이 프로토콜은 공급세포에서 배양된 인간 만능 줄기세포의 효소 없는 패시징을 위한 빠르고 비용 효율적인 방법을 제공합니다. 이 프로토콜의 장점은 값비싼 피더가 없는 배양 배지 및 성장 기질이 필요하지 않고, 효소에 의한 완전 해리의 위험을 방지하며, 줄기 세포가 프라이밍된 상태로 전환될 위험을 줄인다는 것입니다. 인간 만능 줄기 세포를 위한 노르웨이 핵심 시설의 일일 관리자인 Hege Brincker Fjerdingstad가 절차를 시연할 것입니다.
종자 0.5 x 10을 10 % FBS를 함유 한 20 밀리리터의 IMDM (이하 공급 세포 배지라고 함)을 함유 한 T 75 배양 플라스크에서 6 인간 섬유 아세포, 이하 공급 세포라고 함으로 올렸습니다. 공급 세포가 90% 합류에 도달하면 배지를 제거하고 배지의 요인에 의한 트립신의 억제를 피하기 위해 10밀리리터의 DPBS로 세포를 세 번 세척합니다. 플라스크에 트립신 EDTA 2mL를 넣고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 약 5분 동안 배양하면서 육안으로 공급 세포의 분리를 관찰합니다.
분리가 시작되면 현미경으로 세포의 해리를 계속 관찰하여 모든 응집체가 단일 세포로 해리되는지 확인합니다. 다음으로, 5mL의 신선하고 예열된 피더 셀 배지를 플라스크에 추가하여 Trypsin-EDTA를 비활성화하고 피펫팅을 통해 피더 셀을 부드럽게 부유시킵니다. 셀 현탁액을 15mL 튜브에 옮긴 다음 튜브와 원심분리기를 200G에서 5분 동안 덮습니다.
펠릿을 방해하지 않고 세이트를 조심스럽게 제거하고 4ml의 신선한 공급 세포 배지에 다시 현탁시킵니다. 공급기 세포가 완전히 재현탁되었는지 확인한 후 세포 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수하고 35mm 조직 배양 접시에서 HSC 및 HI PSC를 배양하는 데 필요한 세포 수를 계산합니다. 다음으로 감마선 조사에 의한 유사분열 정지를 수행하기 위해 적절한 수의 공급세포를 50밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고 공급세포 배지를 총 부피 5밀리리터로 추가합니다.
즉시 실온에서 감마선 조사 기계로 운반하고 방사선을 조사하여 세포를 유사분열로 체포합니다. 공급세포가 조직 배양 후드 아래에서 유사분열적으로 포획되면, 공급세포 배지에 세포를 다시 현탁시켜 밀리리터당 5의 거듭제곱으로 상승된 1.5 x 10의 세포 농도를 얻습니다. 2mm 접시에 35mL의 피더 셀 현탁액을 넣고 접시를 섭씨 37도와 5% 이산화탄소 인큐베이터로 옮깁니다.
세포가 고르게 분포되도록 인큐베이터 선반에서 접시를 천천히 그러나 단단히 앞뒤로 움직입니다. 그런 다음 인큐베이터 도어를 닫기 전에 일시 중지하고 왼쪽에서 오른쪽으로 동일한 작업을 수행합니다. 24시간 후 공급세포 배지를 10% 혈청 교체가 포함된 IMDM으로 교체합니다.
유사분열적으로 정지된 공급세포가 포함된 배양 접시에서 콜로니 이동 30분 전에 10% 혈청 대체 배지를 함유한 IMDM을 염기성 섬유모세포 성장 인자 또는 BFGF를 함유한 1.2밀리리터의 예열된 HESC 배지로 교체합니다. 다음으로, HSC 또는 HI PSC가 포함된 배양 접시에서 배지를 제거하고 DPBS 1밀리리터로 콜로니를 세척하여 부착되지 않은 세포와 세포 파편을 제거합니다. 0.5 밀리몰 EDTA 1 밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 1 분 동안 배양합니다.
그런 다음 1밀리리터 피펫을 사용하여 EDTA 용액을 BFGF를 함유한 1밀리리터의 HESC 배지로 교체합니다. 동일한 피펫으로 부드럽게 삼중 작용하여 층이 느슨해지고 별도의 덩어리로 접힐 때까지 피더 세포 층에서 콜로니를 방출합니다. 피펫 팁을 사용하여 feeder cell 층을 배양 웰의 가장자리로 밀어 넣습니다.
새로운 1밀리리터 피펫을 사용하여 부유 콜로니를 1:5의 비율로 분할하여 BFGF를 함유한 공급 세포와 HESC 배지가 있는 새로운 배양 접시로 옮깁니다. 접시를 인큐베이터로 옮기고 콜로니가 고르게 분포되도록 좌우로 부드럽게 움직입니다. EDTA를 사용하여 수확한 HESC 콜로니는 기계적으로 수확한 콜로니보다 크기와 모양이 더 균질했습니다.
수확 및 재도금된 콜로니의 세포 밀도는 EDTA 기반 수확 및 기계적 수확에서 유사했습니다. 기계적으로 채취한 군체는 중앙 부위에 괴사가 발생하는 경향이 더 컸던 반면, EDTA를 사용하여 채취한 군체는 가장자리가 뚜렷한 반투명 모양을 보였습니다. QPCR 분석은 기계적 또는 EDTA 기반 수확을 사용하여 20회 통과 후 얻은 콜로니에 대한 mRNA에서 줄기 마커의 안정적인 발현을 보여주었습니다.
기계적 또는 EDTA 기반 수확을 사용하여 20회 통과 후 얻은 콜로니에 대해 단백질 수준에서 면역화학적 염색으로 유사한 관찰이 이루어졌습니다. 두 방법 중 하나를 사용하여 20회 통과 후 얻은 HSC에서 생성된 배아체에는 외배엽, 중배엽 및 내배엽에 대해 일반적으로 평가되는 마커를 발현하는 세포의 혼합물이 포함되어 있습니다. 또한, 일반적인 게놈 이상에 대한 QPCR 기반 유전자 분석은 참조 이배체 염색체 패턴에서 약간의 편차를 나타냈습니다.
EDTA 노출을 1분으로 제한하는 것이 중요합니다. 더 오래 노출되면 너무 많은 해리가 발생할 수 있습니다. 또한 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 유도 만능 줄기 세포를 새로운 배양 접시로 옮길 때 방해가 되지 않도록 공급 세포 층을 잘 옆으로 당기는 것이 중요합니다.
EDTA가 병원체에 일반적으로 사용되는 배양 및 사료가 없는 조건으로 전환하는 것은 간단하며 세포 처리 방법에는 변화가 없습니다.
