يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة للمرور الخالي من الإنزيم للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات المزروعة على الخلايا المغذية. ميزة هذا البروتوكول هي أنه لا يتطلب وسائط استزراع خالية من التغذية مكلفة وركائز نمو ، ويتجنب خطر التفكك الكامل بواسطة الإنزيمات ، ويقلل من خطر انتقال الخلايا الجذعية إلى حالة مهيأة. وسيقوم بتوضيح الإجراء هيج برينكر فجيردينجستاد، المدير اليومي للمنشأة الأساسية النرويجية للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.
لبدء البذور 0.5 × 10 المرفوعة إلى قوة 6 خلايا ليفية بشرية ، يشار إليها فيما يلي باسم الخلايا المغذية ، في قارورة ثقافة T 75 مع 20 ملليلتر من IMDM تحتوي على 10٪ FBS ، يشار إليها فيما يلي باسم وسط الخلية المغذية. عندما تصل الخلايا المغذية إلى التقاء 90٪ ، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 10 ملليلتر من DPBS لتجنب تثبيط التربسين بواسطة عوامل في الوسط. أضف ملليلتر من التربسين EDTA إلى القارورة واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس دقائق تقريبا ، مع مراقبة انفصال الخلايا المغذية بالعين المجردة.
بمجرد بدء الانفصال ، استمر في مراقبة تفكك الخلايا تحت المجهر للتأكد من أن جميع الركام يتم فصلها إلى خلايا مفردة. بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من وسط خلية التغذية الطازجة التي تم تسخينها مسبقا إلى القارورة لتعطيل Trypsin-EDTA وتعليق خلايا التغذية برفق عن طريق الماصة. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر ، ثم قم بتغطية الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي عند 200 جرام لمدة 5 دقائق.
قم بإزالة الشبع بعناية دون إزعاج الحبيبات وأعد تعليقه في أربعة ملليلتر من وسط خلية التغذية الطازجة. بعد التأكد من إعادة تعليق الخلايا المغذية تماما ، قم بحسابها باستخدام غرفة عد الخلايا وحساب عدد الخلايا المطلوبة لزراعة HSCs و HI PSCs على أطباق زراعة الأنسجة 35 ملم. بعد إجراء الاعتقال الانقسامي عن طريق تشعيع جاما ، قم بنقل العدد المناسب من خلايا التغذية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر وأضف وسط خلية التغذية إلى حجم إجمالي قدره خمسة ملليلتر.
نقل على الفور في درجة حرارة الغرفة إلى آلة تشعيع جاما وتشعيع لاعتقال الخلايا الانقسامية. بمجرد إيقاف الخلايا المغذية انقساميا تحت غطاء زراعة الأنسجة ، أعد تعليق الخلايا في وسط الخلية المغذية للحصول على تركيز خلية 1.5 × 10 مرفوعا إلى القوة 5 لكل ملليلتر. أضف 2 ملليلتر من تعليق خلية التغذية إلى طبق 35 ملم وانقل الطبق إلى 37 درجة مئوية وحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪.
للتوزيع المتساوي للخلايا ، حرك الطبق ببطء ولكن بحزم على رف الحاضنة للأمام والخلف. ثم توقف مؤقتا وقم بتنفيذ نفس الإجراء من اليسار إلى اليمين قبل إغلاق باب الحاضنة. بعد 24 ساعة ، استبدل وسط خلية التغذية ب IMDM الذي يحتوي على استبدال مصل 10٪.
من طبق الاستزراع الذي يحتوي على خلايا مغذية تم إيقافها ميتوتيا ، استبدل IMDM الذي يحتوي على 10٪ وسط استبدال المصل ب 1.2 ملليلتر من وسط HESC الذي تم تسخينه مسبقا والذي يحتوي على عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي أو BFGF ، قبل 30 دقيقة من نقل المستعمرات. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط من طبق استزراع يحتوي على HSCs أو HI PSCs واغسل المستعمرات بمليلتر واحد من DPBS ، لإزالة الخلايا غير المرتبطة وحطام الخلايا. أضف ملليلتر واحد من 0.5 مليمول EDTA واحتضانه لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية.
ثم باستخدام ماصة ملليلتر واحدة ، استبدل محلول EDTA بمليلتر واحد من وسط HESC يحتوي على BFGF. قم بالسحن برفق باستخدام نفس الماصة لتحرير المستعمرات من طبقة الخلية المغذية حتى ترتخي الطبقة وتطوى على نفسها في كتلة منفصلة. ادفع طبقة خلية التغذية إلى حافة بئر الثقافة بطرف ماصة.
باستخدام ماصة ملليلتر جديدة ، انقل المستعمرات المعلقة إلى طبق استزراع جديد مع خلايا مغذية ووسط HESC يحتوي على BFGF ، وينقسم بنسبة واحد إلى خمسة. نقل الطبق إلى حاضنة وتحريكه برفق من جانب إلى آخر لتسهيل التوزيع المتساوي للمستعمرات. كانت مستعمرات HESC التي تم حصادها باستخدام EDTA أكثر تجانسا في الحجم والشكل من تلك التي تم حصادها ميكانيكيا.
كانت كثافة الخلايا في المستعمرات المحصودة والمعاد طلاؤها مماثلة للحصاد القائم على EDTA والحصاد الميكانيكي. كان لدى المستعمرات التي تم حصادها ميكانيكيا ميل أكبر لتطوير النخر في مناطقها الوسطى ، في حين أظهرت المستعمرات التي تم حصادها باستخدام EDTA مظهرا شفافا مع حواف مميزة. أظهر تحليل QPCR تعبيرا مستقرا عن علامة الجذعية في mRNA للمستعمرات التي تم الحصول عليها بعد 20 ممرا باستخدام الحصاد الميكانيكي أو القائم على EDTA.
تم إجراء ملاحظات مماثلة مع تلطيخ كيميائي مناعي عند مستويات البروتين للمستعمرات التي تم الحصول عليها بعد 20 ممرا باستخدام الحصاد الميكانيكي أو القائم على EDTA. احتوت الأجسام الجنينية المتولدة من HSCs التي تم الحصول عليها بعد 20 ممرا باستخدام أي من الطريقتين على خليط من الخلايا التي تعبر عن علامات تم تقييمها بشكل شائع للأديم الظاهر والأديم المتوسط والأدوم الباطن. علاوة على ذلك ، أظهر التحليل الجيني القائم على QPCR للانحرافات الجينومية الشائعة انحرافا متواضعا عن نمط كروموسومي مرجعي ثنائي الصبغيات.
من المهم الحد من التعرض ل EDTA لمدة دقيقة واحدة. يمكن أن يؤدي التعرض لفترة أطول إلى الكثير من التفكك. من المهم أيضا سحب طبقة الخلايا المغذية جانبا جيدا حتى لا تكون في الطريق عند نقل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان إلى طبق مزرعة جديد.
يعد الانتقال إلى الثقافة والظروف الخالية من الأعلاف حيث يشيع استخدام EDTA لمسببات الأمراض أمرا بسيطا ولا نغير في كيفية معالجة الخلايا.
