет первого типа и сопутствующие заболевания, что приводит к раннему прогнозированию и профилактике заболеваний.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Ускоренное диабета 1 типа у мышей Индукционная приемными Передача диабетогенные CD4 + Т-клеток

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Микроскопический фенотипический анализ для количественной оценки внутриклеточных микобактерий, адаптированных для скрининга с высокой пропускной способностью/высоким содержанием

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Высокопроизводительный скрининг для широкого спектра химических ингибиторов РНК-содержащих вирусов

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Создание установки с высокой пропускной способностью для скрининга малых молекул, которые модулируют с-ди-GMP Передача сигналов в<em&gt; Синегнойной</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Флуоресцентным на основе анализа Лимфоцит Подходит для высокопроизводительного скрининга малых молекул

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Ячейки бесплатно биохимических флуориметрический ферментативные Assay высок объём измерения перекисного окисления липидов в липопротеинов высокой плотности

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Высок объём Cre-Lox активации вирусного мембраны Fusion Assay для выявления ингибиторы синтеза вирусных мембраны ВИЧ-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Высок объём шигеллезом-конкретные бактерицидной Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Расширенный murine модель безалкогольный стеатогепатит в ассоциации с сахарным диабетом 2 типа

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...