Detta protokoll ger en snabb och kostnadseffektiv metod för enzymfri passage av humana pluripotenta stamceller odlade på feederceller. Fördelen med detta protokoll är att det inte kräver dyra odlingssubstrat och tillväxtsubstrat utan matare, undviker risken för fullständig dissociation av enzymer och minskar risken för att stamceller övergår till ett primat tillstånd. En av dem som demonstrerar proceduren är Hege Brincker Fjerdingstad, daglig chef för den norska core-faciliteten för humana pluripotenta stamceller.
Till att börja med utsäde 0,5 x 10 upphöjt till potensen 6 humana fibroblaster, nedan kallade matarceller, i en T 75-odlingskolv med 20 ml IMDM innehållande 10%FBS, nedan kallat matarcellmedium. När matarcellerna har nått 90 % sammanflöde, ta bort mediet och tvätta cellerna tre gånger med 10 milliliter DPBS för att undvika hämning av trypsin av faktorer i mediet. Tillsätt två milliliter trypsin EDTA i kolven och inkubera vid 37 grader Celsius och 5 % koldioxid i cirka fem minuter, samtidigt som du observerar hur matarcellerna lossnar med blotta ögat.
När avskiljningen börjar, fortsätt att observera dissociationen av cellerna under ett mikroskop för att säkerställa att alla aggregat är dissocierade i enstaka celler. Tillsätt sedan fem milliliter färskt, förvärmt matarcellmedium till kolven för att inaktivera trypsin-EDTA och suspendera försiktigt matarcellerna genom pipettering. Överför cellsuspensionen till ett 15 ml-rör, täck sedan röret och centrifugera vid 200 G i 5 minuter.
Ta försiktigt bort satelliten utan att störa pelleten och suspendera den igen i fyra milliliter färskt matarcellmedium. Efter att ha säkerställt att matarcellerna är ordentligt återsuspenderade, räkna dem med hjälp av en cellräkningskammare och beräkna antalet celler som krävs för att odla HSC och HI PSC på 35 millimeter vävnadsodlingsskålar. Därefter för att utföra mitotiskt stopp genom gammabestrålning, överför lämpligt antal matarceller till ett 50 ml centrifugrör och tillsätt matarcellmedium till en total volym på fem milliliter.
Transportera omedelbart vid rumstemperatur till en gammabestrålningsmaskin och bestråla för att stoppa cellerna mitotiskt. När matarcellerna mitotiskt har stoppats under en vävnadsodlingshuv, suspendera cellerna på nytt i matarcellmediet för att erhålla en cellkoncentration på 1,5 x 10 upphöjd till potensen 5 per milliliter. Tillsätt 2 milliliter av matarcellsuspensionen till en 35 millimeters skål och överför skålen till 37 grader Celsius och 5 % koldioxidinkubator.
För en jämn fördelning av cellerna, flytta skålen långsamt men bestämt framåt och bakåt på inkubatorhyllan. Pausa sedan och utför samma åtgärd från vänster till höger innan du stänger inkubatordörren. Efter 24 timmar byts matarcellmediet ut mot IMDM som innehåller 10 % serumersättning.
Från odlingsskålen som innehåller mitotiskt stoppade matarceller, byt ut IMDM som innehåller 10 % serumersättningsmedium mot 1,2 milliliter förvärmt HESC-medium som innehåller basisk fiberblasttillväxtfaktor eller BFGF, 30 minuter före överföringen av kolonier. Ta sedan bort mediet från en odlingsskål som innehåller HSC eller HI PSC och tvätta kolonierna med en milliliter DPBS för att avlägsna ofästa celler och cellrester. Tillsätt en milliliter 0,5 millimolar EDTA och inkubera i en minut vid 37 grader Celsius.
Använd sedan en milliliterpipett och ersätt EDTA-lösningen med en milliliter HESC-medium som innehåller BFGF. Triturera försiktigt med samma pipett för att frigöra kolonierna från matarcellskiktet tills lagret lossnar och veckar sig i en separat klump. Skjut matarcellskiktet till kanten av kulturbrunnen med en pipettspets.
Använd en ny pipett på en milliliter och överför de suspenderade kolonierna till en ny odlingsskål med matarceller och HESC-medium som innehåller BFGF, och dela i förhållandet ett till fem. Överför skålen till en inkubator och flytta den försiktigt från sida till sida för att underlätta en jämn fördelning av kolonierna. De HESC-samhällen som skördades med EDTA var mer homogena i storlek och form än de som skördades mekaniskt.
Celltätheten i de skördade och ompläterade samhällena var likartad för EDTA-baserad skörd och mekanisk skörd. De mekaniskt skördade kolonierna hade en större tendens att utveckla nekros i sina centrala regioner, medan kolonier som skördades med EDTA uppvisade ett genomskinligt utseende med tydliga kanter. QPCR-analys visade ett stabilt uttryck av stemnessmarkör vid mRNA för de samhällen som erhölls efter 20 passager med mekanisk eller EDTA-baserad skörd.
Liknande observationer gjordes med immunkemisk färgning vid proteinnivåer för de samhällen som erhölls efter 20 passager med mekanisk eller EDTA-baserad skörd. Embryoidkroppar som genererades från HSCs erhållna efter 20 passager med endera metoden innehöll en blandning av celler som uttryckte vanligt bedömda markörer för ektoderm, mesoderm och endoderm. Vidare uppvisade QPCR-baserad genetisk analys av vanliga genomiska avvikelser en blygsam avvikelse från ett diploidt kromosomalt referensmönster.
Det är viktigt att begränsa EDTA-exponeringen till en minut. Längre exponering kan leda till för mycket dissociation. Det är också viktigt att dra matarcellskiktet väl åt sidan så att det inte är i vägen när man överför de mänskliga embryonala stamcellerna eller de mänskliga inducerade pluripotenta stamcellerna till en ny odlingsskål.
Övergången till odling och de foderfria förhållanden där EDTA vanligtvis används för patogen är okomplicerad och vi ändrar inte hur cellerna behandlas.