このプロトコルは送り装置のセルで培養される人間の多能性幹細胞の酵素の自由なpassagingに速く、費用有効な方法を提供する。このプロトコルの利点は、高価なフィーダーフリーの培養培地や成長基質を必要とせず、酵素による完全な解離のリスクを回避し、幹細胞がプライミング状態に移行するリスクを減少させることです。この手順を実演するのは、ノルウェーのヒト多能性幹細胞コア施設のデイリーマネージャーであるHege Brincker Fjerdingstad氏です。
0.5×10の播種を開始するために、6つのヒト線維芽細胞(以下、フィーダー細胞と呼ぶ)をT75培養フラスコに10%FBSを含有する20ミリリットルのIMDMを入れたT75培養フラスコに入れ、以下、フィーダー細胞培地と呼ぶ。フィーダー細胞が90%コンフルエンスに達したら、培地を除去し、培地中の因子によるトリプシンの阻害を避けるために、10ミリリットルのDPBSで細胞を3回洗浄します。フラスコに2ミリリットルのトリプシンEDTAを加え、フィーダー細胞の剥離を肉眼で観察しながら、摂氏37度、二酸化炭素5%で約5分間インキュベートします。
剥離が始まったら、顕微鏡で細胞の解離を観察し続け、すべての凝集体が単一細胞に解離していることを確認します。次に、予熱した新鮮なフィーダーセル培地5ミリリットルをフラスコに加え、トリプシン-EDTAを不活性化し、ピペッティングでフィーダーセルを静かに懸濁させます。細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移し、チューブに蓋をして200 Gで5分間遠心分離します。
ペレットを乱すことなくサテを慎重に除去し、4ミリリットルの新鮮なフィーダーセル培地に再懸濁します。フィーダー細胞が完全に再懸濁されていることを確認した後、細胞計数チャンバーを使用してそれらをカウントし、35 mmの組織培養皿で造血幹細胞とHI PSCを培養するために必要な細胞数を計算します。次に、ガンマ線照射による有糸分裂停止を行うには、適切な数のフィーダー細胞を50ミリリットルの遠心チューブに移し、フィーダー細胞培地を合計5ミリリットルまで添加します。
直ちに室温でガンマ線照射機に輸送し、細胞を有糸分裂的に停止するように照射する。フィーダー細胞が組織培養フードの下で有糸分裂的に停止したら、フィーダー細胞培地に細胞を再懸濁して、1.5 x 10の細胞濃度を1ミリリットルあたり5の累乗にします。フィーダー細胞懸濁液2ミリリットルを35ミリメートルのディッシュに加え、ディッシュを摂氏37度、5%二酸化炭素インキュベーターに移します。
細胞を均等に分布させるには、インキュベーターの棚でディッシュをゆっくりと、しかししっかりと前後に動かします。次に、インキュベーターのドアを閉じる前に、一時停止して同じアクションを左から右に実行します。24時間後、フィーダー細胞培地を10%血清置換を含むIMDMと交換します。
有糸分裂的に停止したフィーダー細胞を含む培養皿から、コロニーの移植の30分前に、10%血清置換培地を含むIMDMを、塩基性ファイバーブラスト成長因子またはBFGFを含む1.2ミリリットルの予熱HESC培地と交換します。次に、造血幹細胞またはHI PSCを含む培養皿から培地を取り出し、1ミリリットルのDPBSでコロニーを洗浄して、付着していない細胞と細胞破片を除去します。1ミリリットルの0.5ミリモルEDTAを加え、摂氏37度で1分間インキュベートします。
次に、1ミリリットルのピペットを使用して、EDTA溶液をBFGFを含む1ミリリットルのHESC培地と交換します。同じピペットで静かにトリチュレーションし、フィーダー細胞層が緩んで別の塊に折りたたまれるまで、フィーダー細胞層からコロニーを解放します。フィーダー細胞層をピペットチップで培養ウェルの端に押し込みます。
新しい1ミリリットルのピペットを使用して、懸濁したコロニーをフィーダー細胞とBFGFを含むHESC培地を含む新しい培養皿に移し、1対5の比率で分割します。皿をインキュベーターに移し、コロニーの均等な分布を容易にするために左右に静かに動かします。EDTAを用いて採取したHESCコロニーは、機械的に採取したものよりもサイズと形状が均質であった。
採取したコロニーと再播種したコロニーの細胞密度は、EDTAベースの採取と機械的採取で類似していました。機械的に採取されたコロニーは、その中央領域で壊死を発症する傾向が大きかったのに対し、EDTAを使用して採取されたコロニーは、明瞭なエッジを持つ半透明の外観を示しました。QPCR解析では、機械的またはEDTAベースのハーベスティングを使用して20継代後に得られたコロニーのmRNAでステムネスマーカーが安定して発現していることが示されました。
同様の観察は、機械的またはEDTAベースのハーベスティングを使用して20継代後に得られたコロニーのタンパク質レベルでの免疫化学的染色で行われました。いずれかの方法を用いて20回継代した後に得られた造血幹細胞から作製された胚様体には、外胚葉、中胚葉、および内胚葉について一般的に評価されるマーカーを発現する細胞の混合物が含まれていました。さらに、一般的なゲノム異常のQPCRベースの遺伝子解析では、参照二倍体染色体パターンからのわずかな逸脱が示されました。
EDTA への曝露を 1 分に制限することが重要です。長時間の曝露は、解離を過度に引き起こす可能性があります。また、ヒト胚性幹細胞やヒト人工多能性幹細胞を新しい培養皿に移す際に邪魔にならないように、フィーダー細胞層を脇に十分に引っ張ることも重要です。
EDTAが病原体に一般的に使用される培養および無飼料条件への移行は簡単で、細胞の処理方法に変更はありません。
