Name: hydrogel arrays enable increased throughput for screening effects of matrix components and therapeutics in 3d tumor models
Uploaded: 2022-06-16T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models at JoVE.com

يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم على وجه التحديد لكارولين كيم وأميليا لاو وريان ستوتامور وإيتاي سولومون لمساهماتهم في التكرارات السابقة لمخطط التبشير الضوئي. تم توفير خطوط الخلايا GS122 و GS304 بسخاء من قبل ديفيد ناثانسون. تم إنشاء جميع الأرقام مع BioRender.com. وكانت المرافق الأساسية لجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس، والموارد المشتركة للفحص الجزيئي، ومختبر توصيف النانو وبيكو مفيدة في هذا العمل. تم دعم تشن شيا تشون من قبل جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس إيلي ومركز إديث برود للطب التجديدي وبرنامج التدريب على أبحاث الخلايا الجذعية. تم دعم Grigor Varuzhanyan من قبل برنامج التدريب على بيولوجيا الخلايا السرطانية NIH Grant (T32 CA 009056).

تم توفير خطوط خلايا GBM المشتقة من المريض (GS122 و GS304) من قبل البروفيسور ديفيد ناثانسون (المتعاون معنا) ، الذي طور هذه الخطوط بموجب بروتوكول معتمد من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (IRB # 10-000655). تم توفير خلايا غير محددة الهوية بحيث لا يمكن ربط خطوط الخلايا مرة أخرى بالم...

<ol>
	<li>Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosing+the+decline+in+pharmaceutical+R&amp;D+efficiency.">Diagnosing the decline in pharmaceutical R&amp;D efficiency.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+oncology+drugs+fail+to+gain+US+regulatory+approval.">Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).</li><li>Booth, B., Ma, P., Glassman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncology's+trials.+Market+indicators.">Oncology's trials. Market indicators.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).</li><li>Da Ros, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+chemoresistance:+The+double+play+by+microenvironment+and+blood-brain+barrier.">Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).</li><li>Broekman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+communication+in+the+microenvirons+of+glioblastoma.">Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).</li><li>Grundy, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+response+of+patient-derived+primary+glioblastoma+cells+to+environmental+stiffness.">Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).</li><li>Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+human+glioblastoma+cell+culture+system+for+modeling+drug+and+radiation+responses.">A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses.</a> Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).</li><li>Simoni, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+complexes+with+biological+activity.">Basement membrane complexes with biological activity.</a> Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-mimetic+3D+culture+platforms+allow+investigation+of+cooperative+effects+of+extracellular+matrix+features+on+therapeutic+resistance+in+glioblastoma.">Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma.</a> Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li><li>Spinelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+subtypes+and+differentiation+programmes+of+glioma+stem+cells+as+determinants+of+extracellular+vesicle+profiles+and+endothelial+cell-stimulating+activities.">Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).</li><li>Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBTRUS+statistical+report:+Primary+brain+and+other+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2014-2018.">CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018.</a> Neuro-Oncology. 23, (2021).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Brennan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+somatic+genomic+landscape+of+glioblastoma.">The somatic genomic landscape of glioblastoma.</a> Cell. 155 (2), 462-477 (2013).</li><li>Tomczak, K., Czerwi&#324;ska, P., Wiznerowicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Genome+Atlas+(TCGA):+An+immeasurable+source+of+knowledge.">The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge.</a> Contemporary oncology. 19, 68-77 (2015).</li><li>Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temozolomide+resistance+in+glioblastoma+multiforme.">Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme.</a> Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).</li><li>Joo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+orthotopic+glioblastoma+xenograft+models+recapitulate+the+histopathology+and+biology+of+human+glioblastomas+in+situ.">Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ.</a> Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).</li><li>Levy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+animal+as+models:+Ethical+considerations.">The use of animal as models: Ethical considerations.</a> International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).</li><li>Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitioning+preclinical+glioblastoma+models+to+clinical+settings+with+biomarkers+identified+in+3D+cell-based+models:+A+systematic+scoping+review.">Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+scaffolds+for+3D+culture+demonstrate+extracellular+matrix-mediated+mechanisms+of+chemotherapy+resistance+in+glioblastoma.">Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma.</a> Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).</li><li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening.">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744 (2020).</li><li>Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+evaluation.">Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).</li><li>Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic-acid+based+hydrogels+for+3-dimensional+culture+of+patient-derived+Glioblastoma+Cells.">Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).</li><li>Preston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestion+products+of+the+PH20+hyaluronidase+inhibit+remyelination.">Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination.</a> Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).</li><li>Kim, Y., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44-mediated+adhesion+to+hyaluronic+acid+contributes+to+mechanosensing+and+invasive+motility.">CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility.</a> Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).</li><li>Pibuel, M. A., Poodts, D., D&#237;az, M., Hajos, S. E., Lompard&#237;a, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scrambled+story+between+hyaluronan+and+glioblastoma.">The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma.</a> The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).</li><li>Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+the+glioblastoma+microenvironment+into+engineered+experimental+models.">Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models.</a> Future Science OA. 3 (3), (2017).</li><li>Trombetta-Lima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+proteome+remodeling+in+human+glioblastoma+and+medulloblastoma.">Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma.</a> Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).</li><li>Schregel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+glioblastoma+in+an+orthotopic+mouse+model+with+magnetic+resonance+elastography.">Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography.</a> NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).</li><li>Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic-acid+based+hydrogels+for+3-dimensional+culture+of+patient-derived+glioblastoma+cells.">Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).</li><li>Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=If+cell+mechanics+can+be+described+by+elastic+modulus:+Study+of+different+models+and+probes+used+in+indentation+experiments.">If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).</li><li>Sneddon, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relation+between+load+and+penetration+in+the+axisymmetric+boussinesq+problem+for+a+punch+of+arbitrary+profile.">The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile.</a> International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).</li><li>Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elastic+modulus+of+MatrigelTM+as+determined+by+atomic+force+microscopy.">The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).</li><li>Mayerh&#246;fer, T. G., Popp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer's+law+-+Why+absorbance+depends+(almost)+linearly+on+concentration.">Beer's law - Why absorbance depends (almost) linearly on concentration.</a> Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).</li><li>Puth, M. T., Neuh&#228;user, M., Ruxton, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+variety+of+methods+for+calculating+confidence+intervals+by+bootstrapping.">On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping.</a> Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).</li><li>Lavrentieva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+hydrogels.">Gradient hydrogels.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).</li><li>Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+hydrogels+for+screening+stiffness+effects+on+patient-derived+glioblastoma+xenograft+cellfates+in+3D.">Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).</li><li>da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+glioma+models:+From+patients+to+dish+to+animals.">Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals.</a> Cells. 8 (10), 1177 (2019).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transplantation+of+enteric+neural+crest+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).</li><li>Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inhibitor+cilengitide+for+the+treatment+of+glioblastoma:+A+brief+overview+of+current+clinical+results.">Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results.</a> Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).</li></ol>

يقدم العمل الحالي طرقا لتوليد 3D ، ثقافات مصغرة داخل HA القائمة على تغيير صلابة المصفوفة والببتيدات المتاحة للمشاركة في Integrin. تمكن هذه التقنية من الدراسة المنهجية لكيفية تأثير معلمات المصفوفة على الأنماط الظاهرية الخلوية (على سبيل المثال ، صلاحية الخلايا السرطانية المعرضة للعلاج الكيميائ...

ارتفعت التكلفة المتوقعة لتطوير دواء جديد بشكل مطرد على مدى العقد الماضي ، مع أكثر من مليار دولار في التقديرات الحالية1. جزء من هذه النفقات هو ارتفاع معدل فشل الأدوية التي تدخل التجارب السريرية. ما يقرب من 12٪ من الأدوية المرشحة تحصل في نهاية المطاف على موافقة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) في عام 2019. تفشل العديد من الأدوية في المرحلة الأولى بسبب السمية غير المتوقعة2 ، في حين أن الأدوية الأخرى التي تجتاز تجارب السلامة قد تفشل بسبب نقص الفعالية3. يمكن تفسير هذا الاستنزاف بسبب عدم الفعالية جزئيا بحقيقة أن نماذج السرطان المستخدمة أثناء تطوير الأدوية غير تنبؤية بالفعالية السريرية4.
يمكن أن تعزى التفاوتات الوظيفية بين النماذج المختبرية ونماذج الجسم الحي إلى إزالة الخلايا السرطانية من بيئتها الدقيقة الأصلية ، بما في ذلك الخلايا غير السرطانية و ECM 5,6 المادي. عادة ، تستخدم مجموعات البحث مصفوفات استزراعية متاحة تجاريا ، مثل Matrigel (مصفوفة غشاء قبو بروتينية مشتقة من ساركوما الفئران) لتزويد الخلايا السرطانية المستزرعة ببيئة دقيقة ثلاثية الأبعاد. بالمقارنة مع ثقافة 2D ، حسنت ثقافة 3D في مصفوفة الغشاء من الأهمية السريرية للنتائج في المختبر 7,8. ومع ذلك ، فإن المواد الحيوية المستزرعة من الأنسجة الخالية من الخلايا ، بما في ذلك مصفوفة الغشاء ، عادة ما تظهر تباينا من دفعة إلى أخرى قد يعرض للخطر قابلية التكاثر9. علاوة على ذلك ، قد لا توفر المصفوفات المشتقة من الأورام ذات الأصول النسيجية المختلفة عن تلك التي تمت دراستها الإشارات الفسيولوجية المناسبة10. وأخيرا، فإن السرطانات ذات الدرجات العالية من عدم التجانس داخل الفخذ لها سمات بيئية دقيقة تختلف على نطاق دون الميكرون ولا يمكن ضبط مصفوفة الغشاء لتلخيصها11.
الورم الأرومي الدبقي (GBM) ، وهو ورم دماغي قاتل بشكل موحد مع متوسط وقت البقاء على قيد الحياة لمدة 15 شهرا تقريبا ، هو سرطان كان تطوير العلاج له صعبا بشكل خاص12,13. يتكون المعيار الحالي لرعاية GBM من استئصال الورم الأولي ، يليه العلاج الإشعاعي ، ثم العلاج الكيميائي باستخدام temozolomide (TMZ)14. ومع ذلك ، فإن أكثر من نصف أورام GBM السريرية تظهر مقاومة للعلاج من خلال آليات مختلفة15،16،17. من الصعب للغاية التنبؤ بفعالية نظام العلاج لمريض فردي. تتكون النماذج القياسية قبل السريرية المستخدمة للتنبؤ بالنتائج الفردية من خلايا الورم المشتقة من المريض والتي يتم تطعيمها بشكل تقويمي في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. في حين أن xenografts المشتقة من المريض يمكن أن تلخص العديد من جوانب أورام GBM السريرية وهي ذات قيمة للنماذج قبل السريرية18 ، إلا أنها مكلفة بطبيعتها ، وإنتاجية منخفضة ، وتستغرق وقتا طويلا ، وتنطوي على مخاوف أخلاقية19. مزارع الخلايا المشتقة من المريض ، على الأسطح البلاستيكية 2D أو كروية ، في الغالب تجنب هذه القضايا. في حين أن الخلايا المشتقة من المريض تحافظ على الانحرافات الجينية ، فإن ثقافاتها في 2D أو كرويات معلقة كانت إلى حد كبير تمثيلات ضعيفة للأزينوفاتات المشتقة من المريض في القوارض وأورام المرضى الأصلية20. في السابق ، أظهرنا ، ونحن ، وآخرون ، أن خلايا GBM المستزرعة في ECM 3D التي تحاكي الخصائص الميكانيكية والكيميائية الحيوية لأنسجة المخ يمكن أن تحافظ على الأنماط الظاهرية المقاومة للأدوية10،21،22،23.
التفاعلات بين حمض الهيالورونيك (HA) ، وهو عديد السكاريد الوفير في الدماغ ECM والمبالغة في التعبير عنه في أورام GBM ، ومستقبلات CD44 الخاصة به تعدل اكتساب مقاومة الأدوية في المختبر21،24،25،26،27. على سبيل المثال ، أدى إدراج HA ضمن ثقافات 3D الناعمة إلى زيادة قدرة خلايا GBM المشتقة من المريض على اكتساب مقاومة علاجية. كانت هذه المسؤولية الميكانيكية تعتمد على ارتباط HA بمستقبلات CD44 على خلايا GBM21. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ربط integrin بالببتيدات الحاملة ل RGD ، المدمجة في مصفوفات الثقافة ثلاثية الأبعاد ، يضخم المقاومة الكيميائية بوساطة CD44 بطريقة تعتمد على الصلابة21. أبعد من HA ، يختلف التعبير عن العديد من بروتينات ECM ، التي يحتوي العديد منها على مناطق RGD ، بين أورام الدماغ الطبيعية و GBM28. على سبيل المثال ، ذكرت إحدى الدراسات أن 28 بروتينا متميزا من بروتينات ECM تم تنظيمها في أورام GBM29. ضمن هذه البيئة الدقيقة المعقدة لمصفوفة الورم ، تدمج الخلايا السرطانية الإشارات الميكانيكية والكيميائية الحيوية لإنتاج نمط ظاهري مقاوم معين ، والذي يعتمد على اختلافات صغيرة نسبيا (على سبيل المثال ، أقل من ترتيب الحجم) في معامل يونغ أو كثافة الببتيدات المرتبطة بالتكامل28،29،30.
يميز هذا البروتوكول كيف تفسر الخلايا السرطانية مجموعات فريدة من إشارات المصفوفة وتحدد البيئات الدقيقة المعقدة الخاصة بالمريض والتي تعزز مقاومة العلاج (الشكل 1A). توفر الطريقة الكيميائية الضوئية لتوليد مصفوفات مصغرة ومضبوطة بدقة لثقافة 3D مساحة متغيرة كبيرة ومتعامدة . تم دمج مجموعة مصممة خصيصا من مصابيح LED ، التي تديرها وحدة تحكم دقيقة ، في الهلاميات المائية الضوئية المتقاطعة ضمن تنسيق لوحة 384 بئر لزيادة الأتمتة وقابلية التكرار. وتباينت شدة التعرض عبر البئر لتغيير الخواص الميكانيكية الدقيقة للهيدروجيل الناتج، كما تم تقييمها باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM). في حين أن هذه المخطوطة لا تركز على بناء مصفوفة الإضاءة نفسها، يتم توفير مخطط الدائرة (الشكل 1B) وقائمة الأجزاء (جدول المواد) كمساعدات لإعادة إنتاج الجهاز.
يوضح هذا التقرير التوليد السريع لمجموعة من خلايا GBM المستزرعة في بيئات دقيقة فريدة من نوعها ثلاثية الأبعاد حيث كان معامل يونغ (أربعة مستويات عبر ترتيب واحد من الحجم) ومحتوى الببتيد المرتبط بالتكامل (المشتق من أربعة بروتينات ECM مختلفة) متعامدا. ثم تم استخدام هذا النهج للتحقيق في المساهمات النسبية لميكانيكا الهيدروجيل ومشاركة الإنتينجين الخاصة ب ECM على جدوى وانتشار خلايا GBM المشتقة من المريض لأنها تكتسب مقاومة للعلاج الكيميائي temozolomide (TMZ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.1 kOhm resistors, 6 W</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>35601k1ft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 nm LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>ltpl-c034uvh365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate</td>
			<td>Bio Greiner One</td>
			<td>781090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>MTC bio</td>
			<td>C4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>4arm-PEG-SH-20K-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 NPN BJTs</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>2n5550ta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 Ohm resistors, 0.125 W</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>erjj-6enf80r6v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa)</td>
			<td>Jenkem Technology</td>
			<td>A7025-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104500</td>
			<td>&#160;cell dissociation&#160; reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Probes</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td>0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 &#181;m SiO2 particle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino IDE</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>1.8.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano</td>
			<td>Makerfire</td>
			<td>Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK8</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>sorvall legend xtr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP100ST</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F148415</td>
			<td>Pipette tips for positive displacement pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubis Semi-Micro Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>MSA225S100DI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - F12 (50-50)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS Ca (-) Mg (-)</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>25-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF100-15</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P</td>
			<td>Add DI water to dilute to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-23C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G21 Supplement</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>400-160</td>
			<td>50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, ACS, 12M</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S25838A</td>
			<td>Add DI water to dilute to 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149-100Ku</td>
			<td>25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H7006-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Air Gun</td>
			<td>Wagner</td>
			<td>HT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , &#62;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP194715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall legend micro 21R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microman E single Channel Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10004</td>
			<td>Positive displacement pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Tips</td>
			<td>Various Manufacturs</td>
			<td></td>
			<td>Various sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLine micropipette</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7250-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>AFM microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ss255-1</td>
			<td>Add DI water to dilute to 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normoicin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td>500x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteopontin Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4000102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Microscope Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664201-A</td>
			<td>Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing</td>
			<td>Processing</td>
			<td>3.5.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater Pipette Tips</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td>30089430</td>
			<td>1 mL sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGD Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>GCGYGRGDSPG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoth Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>12-102,12-104</td>
			<td>5,10 mL Pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder Paste</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>315-NC191LT15T5-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder Wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight dissecting forceps</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82027-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Cell Culture Treated Flask</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temozolomide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2577</td>
			<td>Typically used from 10 &#181;M to 100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenascin-C Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR 
			GV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA700K5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Spinbar, Flea Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58948-375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrogel arrays enable increased throughput for screening effects of matrix components and therapeutics in 3d tumor models

تتوسط تفاعلات مصفوفة الخلايا العمليات الفسيولوجية المعقدة من خلال الإشارات الكيميائية الحيوية والميكانيكية والهندسية ، مما يؤثر على التغيرات المرضية والاستجابات العلاجية. ومن المتوقع أن يؤدي حساب آثار المصفوفة في وقت مبكر من خط أنابيب تطوير الأدوية إلى زيادة احتمال النجاح السريري للعلاجات الجديدة. توجد استراتيجيات قائمة على المواد الحيوية تلخص بيئات دقيقة محددة للأنسجة في زراعة الخلايا 3D ولكن دمجها مع طرق زراعة 2D المستخدمة في المقام الأول لفحص الأدوية كان تحديا. وبالتالي ، فإن البروتوكول المقدم هنا يفصل تطوير طرق لزراعة 3D داخل مصفوفات المواد الحيوية المصغرة في شكل لوحة متعددة الآبار لتسهيل التكامل مع خطوط أنابيب فحص الأدوية الحالية والفحوصات التقليدية لصلاحية الخلية. وبما أنه من المتوقع أن تكون ميزات المصفوفة الحاسمة الأهمية للحفاظ على الأنماط الظاهرية ذات الصلة سريريا في الخلايا المستزرعة خاصة بالأنسجة والأمراض، فإن الفحص التوافقي لبارامترات المصفوفة سيكون ضروريا لتحديد الظروف المناسبة لتطبيقات محددة. تستخدم الطرق الموضحة هنا تنسيق ثقافة مصغر لتقييم استجابات الخلايا السرطانية للتباين المتعامد لميكانيكا المصفوفة وعرض الرباط. على وجه التحديد ، توضح هذه الدراسة استخدام هذه المنصة للتحقيق في آثار معلمات المصفوفة على استجابات خلايا الورم الأرومي الدبقي (GBM) المشتقة من المريض للعلاج الكيميائي.

أكدت قياسات AFM التحكم الدقيق في ميكانيكا الهيدروجيل كدالة للإشعاع فوق البنفسجي (mW / cm2) أثناء الربط المتقاطع للصور باستخدام صفيف LED مصمم خصيصا يتم التحكم فيه بواسطة Arduino (الشكل 2A). يمكن العثور على تركيبة الهيدروجيل المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 2. يتطاب?...

Watch this Scientific Journal Video about Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models at JoVE.com

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

يصف هذا البروتوكول منصة تجريبية لتقييم آثار الإشارات الميكانيكية والكيميائية الحيوية على استجابات العلاج الكيميائي لخلايا الورم الأرومي الدبقي المشتقة من المريض في مزارع محاكاة مصفوفة 3D باستخدام جهاز إضاءة الأشعة فوق البنفسجية المصنوع خصيصا لتسهيل الربط الضوئي عالي الإنتاجية للهيدروجيل مع ميزات ميكانيكية قابلة للضبط.

تمكن صفائف الهيدروجيل من زيادة الإنتاجية لفحص تأثيرات مكونات المصفوفة والعلاجات في نماذج الأورام 3D

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

تمكن هذه الطريقة الباحثين من التحقيق بشكل منهجي في كيفية تأثير إشارات المصفوفة على النمط الظاهري للخلايا في ثقافة 3D. نحن نوضح الإجراء باستخدام ثقافات خلايا GBM. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التنفيذ عالي الإنتاجية ، والذي يسمح لنا بفحص العديد من ظروف المصفوفة.يمكن استخدام هذه التقنية لتطوير مصفوفات محاكاة الأنسجة التي تحافظ على وظائف محددة في نماذج زراعة الخلايا ، مثل مقاومة الخلايا السرطانية للأدوية ، وربما تحديد علاجات جديدة. ستوضح ماري إبرسون وكيلي تامورا ، الباحثتان الجامعيتان من مختبر سيدليتس ، الإجراء ، بدءا من إعداد محلول مخزن مؤقتا ب HEPES عن طريق إذابة مسحوق HEPES عند 20 ملليمولار في محلول الملح المتوازن Hanks.اضبط الرقم الهيدروجيني إلى سبعة بعد التفاقم الكامل. في المحلول المخزن مؤقتا ب HEPES ، قم بإذابة HA المعزول بحيث يتم تعديل 6 إلى 8٪ من بقايا حمض الكربوكسيل على كل حمض جلوكورونيك باستخدام ثيول بتركيز 10 ملليغرام لكل ملليلتر في محلول عازل. يحرك المزيج في أقل من 1000 دورة في الدقيقة باستخدام لوحة تحريك مغناطيسية في درجة حرارة الغرفة حتى يذوب تماما، وعادة ما يكون حوالي 45 دقيقة.أثناء ذوبان HA ، قم بإعداد محاليل منفصلة من 100 ملليغرام لكل ملليلتر من 8arm PEG norbornene ، و 100 ملليغرام لكل ملليلتر من ثيول PEG 4arm ، وأربعة ملليمولات من الببتيد المحتوي على السيستين أو السيستين ، وأربعة ملليغرام لكل ملليلتر من LAP في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. قم بإعداد محاليل أربعة ملليمولات من جميع الببتيدات ليتم ربطها داخل هيدروجيل واحد في هذه المرحلة. امزج المحاليل الفردية من HA و PEG norbornene و PEG thiol والببتيدات المحتوية على السيستين ثيول لتحقيق التركيزات النهائية لمصفوفات الهيدروجيل النهائية.يحرك المزيج بأقل من 1000 دورة في الدقيقة على صفيحة درج مغناطيسية لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى يمتزج تماما. قم بمحاذاة العينات مع جهاز الإضاءة مع كل مصباح LED آخر في عمود واحد من قوالب السيليكون أو لوحة 384 بئرا. افتح معلمات UV LED وأدخل قيما للكثافة والإضاءة.ثم انقر فوق إنهاء لبدء الإضاءة. بعد الإضاءة ، عند وضعها في زاوية واحدة ، حرك لوحة البئر إلى الزاوية التالية وكررها. لإضاءة الآبار على النصف الآخر من اللوحة ، ارفع اللوحة خارج الحامل وقم بتدوير 180 درجة.لتوليد هيدروجيل بميكانيكا مختلفة ، ابدأ بتنظيف الشرائح الزجاجية وقوالب السيليكون باستخدام شريط لإزالة الحطام. قم بلصق قوالب السيليكون بالشريحة الزجاجية ، واضغط لأسفل لضمان ختم جيد ، وإزاحة أي فقاعات هواء. بعد ذلك ، ماصة 80 ميكرولتر من محلول سلائف الهيدروجيل في كل قالب سيليكون على الشريحة الزجاجية.ضع الشريحة الزجاجية على جهاز الإضاءة المحاذي لكل مؤشر LED آخر في عمود واحد. قم بتعريض سلائف الهيدروجيل للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 ثانية للوصلة المتقاطعة للصور. بمجرد توقف الإضاءة ، استرجع الشرائح وقم بفك المواد الهلامية من القوالب عن طريق تتبع المحيط الداخلي للقالب بطرف رفيع.إزالة قوالب السيليكون مع ملاقط أو ملقط. املأ صفيحة من 12 بئرا بملليلترين من DPBS. انقل الهلاميات المائية المتقاطعة إلى صفيحة بئر فردية عن طريق ترطيب ملعقة ودفعها برفق بعيدا عن الشريحة الزجاجية.تحضير الخلايا المطلوبة كمحلول أحادي الخلية. اجمع كرويات الورم الأرومي الدبقي، التي يبلغ قطرها حوالي 150 ميكرومتر، من مزرعة تعليق قارورة T-75 إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. شطف قارورة الثقافة مع خمسة ملليلتر من DPBS لإزالة أي خلايا متبقية والوسائط وإضافة هذا الحجم إلى أنبوب مخروطي.جهاز طرد مركزي للأنبوب المخروطي الذي يحتوي على خلايا عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة supernatant باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلترات ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الخلية وإعادة تعليقها في خمسة ملليلترات من DPBS. جهاز طرد مركزي بسرعة 200 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لغسل الخلايا.استنشاق السوبرناتانت باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلترات ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الخلية ، ثم إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر من كاشف تفكك الخلايا. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. أضف ثلاثة ملليلترات من الوسط الكامل وماصة بلطف ثلاث إلى خمس مرات لتحطيم الكرويات إلى تعليق أحادي الخلية.قم بالطرد المركزي لنظام التعليق أحادي الخلية بسرعة 400 مرة G لمدة خمس دقائق لتكسير الخلايا في درجة حرارة الغرفة. استنشاق supernatant مع ماصة مصلية خمسة ملليلتر ، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه الخلية. أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من الوسط الكامل.قم بإزالة جزء من الخلايا للعد باستخدام مقياس الدم. قم بتخفيف هذا الجزء مرتين باستخدام أزرق التربان ، الذي يتخلل الخلايا ذات الجدوى المعرضة للخطر. عد فقط الخلايا الحية عديمة اللون.تحديد عدد الخلايا اللازمة للتغليف. انقل كمية من الوسائط التي تحتوي على إجمالي عدد الخلايا اللازمة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.7 ملليلتر. تدور لأسفل عند 400 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.استنشاق supernatant مع micromatete ، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه الخلية. أعد تعليق حبيبات الخلايا في محلول سلائف الهيدروجيل ، واخلطها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة ميكروماصة 1000 ميكرولتر أربع إلى خمس مرات. قم بتحميل الخلايا في جهاز سحب متكرر لتوزيع 10 ميكرولترات.لتجنب الفقاعات والتوزيع غير المتكافئ ، قم بتعبئة جهاز السحب المتكرر عن طريق توزيع مرة أو مرتين إضافيتين في حاوية نفايات. في كل بئر من صفيحة 384 بئرا ، قم بتوزيع 10 ميكرولترات من الخلايا المعلقة في محلول هيدروجيل من جهاز السحب المتكرر. باستخدام صفيف LED ، قم بإضاءة كل خلية تحتوي على بئر لمدة 15 ثانية لتحقيق الخصائص الميكانيكية المطلوبة.أضف 40 ميكرولتر من الوسائط الكاملة إلى كل بئر يحتوي على الخلايا. أضف 50 ميكرولتر من DPBS إلى الآبار الجافة غير التجريبية المحيطة بالمواد الهلامية لتقليل الخسائر الناجمة عن التبخر. بالنسبة لخلايا الورم الأرومي الدبقي ، أضف 40 ميكرولترا من الدواء المحتوي على الوسائط لتحقيق التركيز النهائي المطلوب ، بدءا من ثلاثة أيام بعد التغليف.أضف 10 ميكرولترات من كاشف CCK8 إلى كل بئر يحتوي على الخلايا. احتضان لمدة ساعة إلى أربع ساعات ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اقرأ الامتصاص عند 450 نانومتر لجميع الآبار بعد الحضانة.أظهر استجواب AFM للمناطق ذات المقياس الميكروني على أسطح الهلاميات المائية المفردة أن الهلاميات المائية ذات المتوسط الأكثر ليونة من وحدات يونغ لديها أيضا نطاقات أصغر من المودولي من الهلاميات المائية الأكثر صلابة. أظهرت الثقافات ثلاثية الأبعاد لخلايا GS122 المبذرة بكثافات 2،500،000 خلية لكل ملليلتر جدوى أعلى بكثير عند تقييمها بعد سبعة أيام في الثقافة مقارنة بتلك البذرة بكثافات 500،000 خلية لكل ملليلتر. أظهرت خلايا GS122 مكاسب البقاء على قيد الحياة في حالة الكيلو باسكال الثمانية عندما تم تضمين الببتيدات المشتقة من أوستيوبونتين في المصفوفة ، في حين أن دمج الببتيدات السيالوبروتين المرتبطة بالتكامل أو الببتيدات المشتقة من تيناسين سي وفر الحد الأدنى من فوائد البقاء على قيد الحياة ، مثل الثقافة والمصفوفات مع ببتيد الزنجبيل RGD.وعلى النقيض من ذلك، لم تمنح أي ببتيدات مكاسب للبقاء على قيد الحياة في حالة زراعة الكيلوباسكال البالغة 0.8 كيلوباسكال. تنتشر كل من خلايا GS122 و GS304 عند زراعتها في مصفوفات هيدروجيل ناعمة أو قاسية ، بما في ذلك الببتيدات المحتوية على RGD. تظهر خلايا GS122 نقصا مماثلا في الانتشار في كل من 0.8 و 8 كيلوباسكال مع أوستيوبونتين.ومع ذلك ، أظهر GS122 فقط مقاومة معززة للتيموزولوميد في حالة ثمانية كيلوباسكال. أخيرا ، يمكن استخدام منصة زراعة 3D المصغرة هذه لزراعة الخلايا البشرية من أنواع الأورام الأخرى ، بما في ذلك المواد العضوية القابلة للحياة لخلايا سرطان البروستاتا العصبية الصماوية المتباينة نهائيا. بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام المزيد من التقنيات مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لزيادة توصيف الأنماط الظاهرية للخلية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

قياس طولية من خارج الخلية مصفوفة جمود في 3D نماذج ورم عن طريق تتبع الجسيمات Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

مسامية السيليكون المجهرية الدقيقة لتسليم سيرنا التداوي

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D هيدروجيل السقالات لالمفصلي خلية غضروفية الثقافة والجيل الغضروف

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

ميكروتيسويس 3D للعلاج عن طريق الحقن بالتجدد وفحص المخدرات الفائق

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

تحسين 3D المائية الثقافات من الخلايا الدبقية الأولية لنمذجة في المختبر نيوروينفلاميشن

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

اختﻻق الكلي لحاء خارج الخلية المستمدة من مصفوفة المائية

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

تلفيق Ti3C2 MXene Microelectrode صفائف في فيفو التسجيل العصبي

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

منصة تقنية مفتوحة المصدر لتصنيع نماذج ثقافة 3D القائمة على الهيدروجيل بطريقة آلية وموحدة

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

واجهات هيدروجيل قابلة للتحلل الضوئي لفحص البكتيريا واختيارها وعزلها

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...