Name: a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19
Uploaded: 2022-07-05T13:00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19 at JoVE.com

Studien stöddes av JDRF-bidrag 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, NIH-bidrag DK32083 och Diabetes Research Center (DRC) bidrag P30 DK116073.

Forskningsprotokollet godkändes av Colorado Multiple Institutional Review Board.
1. Förberedelse av buffert
<ol><li>Förbered märkningsbufferten (2x PBS, pH 7.9): Tillsätt 100 ml 10x PBS till 400 ml destillerat vatten och justera pH med NaOH till 7,9.</li>
	<li>Gör 3 mM biotin och Ru Sulfo-NHS: Lös upp 1 mg biotin i 588 μL märkningsbuffert och lös upp 150 nmol Ru Sulfo-NHS i 50 μL märkningsbuffert.</li>
	<li>Förbered antigenbufferten (1% BSA): Lös upp 5 g bovint serumalbumin (BSA) i 500 ml 1x PBS.</li>
	<li>Förbered beläggningsbufferten (3% blockerare A): Lös upp 15 g blockerare A i 500 ml 1x PBS.</li>
	<li>Förbered den första tvättbufferten (0,05 % Tween 20, PBST): Blanda 2,5 ml Tween 20 i 5 000 ml 1x PBS.</li>
	<li>Förbered den andra tvättbufferten (0,4 M NaCl): Blanda 50 ml 5 M NaCl i 575 ml destillerat vatten för att göra 0,4 M NaCl-lösningen. OBS: För effektiv märkning, använd alltid nyberedda biotin- och Ru Sulfo-NHS-lösningar och inte lagrade som gjorts tidigare.</li>
</ol>2. Antigenproteinmärkning med biotin och Ru Sulfo-NHS separat
OBS: En högre koncentration av antigenprotein ≥0,5 mg / ml rekommenderas för högre märkningseffektivitet.
<ol><li>Förbered sex riktade antigenproteinlösningar, inklusive proinsulin, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG och receptorbindande domän (RBD) av spikproteinet i SARS-CoV-2. Beräkna molen för varje antigenprotein enligt dess molekylvikt och gör lämpliga molära förhållanden för biotin eller Ru Sulfo-NHS. Förhållandet mellan antigen och summan av biotin eller Ru Sulfo-NHS kommer att vara 1: 5 för små molekylära antigener (molekylvikt ≤10 kd), såsom proinsulinprotein. För medelmolekylära antigener (molekylvikt 10-50 kd), såsom ZnT8, kommer förhållandet att justeras till 1:10. För antigener med stor molekylvikt (molekylvikt >50 kd), såsom GAD, kommer molförhållandet att vara 1:20.</li>
	<li>Dela antigenproteinet i två lika delar och blanda det separat med biotin och Ru Sulfo-NHS med hjälp av det beräknade molära förhållandet i steg 2.1. Inkubera blandningen vid rumstemperatur (RT) i 1,5 h, undvik ljus. OBS: Alla reducerande kemikalier som Tris eller glycin i bufferten av antigenprotein måste avlägsnas med en storleksspinnkolonn grundad med en buffert på 2x PBS (pH 7,9).</li>
	<li>Fyll spinnkolonnerna med 2x PBS (storleken på spinnkolonnen, 2 ml eller 5 ml, beror på volymen på märkningsantigenproteinet): Tillsätt 1 ml 2x PBS-buffert till spinnkolonnen, centrifugera den vid 1 000 x g i 2 minuter och upprepa steget 2x mer.</li>
	<li>Låt antigenprotein-biotin- eller -Ru Sulfo-NHS-blandningen gå igenom den grundade spinnkolonnen 1x (centrifugera kolonnen vid 1 000 x g i 2 min) för att rena och stoppa märkningsreaktionen.</li>
	<li>Mät den slutliga volymen av det märkta antigenproteinet som elueras från spinnkolonnerna, beräkna koncentrationerna av biotin- eller Ru Sulfo-NHS-märkt antigenprotein. Gör mindre alikvoter av märkt antigenprotein (50 μl / rör) och förvara dem vid −80 ° C för långvarig användning. OBS: Täckningen av protein efter varje spinnkolonn kommer att vara en ungefärlig retentionshastighet på 90% -95%.</li>
</ol>3. Definiera den bästa koncentrationen och förhållandena för biotin- och Ru Sulfo-NHS-märkta antigener för 6-Plex ECL-analysen (schackbrädeanalys)
OBS: Schackbrädesanalysen för varje antigen är nödvändig innan den integreras i den multiplexerade analysen.
<ol><li>Applicera schackbrädesanalysen för varje antigen separat. OBS: Steg 3.2.-3.7. kommer att använda TGA som ett kort exempel. TGA-kontrollplansanalysprocessen är att simulera analysprocessen men med endast en typ av antigen.</li>
	<li>Gör den seriella utspädningen av den biotinylerade tTG och Ru Sulfo-NHS-märkta tTG. De rekommenderade arbetskoncentrationerna för den första blandningslösningen börjar från 240 ng/ml för både biotinylerad och Ru Sulfo-NHS-märkt tTG. Antag att koncentrationerna av både original biotinylerad och Ru Sulfo-NHS-märkt tTG är 1,0 μg / μL. Gör en 10x utspädning av den ursprungliga Ru Sulfo-NHS-märkta tTG och en 5x utspädning av den ursprungliga biotinylerade tTG med 5% BSA.</li>
	<li>Blanda 4 μl biotinylerat tTG-protein med 156 μl 5 % BSA (antigenbuffert) och 240 μl av den streptavidinkonjugerade länkaren i ett rör och inkubera lösningen vid RT i 30 minuter. Tillsätt sedan 160 μl stopplösning och inkubera vid RT i ytterligare 30 minuter. Ta 400 μl av blandningen och blanda med 2 ml stopplösning. Koncentrationen av det biotinylerade tTG i blandningen är 240 ng/ml.</li>
	<li>För att göra en seriell utspädning för biotinmärkt ZnT8-antigen, förbered ytterligare fem nya rör, ta 1 ml av en alikvot från blandningen i steg 3.3. och blanda med 1 ml stopplösning i ett nytt rör och få blandningen med en koncentration av 120 ng / ml. Upprepa detta steg, gör seriella 1: 1-utspädningar och få den biotinmärkta tTG vid 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml och 7,5 ng / ml.</li>
	<li>Tillsätt 4 μL Ru Sulfo-NHS-märkt tTG med 1,6 ml stopplösning och få en blandning av Ru Sulfo-NHS-märkt tTG i en koncentration av 240 ng/ml. Med samma steg på 3.4., gör seriella 1: 1-utspädningar och få Ru Sulfo-NHS-märkt ZnT8-antigen vid 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml, 7.5 ng / ml och 3.75 ng / ml. Den sista koncentrationen är 0 ng / ml, med endast stopplösning och inget Ru Sulfo-NHS-märkt antigen.</li>
	<li>Förbered tTG-positiva kontroll- och negativa kontrollserumprover (förkvalificerade och standardiserade med en enda ECL tTG-analys) och en 96-brunns PCR-platta. Alikvotera de positiva och negativa kontrollserumproverna till den vänstra respektive högra halvan av plattan med 7 μl i varje brunn. Tillsätt 1x PBS till plattan, med 33 μL per brunn.</li>
	<li>På den vänstra halvan av PCR-plattan tillsätt 24 μL av den seriella utspädda biotinmärkta tTG-linkerlösningen till varje brunn, en kolonn med en koncentration i storleksordningen högsta till lägsta. På samma sätt tillsätt 16 μL av det seriella utspädda Ru Sulfo-NHS-märkta tTG-antigenet till varje brunn, en rad med en koncentration och blanda sedan noggrant. Upprepa steget på den högra halvan av PCR-plattan.</li>
	<li>Fortsätt resten av analysstegen som beskrivs i steg 5.3.-9.1. tills råräkningsdata erhålls.</li>
	<li>Beräkna förhållandet mellan positiva styrsignaler och motsvarande negativa styrsignaler. Bestäm den bästa koncentrationen för det biotinmärkta antigenet och det Ru Sulfo-NHS-märkta antigenet med högre förhållandevärden och lägre bakgrund för det negativa kontrollprovet. De optimala arbetskoncentrationerna av biotin och Ru Sulfo-NHS-märkt antigenprotein visas nedan: 16,0 ng / ml och 8,0 ng / ml för GAD65, 18,8 ng / ml och 9,4 ng / ml för SARS-CoV-2 RBD, 42,0 ng / ml och 42,0 ng / ml för IA-2, 60,0 ng / ml och 60,0 ng / ml för tTG, 4,2 ng / ml och 4,2 ng / ml för ZnT8, och 31.3 ng / ml och 31.3 ng / ml för proinsulin.</li>
</ol>4. Skapa linker-kopplad antigenlösning
<ol><li>Späd de biotin- och Ru Sulfo-NHS-märkta antigenerna med 5% BSA till de optimala arbetskoncentrationerna enligt steg 3.9.</li>
	<li>Bind förvalda länkar till varje biotinylerat antigenprotein. För en 96-brunns plattanalys, tillsätt 4 μL biotinylerad GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 och proinsulinantigenprotein i ett separat rör innehållande 156 μL 1% BSA och blanda med 240 μL motsvarande streptavidinkonjugerade länkar 1, 2, 3, 8, 9 och 10 (Figur 1). Inkubera blandningen i 30 minuter vid RT.</li>
	<li>Alikvotera 160 μl stopplösning i varje rör och inkubera blandningen vid RT i 30 minuter. Ta ut 400 μl av blandningslösningen från varje rör och kombinera dem tillsammans.</li>
	<li>Tillsätt 4 μL Ru Sulfo-NHS-märkt GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 och proinsulinantigen till blandningen ovan och tillsätt sedan 1,6 ml stopplösning och 3,2 ml 1x PBS och blanda. Nu är antigenlösningen klar för användning i analysen.</li>
</ol>5. Inkubera serumprover med det märkta antigenet
<ol><li>Alikvot 7 μL serum per brunn för en 96-brunns PCR-platta och täck med tätningsfilm. Förvärm serumet vid 56 °C i 30 minuter på en PCR-maskin. Centrifugera plattan kort vid 100 x g i 1 min.</li>
	<li>Tillsätt 63 μl antigenlösning (beredd i steg 4.4) per brunn och blanda med serumet. Täck PCR-plattan med tätningsfolie för att undvika ljus.</li>
	<li>Skaka plattan på en skakapparat vid 450 rpm vid RT i 2 timmar och inkubera sedan plattan vid 4 °C i 18–24 timmar.</li>
</ol>6. Förbered 6-Plex-plattan
<ol><li>Ta en 6-Plex-platta från 4 °C kylskåp, så att plattan kan komma till RT. Tillsätt 150 μL 3% Blocker A till varje brunn på 6-Plex-plattan.</li>
	<li>Sätt tillbaka plattan i 4 °C kylskåp, täck plattan med folie för att undvika ljus och inkubera över natten. OBS: Analyssteg i dag 1 inkluderar avsnitt 4.-6.</li>
</ol>7. Överför serum / antigeninkubat till 6-Plex-plattan
<ol><li>Nästa dag, ta den inkuberande 6-Plex-plattan från kylskåpet och dumpa all buffert ur plattan. Klappa tallriken på pappershanddukar för att torka ut.</li>
	<li>Tvätta 6-Plex-plattan 3x med 150 μL tvättbuffert per brunn varje gång. Torka plattan på pappershanddukar och alikvot serum/antigen inkuberas från varje brunn på den inkuberande PCR-plattan över natten i två brunnar på 6-Plex-plattan (30 μL per brunn för dubbletter).</li>
	<li>Täck plattan med folie, lägg sedan plattan på en tallriksskakare och skaka med en hastighet av 450 rpm vid RT i 1 h.</li>
</ol>8. Tvätta 6-Plex-plattan och lägg till läsbuffert
<ol><li>Dumpa lösningen i 6-Plex-plattan och tvätta plattan 3x med 150 μL 0,4 M NaCl tvättbuffert per brunn varje gång.</li>
	<li>När den tredje tvätten är klar, torka plattan mot pappershandduken och tillsätt 150 μL läsbuffert i varje brunn. OBS: Luftbubblor i brunnen påverkar plattläsarmaskinens noggrannhet och bör undvikas till varje pris.</li>
</ol>9. Läs plattan och analysera data
<ol><li>Räkna plattan på en elektrokemiluminescensanalysator. Läsresultaten kommer att presenteras med värdena i antal per sekund (CPS). Beräkna det relativa antikroppsindexet för varje prov med hjälp av den råa CPS som erhållits från avläsningsmaskinen mot CPS för de interna standardpositiva och negativa kontrollerna för varje specifik antikropp (indexvärde = [CPS (prov) - CPS (negativ standard)] / [CPS (positiv standard) - CPS (negativ standard)]).</li>
	<li>Bestäm negativa eller positiva antikroppsresultat med hjälp av de brytvärden som har fastställts vid 99,5: e till 99,8:e percentilerna av 555 negativa kontrollprover från ASK-studien (alla antikroppsnegativa prover utan historia eller familjehistoria av diabetes eller någon annan typ av autoimmun sjukdom). OBS: Analyssteg i dag 2 inkluderar avsnitt 7-9.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Group, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Environmental+Determinants+of+Diabetes+in+the+Young+(TEDDY)+Study.">The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY) Study.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1150, 1-13 (2008).</li><li>Vehik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+incidence+of+type+1+diabetes+in+0-+to+17-year-old+Colorado+youth.">Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth.</a> Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).</li><li>Insel, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+presymptomatic+type+1+diabetes:+a+scientific+statement+of+JDRF,+the+Endocrine+Society,+and+the+American+Diabetes+Association.">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li><li>Stahl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+screening+for+celiac+disease:+The+autoimmunity+screening+for+kids+study.">Mass screening for celiac disease: The autoimmunity screening for kids study.</a> The American Journal of Gastroenterology. 116 (1), 180-187 (2021).</li><li>Al-Hussaini, A., Sulaiman, N., Al-Zahrani, M., Alenizi, A., El Haj, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+celiac+disease+among+Saudi+children+with+type+1+diabetes:+A+prospective+cross-sectional+study.">High prevalence of celiac disease among Saudi children with type 1 diabetes: A prospective cross-sectional study.</a> BMC Gastroenterology. 12, 180 (2012).</li><li>Agardh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+features+of+celiac+disease:+A+prospective+birth+cohort.">Clinical features of celiac disease: A prospective birth cohort.</a> Pediatrics. 135 (4), 627-634 (2015).</li><li>COVID-19: Clinical manifestations and diagnosis in children. UpToDate Available from: <a target="_blank" href="https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print">https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print</a> (2021)</li><li>Barron, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+type+1+and+type+2+diabetes+with+COVID-19-related+mortality+in+England:+a+whole-population+study.">Associations of type 1 and type 2 diabetes with COVID-19-related mortality in England: a whole-population study.</a> The Lancet Diabetes &amp; Endocrinology. 8 (10), 813-822 (2020).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemiluminescence+assays+for+insulin+and+glutamic+acid+decarboxylase+autoantibodies+improve+prediction+of+type+1+diabetes+risk.">Electrochemiluminescence assays for insulin and glutamic acid decarboxylase autoantibodies improve prediction of type 1 diabetes risk.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).</li><li>Jia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+SARS-CoV-2+antibodies+in+children+and+adults+with+Type+1+diabetes.">Prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in children and adults with Type 1 diabetes.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 23 (7), 517-521 (2021).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multiplex+electrochemiluminescence+assay+applicable+to+general+population+screening+for+type+1+diabetes+and+celiac+disease.">High-throughput multiplex electrochemiluminescence assay applicable to general population screening for type 1 diabetes and celiac disease.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. , (2022).</li><li>McQueen, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+and+cost-effectiveness+of+large-scale+screening+for+type+1+diabetes+in+Colorado.">Cost and cost-effectiveness of large-scale screening for type 1 diabetes in Colorado.</a> Diabetes Care. 43 (7), 1496-1503 (2020).</li><li>Insel, R. A., Dunne, J. L., Ziegler, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+population+screening+for+type+1+diabetes:+has+its+time+come.">General population screening for type 1 diabetes: has its time come.</a> Current Opinion in Endocrinology &amp; Diabetes and Obesity. 22 (4), 270-276 (2015).</li><li>Ziegler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+Screen+ELISA+for+high-throughput+detection+of+beta+cell+autoantibodies+in+capillary+blood.">3 Screen ELISA for high-throughput detection of beta cell autoantibodies in capillary blood.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).</li><li>Cortez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+multiple+islet+autoantibodies+in+type+1+diabetes+using+small+sample+volumes+by+agglutination-PCR.">Sensitive detection of multiple islet autoantibodies in type 1 diabetes using small sample volumes by agglutination-PCR.</a> PLoS One. 15 (11), 0242049 (2020).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL-IAA+and+ECL-GADA+can+identify+high-risk+single+autoantibody-positive+relatives+in+the+TrialNet+pathway+to+prevention+study.">ECL-IAA and ECL-GADA can identify high-risk single autoantibody-positive relatives in the TrialNet pathway to prevention study.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinsulin/Insulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity.">Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes.">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk:+Nonradioactive+bivalent+proinsulin/insulin+autoantibody+assay.">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: Nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+sensitivity+and+earlier+identification+of+celiac+disease+autoimmunity+by+a+nonradioactive+assay+for+transglutaminase+autoantibodies.">Higher sensitivity and earlier identification of celiac disease autoimmunity by a nonradioactive assay for transglutaminase autoantibodies.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 2904563 (2016).</li><li>Jia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+ZnT8+autoantibodies+by+electrochemiluminescence+assay+improve+risk+prediction+for+type+1+diabetes.">High-affinity ZnT8 autoantibodies by electrochemiluminescence assay improve risk prediction for type 1 diabetes.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (12), 3455-3463 (2021).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete-panel+islet+autoantibody+multiplex+ECL+assay.">A complete-panel islet autoantibody multiplex ECL assay.</a> Diabetes. 70, 158 (2021).</li><li>Achenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+high-affinity+immune+responses+to+(pro)insulin+anticipate+the+autoimmune+cascade+that+leads+to+type+1+diabetes.">Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (4), 589-597 (2004).</li><li>Schlosser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+insulin-autoantibody-positive+children+from+the+general+population,+antibody+affinity+identifies+those+at+high+and+low+risk.">In insulin-autoantibody-positive children from the general population, antibody affinity identifies those at high and low risk.</a> Diabetologia. 48 (9), 1830-1832 (2005).</li><li>Mayr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD+autoantibody+affinity+and+epitope+specificity+identify+distinct+immunization+profiles+in+children+at+risk+for+type+1+diabetes.">GAD autoantibody affinity and epitope specificity identify distinct immunization profiles in children at risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 56 (6), 1527-1533 (2007).</li><li>Siljander, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+insulin+autoantibody+affinity+as+a+predictive+marker+for+type+1+diabetes+in+young+children+with+HLA-conferred+disease+susceptibility.">Role of insulin autoantibody affinity as a predictive marker for type 1 diabetes in young children with HLA-conferred disease susceptibility.</a> Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 25 (7), 615-622 (2009).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multiplexed+autoantibody+detection+to+screen+type+1+diabetes+and+multiple+autoimmune+diseases+simultaneously.">High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously.</a> Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).</li><li>Jia, X., He, L., Gu, Y., High, H., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+electrochemiluminescence+7-plex+assay+simultaneously+screening+for+type+1+diabetes+and+multiple+autoimmune+diseases.">A high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e61160 (2020).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Interventionen för T1D har gått in i pre-T1D-eran, med pågående nationella och internationella storskaliga screeningprogram för T1D och blomstrande kliniska prövningar som tillämpas i steg 1 T1D för att upphäva eller bromsa utvecklingen till klinisk T1D12,13. Mätningar av fyra IAbs med den nuvarande standarden RBA med ett enda IAb-analysformat är mödosamt och ineffektivt för ett massscreeningsprogram. Med den brådskande efterfrågan på en multiplexerad IAbs-analys med hög genomströmning har multiplexerad ECL-analys, 3-Screen ICA ELISA och antikroppsdetektering genom agglutination-PCR (ADAP) framträtt som för närvarande konkurrenskraftig teknik. I Fr1da-studien av screening för T1D hos en population av små barn i Tyskland användes 3-screen ICA ELISA som kombinerar 3 IAbs (GADA, IA-2A och ZnT8A) som huvudtest14. En stor begränsning av 3-Screen ICA ELISA är bristen på IAA, som oftast är den första IAb som uppträder med hög prevalens hos små barn med T1D. Dessutom kan analysen inte skilja vilken av de tre IAbs som är positiv från en positiv signal, och varje positivt prov måste upprepas med tre enkla analyser för bekräftelse. ADAP15 kombinerar GADA, IA-2A och IAA och illustrerade hög analyskänslighet och specificitet i IASP-workshopen men saknar data om hur prediktivt det är vid populationsbaserad screening för T1D-studier, vilket IASP-verkstaden inte kan fastställa. Multiplex ECL-analysen i den aktuella studien bygger på plattformen för en enda ECL-analys som har validerats mot nuvarande standard RBA i flera kliniska prövningar som TrailNet 9,16, DAISY17,18,19 och ASK 4,20,21 studera. Den aktuella analysen har validerats mot både RBA och single ECL-analys med 880 serumprover från deltagare i ASK-studien. Som visas i figur 2 och figur 3 var antikroppsnivåerna mellan 6-Plex och enstaka ECL eller mellan 6-Plex och RBA mestadels kongruenta med varandra för antikropparnas positivitet. Sammanträffandegraden för IAbs som testades av RBA och 6-Plex var 91,7% -97,8%, och sammanträffandegraden för IAbs som testades av enstaka ECL och 6-Plex var 95,3% -99,2%. Diskordinen mellan ECL-analysen och RBA var huvudsakligen från dem med enstaka IAb. Nivåerna av IAbs testade av 6-Plex och single ECL (r = 0,6431-0,9434, alla p < 0,0001) och 6-Plex och RBA (r = 0,5775-0,8576, alla p < 0,0001) var också väl korrelerade. TGA som testades med 6-Plex-analys var starkt korrelerad med resultaten från både RBA (99,4%) och enstaka ECL-analys (99,4%). Dessutom nådde COVID-19A som testades av 6-Plex 99.8% överensstämmelse med resultaten från den enda ECL-analysen.
Som ett resultat har 6-Plex ECL-analysen formellt accepterats som den primära screeningmetoden för den pågående ASK-studien och ersatt standard RBA22. Denna analys visade sin utmärkta känslighet och specificitet med högre genomströmning, lägre kostnad och mindre serumvolym jämfört med standard RBA.
Det har dokumenterats att i T1D-screeningstudien var enstaka IAb som upptäcktes av RBA, som tog upp en stor andel av IAb-positiviteter, av låg affinitet, med låg sjukdomsrisk och resulterade i totalt sett lågt prediktivt värde 19,21,23,24,25,26. En sådan låg riskprognos orsakade enorma extra kostnader för uppföljningsbesök och resulterade i svårigheter för T1D-förebyggande studier. Den etablerade ECL-analysplattformen har visats i flera kliniska prövningar för att skilja IAbs med hög affinitet från IAbs med låg affinitet som genereras av RBA och avsevärt förbättra de prediktiva värdena för alla fyra IAbs, särskilt med en enda IAb-positivitet16,17,18,21 . Multiplex ECL-analystekniken byggdes på plattformen för den enda ECL-analysen, med denna distinkta fördel av detekteringen av Abs med hög affinitet. I den aktuella studien illustrerade 6-Plex ECL-analysen dess likhet med motsvarande enda ECL-analyser i känslighet och specificitet.
Vissa begränsningar och de tekniska problemen med multiplex ECL-analys med flera Plex-plattor har redan behandlats i tidigare publikationer27,28. Med sex märkta antigener i en brunn kan det finnas vissa influenser mellan olika antigener, och analysbakgrunden kan öka när man lägger till varje antikroppsanalys för multiplexering i samma brunn. En stor mängd analysoptimeringsarbete behövs för att justera analysförhållandena, särskilt för att justera de slutliga koncentrationerna av varje märkt antigenprotein baserat på schackbrädets analys för varje antigen, för att bibehålla känsligheten och specificiteten för varje antikroppsanalys. Som nämnts i tidigare studier27,28 resulterar ett litet antal prover (<1%) i falsk positivitet på multipel Plex-plattan utan en tydlig bakomliggande orsak. Alla positiva resultat bör upprepas och bekräftas med en enda ECL-analys som rutinmässig kvalitetssäkring av laboratoriet. Vanligtvis tas de falska positiva bort från början. Falskt negativa resultat orsakade av "prozoneffekten" som observerades i den tidigare 7-Plex ECL-analysen27,28 observerades inte i den aktuella studien. I analysen som beskrivs här tog vi bort steget för syrabehandling av serumprover från det tidigare protokollet; Istället förvärmde vi serumproverna vid 56 °C i 30 minuter (steg 5.1.). På den andra dagen av platttvätt använde vi en tvättbuffert som innehåller 0,4 M NaCl (steg 8.1.) istället för vanlig tvättbuffert för att tvätta plattan strängare. Dessa modifieringar gjorde multiplex ECL-analysen enklare och lägre bakgrund utan att förlora analyskänsligheten.
Sammanfattningsvis har denna analys enastående prestanda för att upptäcka fyra IAbs, TGA och COVID-19A samtidigt. Multiplexeringsfunktionen, liksom kravet på hög genomströmning, låg kostnad och liten serumvolym, gör storskalig screening för T1D och samtidiga sjukdomar mycket mer genomförbar i den allmänna befolkningen. Patienter med T1D eller några autoimmuna sjukdomar har en mycket högre risk för andra autoimmuna sjukdomar. Multiplex ECL-analysen ger en utmärkt plattform för att screena för T1D och flera autoimmuna sjukdomar samtidigt.

Stora epidemiologiska studier över hela världen visar att förekomsten av typ 1-diabetes (T1D) har ökat snabbt med 3%-5% årligen, och förekomsten av T1D har fördubblats under de senaste 20 åren, särskilt hos små barn 1,2. Ö-autoantikroppar (IAbs) uppträder vanligtvis år före kliniska symtom och är för närvarande de mest tillförlitliga prediktiva och diagnostiska biomarkörerna för T1D3. Screening för T1D-autoantikroppar kan identifiera personer i riskzonen för att utvecklas till klinisk T1D, utbilda allmänheten, till stor del minska den livshotande komplikationen av ketoacidos och gynna kliniska prövningar för förebyggande terapier. Världsomspännande förebyggande insatser för T1D pågår och flera interventionsstudier genomförs bland patienter med IAbs positiva för att fördröja utvecklingen till klinisk T1D, och Barbara Davis Center for Diabetes lanserade den första amerikanska kliniska prövningen av screening i den allmänna befolkningen 2016 för T1D och celiaki, Autoimmunity Screening for the Kids (ASK)4 . Celiaki (CD) är en kronisk inflammatorisk tarmsjukdom relaterad till immun- och genetiska faktorer. Prevalensen av CD hos barn med T1D kan nå upp till 24,5%5. Mer än hälften av individer med CD kanske inte har typiska symtom vid presentation6, så serologisk screening för celiaki är helt nödvändig.
Sedan pandemin av coronavirussjukdom 2019 (COVID-19) startade har över 200 miljoner fall rapporterats globalt, och barn står för upp till 16% av laboratoriebekräftade fall7. Många studier har visat effekten av befintlig T1D på svårighetsgraden och dödsfallet av COVID-19-infektion8, medan effekten av COVID-19-infektion på T1D-utvecklingen inte är tydlig. Undersökningen av den totala frekvensen av COVID-19-infektion i den allmänna befolkningen genom bestämning av allvarliga akuta respiratoriska syndrom coronavirus 2 (SARS-COV-2) antikroppar och studien av sambandet mellan COVID-19-infektion och utlösande T1D-autoimmunitet eller accelererande T1D-progression är brådskande och mycket viktigt, medan den pågående ASK-studien är en utmärkt plattform för detta. På grund av det enda analysformatet och genereringen av en stor andel antikroppspositivitet med låg affinitet har standardradiobindningsanalysen (RBA) mött en flaskhals med låg effektivitet och låg sjukdomsspecificitet9. I detta dokument presenterar vi en ny 6-plexed elektrokemiluminescens (ECL) -analys byggd på vår tidigare multiplex ECL-analysplattform med hjälp av en multipel-Plex-platta, som kombinerar sex autoantikroppsanalyser i en enda brunn, inklusive alla fyra stora IAbs till insulin (IAA), glutaminsyradekarboxylas-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) och zinktransport-8 (ZnT8A), autoantikroppar mot transglutaminas (TGA) för celiaki, och SARS-CoV-2 receptorbindande domän (RBD) antikroppar (COVID-19A). Detta är den första multiplexanalysen som rekryterade en komplett panel med fyra stora IAbs och ytterligare kombinerade detta med TGA och COVID-19A. Det har validerats och formellt accepterats som det primära screeningverktyget som ersätter standard RBA i ASK-studien.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mM NaCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1070832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PI21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker A</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R93AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top 500 ml-Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974064A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAD65 protein</td>
			<td>Diamyd Medical</td>
			<td>10-65702-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IA-2 protein (aa 605-979)</td>
			<td>Creative BioMart</td>
			<td>283309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MESO QuickPlex SQ120</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R31QQ-3</td>
			<td>Electrochemiluminescence analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proinsulin protein</td>
			<td>AmideBio</td>
			<td>20160118B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer B</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0800019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 RBD protein</td>
			<td>Creative Biomart</td>
			<td>Spike-190V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Y0090019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-TAG</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tTG protein</td>
			<td>Diarect AG</td>
			<td>15201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Plex 6-Assay SECTOR plate</td>
			<td>MSD</td>
			<td>Z00U0142E</td>
			<td>6-plex plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 1</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 10</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 2</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0020015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 3</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0030018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 8</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0080018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PLEX Linker 9</td>
			<td>MSD</td>
			<td>L0090014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeBa Column</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89892</td>
			<td>Spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnT8 protein</td>
			<td>Research Laboratory</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput multiplexed screening for type 1 diabetes, celiac diseases, and covid-19

En pågående klinisk studie, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), är den första screeningstudien i den allmänna befolkningen för typ 1-diabetes (T1D) och celiaki i USA. Med coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) pandemi behövs epidemiologin för COVID-19 i den allmänna befolkningen och kunskap om sambandet mellan COVID-19-infektion och T1D-utveckling. Den för närvarande standardiserade screeningmetoden för radiobindande analys (RBA) har mött två stora utmaningar: låg effektivitet med ett enda analysformat och låg sjukdomsspecificitet med en stor andel antikroppar med låg affinitet som genereras vid screening. Med plattformen för multiplex elektrokemiluminescens (ECL) -analysen som vi etablerade tidigare utvecklades en ny 6-Plex ECL-analys som kombinerar, i en enda brunn, alla fyra öautoantikroppar (IAbs) till insulin, glutaminsyradekarboxylas (GAD65), insulinomantigen 2 (IA-2) och zinktransportör 8 (ZnT8) för T1D, transglutaminasautoantikroppar (TGA) för celiaki och svår akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) receptorbindande domän (RBD) antikroppar för Covid-19. Analysen validerades i blinda med 880 prover från ASK-studien, inklusive 325 positiva prover och 555 alla antikroppsnegativa prover, och jämfördes med standard RBA och en enda ECL-analys. Med fördelarna med hög effektivitet, låg kostnad och låg serumvolym har denna analys accepterats som det primära screeningverktyget för ASK-studien.

Tabell 1, tabell 2 och tabell 3 illustrerar de representativa resultaten. Den råa CPS som erhålls från läsmaskinen illustreras i tabell 1. I tabell 2 ordnades och sorterades rå CPS efter de sex länkarna och motsvarande antikroppar. Tabell 3 visar de beräknade indexvärdena med CPS enligt beskrivningen i analysprotokollet. Alla råräkningsvärden bör kontrolleras för att undvika felaktiga slutliga indexresultat orsakade av dåliga dubbletter. I tabell 1 ges exempel på dåliga dubbletter, vilket resulterade i ett fel för den slutliga indexberäkningen i tabell 3.
Denna analys validerades på ett blindt sätt med hjälp av 880 utvalda prover från ASK-studien med 325 IAbs positiva prover och 555 alla Abs-negativa prover. Nivåerna av autoantikroppar från 6-Plex ECL-analys för 880-proverna jämfördes punkt för punkt med nivåerna för motsvarande enskilda ECL-analyser (figur 2) och med motsvarande enda standard RBA (figur 3). Brytpunkten, känsligheten och specificiteten för varje antikropp anges i tabell 4. Känsligheten och specificiteten hos denna ECL-COVID-19A-analys har identifierats som 100% respektive 99,9%10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig01.jpg"> Bild 1: Illustration av 6-Plex ECL-analysen. Serumautoantikroppar gör anslutningen av det Ru Sulfo-NHS-märkta antigenet till det biotinylerade antigenet, som är kopplat till en specifik länkare och bildar ett komplex av antigen-antikropp-antigen-linker. Komplexen fångas genom varje specifik länkare på de specifika fläckarna i 6-Plex-plattan. För varje antigen tilldelades de specifika länknummeren: GAD-linker-1, Covid-19-linker-2, IA-2-linker-3, tTG-linker-8, ZnT8-linker-9 och Proinslulin-linker-10. Denna siffra har modifierats med tillstånd från He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig02.jpg"> Figur 2: Jämförelse av sex antikroppsnivåer i 880 prover från ASK-studien mellan den enda ECL-analysen och 6-Plex ECL-analysen. Panelerna visar jämförelser av antikroppsnivåer för GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA respektive COVID-19A (index för COVID-19A presenterades som (100 x beräknat indexvärde)). De streckade linjerna representerar analysavgränsningarna för varje antikroppsanalys. Denna siffra har modifierats med tillstånd från He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63787/63787fig03.jpg"> Figur 3: Jämförelse av fem antikroppsnivåer i 880 prover från ASK-studien mellan RBA och 6-Plex ECL-analysen. Panelerna visar jämförelser av antikroppsnivåer för GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A respektive TGA. De streckade linjerna representerar analysavgränsningarna för varje antikroppsanalys. Denna siffra har modifierats med tillstånd från He et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/63787fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Tabell 1: Antal obehandlade CPS (vänstra halvan av plattan). Rå CPS-räkning förvärvad från den vänstra halvan av en analysplatta. Varje prov utförs i två exemplar. Varje CPS-antal i samma kolumn (A1, A2, A3, etc.) representerar läsdata från de 10 platserna i samma brunn (motsvarande länknummer är markerade). Exempel på dåliga dubbletter markeras med grått, vilket visas i rad D-linker 3 kolumn 5 och kolumn 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%201.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Tabell 2: Sammanställning av tabell 1-data, sorterade med sex länkar. CPS-värden från tabell 1 ordnades om, beräknade medelvärdena för dubbla avläsningar av CPS och tog bort oanvända värden för länkare 4-7. Värdena för den interna standarden hög positiv, låg positiv och negativ kontroll för varje autoantikroppsanalys är markerade med mörk fetstil. PC, positiv kontroll. NC, negativ kontroll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%202.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Tabell 3: Resultat av indexvärden. Indexvärdena för varje prov för alla sex antikropparna beräknades mot motsvarande positiva och negativa kontroller. Ett indexvärde som var större än brytpunkten definierades som positivt, markerat med mörk fetstil. De dåliga duplicerade CPS-värdena i tabell 1, rad D-linker 3-kolumnerna 5 och 6, ledde till ett positivt IA-2A-indexvärde för prov 11 (markerat med grått), vilket förmodligen var ett falskt positivt resultat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table_3.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Tabell 4: Analysavgränsning, känslighet och specificitet för GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA och TGA bland 880 ASK-prover, inklusive 325 IAbs positiva prover och 555 alla antikroppsnegativa prover. Det optimala cutoff-indexvärdet för GADA-, IA-2A-, ZnT8A-, IAA- och TGA-analysen sattes till minst den 99:e percentilen av de 555 normala kontrollproverna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63787/Table%204.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19 at JoVE.com

A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19

I linje med det akuta behovet av screening för typ 1-diabetes, celiaki och coronavirussjukdom 2019 utvecklade vi en 6-Plex elektrokemiluminescensanalys med hög genomströmning för att samtidigt upptäcka alla fyra ö-autoantikroppar, vävnadstransglutaminasautoantikroppar och antikroppar mot receptorbindningsdomänen för allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2.

En multiplexerad screening med hög genomströmning för typ 1-diabetes, celiaki och COVID-19

An ongoing clinical trial, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), is the first screening study in the general population for type 1 diabetes (T1D) and ...

Den nya 6-Plex ECL-analysen är den första multiplexanalysen som validerats och nu tillämpas i klinisk prövning för screening av allmän population. Den kombinerar samtidigt sex autoantikroppsanalyser som är lämpliga för screening av typ 1-diabetes, celiaki och COVID-19 i en stor befolkning. Jämfört med den nuvarande standardanalysen av autoantikroppar kan denna teknik mer effektivt screena flera autoantikroppar för flera autoimmuna sjukdomar samtidigt.Implikationen av denna teknik kommer att göra storskalig screening mer genomförbar och sjukdomsspecifik, vilket leder till tidig sjukdomsförutsägelse för förebyggande och mer exakt diagnos för terapi. Till att börja med, tillsätt fyra mikroliter biotinylerade GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 och proinsulinantigenprotein i ett rör som innehåller 156 mikroliter 1% BSA och blanda med 240 mikroliter motsvarande streptavidinkonjugerade länkar, 1, 2, 3, 8, 9 och 10. Inkubera sedan blandningen i 30 minuter vid rumstemperatur.Alikvotera 160 mikroliter stopplösning i varje rör och inkubera blandningen vid rumstemperatur i 30 minuter. Ta nu 400 mikroliter av blandningslösningen från varje rör och kombinera dem tillsammans. Tillsätt fyra mikroliter ruteniummärkt GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 och proinsulinantigen till blandningen.Tillsätt sedan 1,6 ml stopplösning och 3,2 ml PBS. Blanda alla komponenter noggrant. Och nu är antigenlösningen klar för användning i analysen.För en PCR-platta med 96 brunnar, alikvotera sju mikroliter serum per brunn och täck plattan med en tätningsfilm. Förvärm sedan serumet vid 56 grader Celsius i 30 minuter på en PCR-maskin och centrifugera plattan kort vid 100 gånger G i en minut. Tillsätt 63 mikroliter beredd antigenlösning per brunn, blanda med serumet och täck PCR-plattan med tätningsfolie för att undvika ljus.Skaka plattan på en shaker med en hastighet av 450 rpm i två timmar vid rumstemperatur. Och inkubera sedan plattan vid fyra grader Celsius i 18 till 24 timmar. Ta en 6-Plex-platta från kylskåpet med fyra grader Celsius, så att plattan kan komma till rumstemperatur.Tillsätt sedan 150 mikroliter 3% Blocker A till varje brunn på 6-Plex-plattan. Täck plattan med folie för att undvika ljus. Sätt tillbaka plattan i ett fyra graders Celsius kylskåp och inkubera över natten.I slutet av inkubationen, när plattan har tagits bort från kylskåpet, ta bort all buffert från plattan. Klappa tallriken på pappershanddukarna för att torka ut och tvätta den tre gånger med 150 mikroliter tvättbuffert per brunn varje gång. Torka plattan på pappershandduken och alikvotera 30 mikroliter serumantigen inkubera från varje brunn på den inkuberande PCR-plattan över natten i två brunnar på 6-Plex-plattan.Täck plattan med folie, lägg sedan plattan på en tallriksskakare och skaka med en hastighet av 450 rpm vid rumstemperatur i en timme. Dumpa lösningen som finns i 6-Plex-plattan och tvätta plattan tre gånger med 150 mikroliter 0,4 M natriumkloridtvättbuffert per brunn. När den tredje tvätten är klar, torka plattan mot pappershandduken och tillsätt 150 mikroliter läsbuffert i varje brunn.Nivåerna av sex autoantikroppar för GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA och COVID-19A från 6-Plex ECL-analysen var väl korrelerade med motsvarande sex enda ECL-analyser och den nuvarande standardradiobindande analysen. Indexvärdena för varje prov för alla sex antikropparna beräknades mot motsvarande positiva och negativa kontroller. Ett indexvärde som var större än brytvärdet observerades, vilket indikerade ett positivt resultat.Autoantikroppar i serum bröt det ruteniummärkta antigenet till det biotinylerade antigenet och bildade ett komplex med en specifik länkare för att bygga en multiplexeringsplattform. Denna taktik gör den storskaliga screeningen mer genomförbar och effektivare i den allmänna befolkningen för typ ett-diabetes och samtidiga sjukdomar, vilket leder till tidig förutsägelse och förebyggande av sjukdomarna.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Accelerated Type 1 Diabetes induktion i möss genom adoptiv överföring av diabetogen CD4 + T-celler

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fenotypisk analys för kvantifiering av intracellulär mykobakteri anpassad för screening med högt genomströmning/högt innehåll

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening för brett spektrum kemiska inhibitorer av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Inrättandet av en hög kapacitet Setup för screening av små molekyler som modulerar c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

En fluorescensbaserade lymfocyter analys Lämplig för high-throughput screening av små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Cell-free biokemiska Fluorometric enzymatisk analys för High-throughput mätning av lipidperoxidation i hög Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

En hög genomströmning Cre-Lox aktiveras Viral membran Fusion analys för att identifiera hämmare av HIV-1 Viral membran Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En hög genomströmning plattform för Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En hög genomströmning Shigella-specifika bakteriedödande analysmetod

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

En avancerad murine modell för alkoholfria Steatohepatit i samband med typ 2 diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...