Denne protokol giver en hurtig, omkostningseffektiv metode til enzymfri passage af humane pluripotente stamceller dyrket på fødeceller. Fordelen ved denne protokol er, at den ikke kræver dyre fødefrie dyrkningsmedier og vækstsubstrater, undgår risikoen for fuld dissociation af enzymer og mindsker risikoen for, at stamceller overgår til en primet tilstand. Hege Brincker Fjerdingstad, daglig leder af den norske kernefacilitet for humane pluripotente stamceller, vil demonstrere proceduren.
For at begynde frø 0,5 x 10 hævet til kraften 6 humane fibroblaster, i det følgende benævnt fødeceller, i en T 75 dyrkningskolbe med 20 ml IMDM indeholdende 10% FBS, i det følgende benævnt fødecellemedium. Når fødecellerne har nået 90% sammenløb, skal du fjerne mediet og vaske cellerne tre gange med 10 ml DPBS for at undgå hæmning af trypsin af faktorer i mediet. Tilsæt to ml trypsin EDTA til kolben og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i ca. fem minutter, mens du observerer frigørelsen af fødercellerne med det blotte øje.
Når frigørelsen begynder, skal du fortsætte med at observere dissociationen af cellerne under et mikroskop for at sikre, at alle aggregater dissocieres i enkeltceller. Derefter tilsættes fem ml frisk, forvarmet fødecellemedium til kolben for at inaktivere Trypsin-EDTA og suspender forsigtigt fødercellerne ved pipettering. Overfør cellesuspensionen til et 15 ml rør, dæk derefter røret og centrifuger ved 200 G i 5 minutter.
Fjern forsigtigt satinen uden at forstyrre pelleten og opslæft den igen i fire ml frisk fødecellemedium. Efter at have sikret, at føderceller er grundigt resuspenderet, tælles de ved hjælp af et celletællingskammer og beregnes antallet af celler, der kræves til dyrkning af HSC'erne og HI PSC'erne på 35 millimeter vævskulturskåle. Ved siden af at udføre mitotisk anholdelse ved gammabestråling overføres det passende antal fødeceller til et 50 ml centrifugerør og tilsættes fødecellemedium til et samlet volumen på fem ml.
Transport straks ved stuetemperatur til en gammabestrålingsmaskine og bestråle for at arrestere cellerne mitotisk. Når fødecellerne er mitotisk arresteret under en vævskulturhætte, skal du resuspendere cellerne i fødecellemediet for at opnå en cellekoncentration på 1,5 x 10 hævet til effekten 5 pr. Milliliter. Tilsæt 2 ml af fødecellesuspensionen til en 35 millimeter skål og overfør skålen til 37 grader Celsius og 5% kuldioxidinkubator.
For jævn fordeling af celler skal du flytte skålen langsomt men fast på inkubatorhylden frem og tilbage. Derefter pause og udfør den samme handling fra venstre mod højre, før du lukker inkubatordøren. Efter 24 timer udskiftes fødecellemediet med IMDM, der indeholder 10 % serumudskiftning.
Fra dyrkningsskålen, der indeholder mitotisk arresterede fødeceller, udskiftes IMDM indeholdende 10% serumerstatningsmedium med 1,2 ml forvarmet HESC-medium indeholdende basisk fiberblastvækstfaktor eller BFGF, 30 minutter før overførsel af kolonier. Fjern derefter mediet fra en kulturskål, der indeholder HSC'er eller HI PSC'er, og vask kolonierne med en milliliter DPBS for at fjerne ikke-bundne celler og celleaffald. Tilsæt en milliliter 0,5 millimolær EDTA og inkuber i et minut ved 37 grader Celsius.
Brug derefter en milliliter pipette til at erstatte EDTA-opløsningen med en milliliter HESC-medium indeholdende BFGF. Triturer forsigtigt med den samme pipette for at frigøre kolonierne fra fødecellelaget, indtil laget løsner sig og foldes på sig selv i en separat klump. Skub fødecellelaget til kanten af kulturbrønden med en pipettespids.
Brug en ny milliliter pipette til at overføre de suspenderede kolonier til en ny kulturskål med føderceller og HESC-medium indeholdende BFGF, opdeling i et forhold på en til fem. Overfør skålen til en inkubator og flyt den forsigtigt fra side til side for at lette den jævne fordeling af kolonier. HESC-kolonierne høstet ved hjælp af EDTA var mere homogene i størrelse og form end dem, der blev høstet mekanisk.
Celletætheden i de høstede og genbelagte kolonier var ens for EDTA-baseret høst og mekanisk høst. De mekanisk høstede kolonier havde en større tendens til at udvikle nekrose i deres centrale regioner, mens kolonier høstet ved hjælp af EDTA udviste et gennemskinneligt udseende med forskellige kanter. QPCR-analyse viste et stabilt udtryk for stammemarkør ved mRNA'et for kolonierne opnået efter 20 passager ved anvendelse af mekanisk eller EDTA-baseret høst.
Lignende observationer blev foretaget med immunokemisk farvning ved proteinniveauer for kolonierne opnået efter 20 passager ved anvendelse af mekanisk eller EDTA-baseret høst. Embryoidlegemer genereret fra HSC'erne opnået efter 20 passager ved hjælp af begge metoder indeholdt en blanding af celler, der udtrykte almindeligt vurderede markører for ektoderm, mesoderm og endoderm. Endvidere udviste QPCR-baseret genetisk analyse af almindelige genomiske aberrationer beskeden afvigelse fra et diploid kromosomalt referencemønster.
Det er vigtigt at begrænse EDTA-eksponeringen til et minut. Længere eksponering kan føre til for meget dissociation. Det er også vigtigt at trække fødecellelaget godt til side, så det ikke er i vejen, når de menneskelige embryonale stamceller eller menneskeinducerede pluripotente stamceller overføres til en ny dyrkningsskål.
Overgangen til kultur og de foderfrie forhold, hvor EDTA almindeligvis anvendes til patogen, er ligetil, og vi ændrer os ikke i, hvordan cellerne behandles.