Этот протокол обеспечивает быстрый и экономичный метод безферментного пассирования плюрипотентных стволовых клеток человека, культивируемых на фидерных клетках. Преимущество этого протокола заключается в том, что он не требует дорогостоящих питательных свободных питательных питательных сред и субстратов для роста, позволяет избежать риска полной диссоциации ферментами и снижает риск перехода стволовых клеток в праймированное состояние. Эту процедуру продемонстрирует Хеге Бринкер Фьердингстад (Hege Brincker Fjerdingstad), ежедневный руководитель норвежского центра плюрипотентных стволовых клеток человека.
Для начала посев 0,5 на 10 поднимают до степени 6 человеческих фибробластов, далее именуемых фидерными клетками, в культуральную колбу Т 75 с 20 миллилитрами МВДМ, содержащего 10% FBS, далее именуемого питательной клеточной средой. Когда питательные клетки достигнут 90%-ного слияния, удалите среду и промойте клетки три раза 10 миллилитрами DPBS, чтобы избежать ингибирования трипсина факторами в среде. Добавьте в колбу два миллилитра трипсина ЭДТА и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5%-ном углекислом газе около пяти минут, наблюдая при этом за отслоением клеток-кормушки невооруженным глазом.
Как только начинается отслоение, продолжайте наблюдать за диссоциацией клеток под микроскопом, чтобы убедиться, что все агрегаты диссоциированы на отдельные клетки. Затем добавьте в колбу пять миллилитров свежей, предварительно подогретой питательной клеточной среды, чтобы инактивировать трипсин-ЭДТА, и осторожно подвешивайте питательные ячейки путем пипетирования. Перелейте клеточную суспензию в пробирку объемом 15 миллилитров, затем закройте пробирку крышкой и центрифугируйте при 200 г в течение 5 минут.
Осторожно удалите сате, не потревожив гранулу, и повторно суспендируйте ее в четырех миллилитрах свежей питательной ячеистой среды. Убедившись, что питательные клетки полностью ресуспендированы, подсчитайте их с помощью камеры подсчета клеток и рассчитайте количество клеток, необходимое для культивирования ГСК и ПСК HI на 35-миллиметровых чашках для культивирования тканей. Затем, чтобы выполнить митотическую остановку гамма-облучением, перенесите соответствующее количество питательных ячеек в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров и добавьте питательную клеточную среду до общего объема пять миллилитров.
Немедленно транспортируйте при комнатной температуре в установку гамма-облучения и облучают, чтобы митотически остановить клетки. После того, как питательные клетки митотически остановлены под колпаком тканевой культуры, повторно суспендируйте клетки в питательной клеточной среде, чтобы получить клеточную концентрацию 1,5 на 10, поднятую до степени 5 на миллилитр. Добавьте 2 миллилитра суспензии фидерных клеток в 35-миллиметровую чашку и перенесите чашку в 37 градусов Цельсия и 5%-ный инкубатор углекислого газа.
Для равномерного распределения клеток медленно, но твердо перемещайте чашку по полке инкубатора вперед и назад. Затем сделайте паузу и выполните то же действие слева направо, прежде чем закрыть дверцу инкубатора. Через 24 часа замените питательную клеточную среду на IMDM, содержащую 10%-ную замену сыворотки.
Из чашки для культивирования, содержащей митотически остановленные фидерные клетки, за 30 минут до переноса колоний замените ИМДМ, содержащий 10%-ную замещающую среду сыворотки, на 1,2 миллилитра предварительно подогретой среды HESC, содержащей основной фактор роста файбрбласта или BFGF. Затем извлеките среду из чашки для культивирования, содержащей ГСК или HI-ПСК, и промойте колонии одним миллилитром DPBS, чтобы удалить неприкрепленные клетки и клеточный мусор. Добавьте один миллилитр 0,5 миллимоляра ЭДТА и инкубируйте в течение одной минуты при температуре 37 градусов Цельсия.
Затем с помощью одной миллилитровой пипетки замените раствор ЭДТА одним миллилитром среды HESC, содержащей BFGF. Осторожно растирайте той же пипеткой, чтобы освободить колонии из слоя питательной клетки, пока слой не разрыхнится и не сложится в отдельный комок. Наконечником пипетки хорошо придвиньте слой питательной клетки к краю культуры.
С помощью новой пипетки объемом один миллилитр перенесите взвешенные колонии в новую культуральную чашку с питательными клетками и средой HESC, содержащей BFGF, расщепляя в соотношении один к пяти. Переложите посуду в инкубатор и аккуратно перемещайте ее из стороны в сторону, чтобы способствовать равномерному распределению пчелиных семей. Колонии HESC, собранные с помощью ЭДТА, были более однородными по размеру и форме, чем колонии, собранные механическим способом.
Плотность клеток в собранных и повторно покрытых колониях была одинаковой для сбора на основе ЭДТА и механического сбора. Механически собранные колонии имели большую склонность к развитию некроза в центральных областях, в то время как колонии, собранные с использованием ЭДТА, демонстрировали полупрозрачный вид с отчетливыми краями. Анализ КЦР показал стабильную экспрессию маркера стволовости на мРНК для колоний, полученных после 20 пассажей с использованием механического забора или забора на основе ЭДТА.
Аналогичные наблюдения были проведены с иммунохимическим окрашиванием на уровне белка для колоний, полученных после 20 пассажей, с использованием механического забора или забора на основе ЭДТА. Эмбриоидные тельца, полученные из ГСК, полученных после 20 пассажей с использованием любого метода, содержали смесь клеток, экспрессирующих обычно оцениваемые маркеры эктодермы, мезодермы и энтодермы. Кроме того, генетический анализ распространенных геномных аберраций на основе КПЦР показал умеренное отклонение от эталонного диплоидного хромосомного паттерна.
Важно ограничить воздействие ЭДТА одной минутой. Более длительная выдержка может привести к слишком сильной диссоциации. Также важно хорошо отодвинуть слой питающих клеток в сторону, чтобы он не мешал при переносе человеческих эмбриональных стволовых клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в новую культуральную чашку.
Переход к культуре и условиям, свободным от корма, где ЭДТА обычно используется для патогена, прост, и мы не меняем способ обработки клеток.
