Ce protocole fournit une méthode rapide et rentable pour le passage sans enzyme de cellules souches pluripotentes humaines cultivées sur des cellules nourricières. L’avantage de ce protocole est qu’il ne nécessite pas de milieux de culture et de substrats de croissance coûteux sans nourrisseur, évite le risque de dissociation complète par les enzymes et diminue le risque de transition des cellules souches vers un état d’amorçage. Hege Brincker Fjerdingstad, responsable quotidien de la centrale norvégienne de cellules souches pluripotentes humaines, fera la démonstration de la procédure.
Pour commencer, la graine 0,5 par 10 a été élevée à la puissance 6 fibroblastes humains, ci-après dénommés cellules nourricières, dans un flacon de culture T 75 avec 20 millilitres d’IMDM contenant 10% de FBS, ci-après dénommé milieu de cellules nourricières. Lorsque les cellules nourricières ont atteint 90 % de confluence, retirez le milieu et lavez les cellules trois fois avec 10 millilitres de DPBS pour éviter l’inhibition de la trypsine par des facteurs présents dans le milieu. Ajoutez deux millilitres de trypsine EDTA dans le flacon et incubez à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant environ cinq minutes, tout en observant le détachement des cellules nourricières à l’œil nu.
Une fois le décollement commencé, continuez à observer la dissociation des cellules au microscope pour vous assurer que tous les agrégats sont dissociés en cellules individuelles. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de milieu de cellule nourricière frais et préchauffé dans le flacon pour inactiver la trypsine-EDTA et suspendez doucement les cellules nourricières par pipetage. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres, puis bouchez le tube et centrifugez à 200 G pendant 5 minutes.
Retirez délicatement l’état sans déranger la pastille et mettez-la en suspension dans quatre millilitres de milieu de cellule d’alimentation frais. Après s’être assuré que les cellules nourricières sont bien remises en suspension, comptez-les à l’aide d’une chambre de comptage cellulaire et calculez le nombre de cellules nécessaires à la culture des CSH et des CSP HI sur des boîtes de culture tissulaire de 35 millimètres. Ensuite, pour effectuer l’arrêt mitotique par irradiation gamma, transférez le nombre approprié de cellules nourricières dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et ajoutez le milieu de la cellule nourricière jusqu’à un volume total de cinq millilitres.
Transporter immédiatement à température ambiante vers un appareil d’irradiation gamma et irradier pour arrêter les cellules par mitotique. Une fois que les cellules nourricières sont arrêtées mitotiquement sous une hotte de culture tissulaire, suspendez à nouveau les cellules dans le milieu cellulaire nourricier pour obtenir une concentration cellulaire de 1,5 par 10 portée à la puissance 5 par millilitre. Ajoutez 2 millilitres de la suspension de cellules nourricières dans une boîte de 35 millimètres et transférez la boîte dans un incubateur à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone.
Pour une répartition uniforme des cellules, déplacez la boîte lentement mais fermement sur l’étagère de l’incubateur vers l’avant et vers l’arrière. Ensuite, faites une pause et effectuez la même action de gauche à droite avant de fermer la porte de l’incubateur. Après 24 heures, remplacer le milieu cellulaire nourricier par de l’IMDM contenant 10 % de sérum de remplacement.
À partir de la boîte de culture contenant des cellules nourricières arrêtées mitotiquement, remplacer l’IMDM contenant 10 % de milieu de remplacement du sérum par 1,2 millilitre de milieu HESC préchauffé contenant le facteur de croissance basique des fibres ou BFGF, 30 minutes avant le transfert des colonies. Ensuite, retirez le milieu d’une boîte de culture contenant des CSH ou des CSP HI et lavez les colonies avec un millilitre de DPBS, pour éliminer les cellules non attachées et les débris cellulaires. Ajouter un millilitre d’EDTA de 0,5 millimolaire et incuber pendant une minute à 37 degrés Celsius.
Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, remplacez la solution d’EDTA par un millilitre de milieu HESC contenant du BFGF. Triturer doucement avec la même pipette pour libérer les colonies de la couche de cellules nourricières jusqu’à ce que la couche se détache et se replie sur elle-même en un amas séparé. Poussez la couche de cellules nourricières jusqu’au bord du puits de culture à l’aide d’une pointe de pipette.
À l’aide d’une nouvelle pipette d’un millilitre, transférez les colonies en suspension dans une nouvelle boîte de culture avec des cellules nourricières et un milieu HESC contenant du BFGF, en les divisant dans un rapport de un à cinq. Transférez le plat dans un incubateur et déplacez-le doucement d’un côté à l’autre pour faciliter la répartition uniforme des colonies. Les colonies HESC récoltées à l’aide de l’EDTA étaient plus homogènes en taille et en forme que celles récoltées mécaniquement.
La densité cellulaire dans les colonies récoltées et replaquées était similaire pour la récolte à base d’EDTA et la récolte mécanique. Les colonies récoltées mécaniquement avaient une plus grande tendance à développer une nécrose dans leurs régions centrales, tandis que les colonies récoltées à l’aide d’EDTA présentaient un aspect translucide avec des bords distincts. L’analyse QPCR a montré une expression stable du marqueur de tige au niveau de l’ARNm pour les colonies obtenues après 20 passages par récolte mécanique ou basée sur l’EDTA.
Des observations similaires ont été faites avec la coloration immunochimique aux niveaux de protéines pour les colonies obtenues après 20 passages par récolte mécanique ou à base d’EDTA. Les corps embryoïdes générés à partir des CSH obtenues après 20 passages à l’aide de l’une ou l’autre méthode contenaient un mélange de cellules exprimant des marqueurs couramment évalués pour l’ectoderme, le mésoderme et l’endoderme. De plus, l’analyse génétique basée sur la QPCR des aberrations génomiques courantes a montré un écart modeste par rapport à un modèle chromosomique diploïde de référence.
Il est important de limiter l’exposition à l’EDTA à une minute. Une exposition plus longue peut entraîner une trop grande dissociation. Il est également important de bien écarter la couche de cellules nourricières afin qu’elle ne gêne pas le transfert des cellules souches embryonnaires humaines ou des cellules souches pluripotentes induites humaines dans une nouvelle boîte de culture.
La transition vers la culture et les conditions sans aliments où l’EDTA est couramment utilisé pour les agents pathogènes est simple et nous ne changeons aucun changement dans la façon dont les cellules sont traitées.
