Name: hydrogel arrays enable increased throughput for screening effects of matrix components and therapeutics in 3d tumor models
Uploaded: 2022-06-16T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models at JoVE.com

De auteurs willen specifiek Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore en Itay Solomon bedanken voor hun bijdragen aan eerdere iteraties van het fotogelatieschema. Cellijnen GS122 en GS304 werden genereus geleverd door David Nathanson. Alle figuren zijn gemaakt met BioRender.com. UCLA-kernfaciliteiten, de Molecular Screening Shared Resources en het Nano and Pico Characterization Laboratory waren instrumenteel voor het werk. Chen Chia-Chun werd ondersteund door het UCLA Eli en Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Grigor Varuzhanyan werd ondersteund door een Tumor Cell Biology Training Program NIH Grant (T32 CA 009056).

Van patiënten afgeleide GBM-cellijnen (GS122 en GS304) werden geleverd door professor David Nathanson (onze medewerker), die deze lijnen ontwikkelde onder een protocol dat is goedgekeurd door de UCLA Institutional Review Board (IRB # 10-000655). Cellen werden gedeïdentificeerd verstrekt, zodat de cellijnen niet konden worden gekoppeld aan de individuele patiënten.
1. Bereiding van hydrogeloplossing
<ol><li>Bereid HEPES-gebufferde oplossing door HEPES-poeder op 20 mM op te...

<ol>
	<li>Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosing+the+decline+in+pharmaceutical+R&amp;D+efficiency.">Diagnosing the decline in pharmaceutical R&amp;D efficiency.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+oncology+drugs+fail+to+gain+US+regulatory+approval.">Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).</li><li>Booth, B., Ma, P., Glassman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncology's+trials.+Market+indicators.">Oncology's trials. Market indicators.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).</li><li>Da Ros, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+chemoresistance:+The+double+play+by+microenvironment+and+blood-brain+barrier.">Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).</li><li>Broekman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+communication+in+the+microenvirons+of+glioblastoma.">Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).</li><li>Grundy, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+response+of+patient-derived+primary+glioblastoma+cells+to+environmental+stiffness.">Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).</li><li>Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+human+glioblastoma+cell+culture+system+for+modeling+drug+and+radiation+responses.">A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses.</a> Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).</li><li>Simoni, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+complexes+with+biological+activity.">Basement membrane complexes with biological activity.</a> Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-mimetic+3D+culture+platforms+allow+investigation+of+cooperative+effects+of+extracellular+matrix+features+on+therapeutic+resistance+in+glioblastoma.">Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma.</a> Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li><li>Spinelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+subtypes+and+differentiation+programmes+of+glioma+stem+cells+as+determinants+of+extracellular+vesicle+profiles+and+endothelial+cell-stimulating+activities.">Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).</li><li>Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBTRUS+statistical+report:+Primary+brain+and+other+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2014-2018.">CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018.</a> Neuro-Oncology. 23, (2021).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Brennan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+somatic+genomic+landscape+of+glioblastoma.">The somatic genomic landscape of glioblastoma.</a> Cell. 155 (2), 462-477 (2013).</li><li>Tomczak, K., Czerwi&#324;ska, P., Wiznerowicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Genome+Atlas+(TCGA):+An+immeasurable+source+of+knowledge.">The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge.</a> Contemporary oncology. 19, 68-77 (2015).</li><li>Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temozolomide+resistance+in+glioblastoma+multiforme.">Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme.</a> Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).</li><li>Joo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+orthotopic+glioblastoma+xenograft+models+recapitulate+the+histopathology+and+biology+of+human+glioblastomas+in+situ.">Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ.</a> Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).</li><li>Levy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+animal+as+models:+Ethical+considerations.">The use of animal as models: Ethical considerations.</a> International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).</li><li>Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitioning+preclinical+glioblastoma+models+to+clinical+settings+with+biomarkers+identified+in+3D+cell-based+models:+A+systematic+scoping+review.">Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+scaffolds+for+3D+culture+demonstrate+extracellular+matrix-mediated+mechanisms+of+chemotherapy+resistance+in+glioblastoma.">Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma.</a> Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).</li><li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening.">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744 (2020).</li><li>Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+evaluation.">Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).</li><li>Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic-acid+based+hydrogels+for+3-dimensional+culture+of+patient-derived+Glioblastoma+Cells.">Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).</li><li>Preston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestion+products+of+the+PH20+hyaluronidase+inhibit+remyelination.">Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination.</a> Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).</li><li>Kim, Y., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44-mediated+adhesion+to+hyaluronic+acid+contributes+to+mechanosensing+and+invasive+motility.">CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility.</a> Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).</li><li>Pibuel, M. A., Poodts, D., D&#237;az, M., Hajos, S. E., Lompard&#237;a, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scrambled+story+between+hyaluronan+and+glioblastoma.">The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma.</a> The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).</li><li>Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+the+glioblastoma+microenvironment+into+engineered+experimental+models.">Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models.</a> Future Science OA. 3 (3), (2017).</li><li>Trombetta-Lima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+proteome+remodeling+in+human+glioblastoma+and+medulloblastoma.">Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma.</a> Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).</li><li>Schregel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+glioblastoma+in+an+orthotopic+mouse+model+with+magnetic+resonance+elastography.">Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography.</a> NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).</li><li>Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic-acid+based+hydrogels+for+3-dimensional+culture+of+patient-derived+glioblastoma+cells.">Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).</li><li>Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=If+cell+mechanics+can+be+described+by+elastic+modulus:+Study+of+different+models+and+probes+used+in+indentation+experiments.">If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).</li><li>Sneddon, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relation+between+load+and+penetration+in+the+axisymmetric+boussinesq+problem+for+a+punch+of+arbitrary+profile.">The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile.</a> International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).</li><li>Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elastic+modulus+of+MatrigelTM+as+determined+by+atomic+force+microscopy.">The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).</li><li>Mayerh&#246;fer, T. G., Popp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer's+law+-+Why+absorbance+depends+(almost)+linearly+on+concentration.">Beer's law - Why absorbance depends (almost) linearly on concentration.</a> Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).</li><li>Puth, M. T., Neuh&#228;user, M., Ruxton, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+variety+of+methods+for+calculating+confidence+intervals+by+bootstrapping.">On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping.</a> Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).</li><li>Lavrentieva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+hydrogels.">Gradient hydrogels.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).</li><li>Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+hydrogels+for+screening+stiffness+effects+on+patient-derived+glioblastoma+xenograft+cellfates+in+3D.">Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).</li><li>da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+glioma+models:+From+patients+to+dish+to+animals.">Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals.</a> Cells. 8 (10), 1177 (2019).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transplantation+of+enteric+neural+crest+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).</li><li>Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inhibitor+cilengitide+for+the+treatment+of+glioblastoma:+A+brief+overview+of+current+clinical+results.">Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results.</a> Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).</li></ol>

Het huidige werk presenteert methoden om 3D, geminiaturiseerde culturen te genereren binnen HA-gebaseerde en tegelijkertijd matrixstijfheid en peptiden te veranderen die beschikbaar zijn voor integrine-betrokkenheid. Deze techniek maakt de systematische studie mogelijk van hoe matrixparameters cellulaire fenotypes beïnvloeden (bijvoorbeeld de levensvatbaarheid van kankercellen die worden blootgesteld aan chemotherapie) met een verhoogde doorvoer. Eerdere benaderingen, waaronder die hierin gepresenteerd, hebben de hydrog...

De verwachte kosten van de ontwikkeling van een nieuw medicijn zijn het afgelopen decennium gestaag gestegen, met meer dan $ 1 miljard in de huidige schattingen1. Een deel van deze kosten is het hoge faalpercentage van geneesmiddelen die klinische onderzoeken ingaan. Ongeveer 12% van de kandidaat-geneesmiddelen verdient uiteindelijk goedkeuring van de Amerikaanse Food & Drug Administration (FDA) in 2019. Veel geneesmiddelen falen in fase I vanwege onverwachte toxiciteit2, terwijl anderen die veiligheidsonderzoeken doorstaan, kunnen mislukken vanwege een gebrek aan werkzaamheid3. Dit verloop als gevolg van niet-werkzaamheid kan gedeeltelijk worden verklaard door het feit dat kankermodellen die tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen worden gebruikt, notoir niet-voorspellend zijn voor klinische werkzaamheid4.
Functionele verschillen tussen in vitro en in vivo modellen kunnen worden toegeschreven aan het verwijderen van kankercellen uit hun oorspronkelijke micro-omgeving, waaronder niet-tumorcellen en de fysieke ECM 5,6. Gewoonlijk gebruiken onderzoeksgroepen commercieel verkrijgbare kweekmatrices, zoals Matrigel (een eiwitachtige keldermembraanmatrix afgeleid van muizencomen) om gekweekte tumorcellen te voorzien van een 3D-matrixmicro-omgeving. Vergeleken met 2D-cultuur heeft 3D-cultuur in membraanmatrix de klinische relevantie van in vitro resultaten verbeterd 7,8. Kweekbiomaterialen uit gedecellulariseerde weefsels, inclusief de membraanmatrix, vertonen echter meestal batch-to-batch variabiliteit die de reproduceerbaarheid in gevaar kan brengen9. Bovendien bieden matrices afgeleid van tumoren met een andere weefseloorsprong dan de bestudeerde mogelijk niet de juiste fysiologische signalen10. Ten slotte hebben kankers met een hoge mate van intratumorale heterogeniteit micro-omgevingskenmerken die variëren op een submicron-schaal en waarvan de membraanmatrix niet kan worden afgestemd om11 samen te vatten.
Glioblastoom (GBM), een uniform dodelijke hersentumor met een mediane overlevingstijd van ongeveer 15 maanden, is een kanker waarvoor de ontwikkeling van de behandeling bijzonder moeilijk is geweest12,13. De huidige zorgstandaard voor GBM bestaat uit primaire tumorresectie, gevolgd door radiotherapie en vervolgens chemotherapie met temozolomide (TMZ)14. Toch vertoont meer dan de helft van de klinische GBM-tumoren behandelingsresistentie via verschillende mechanismen 15,16,17. Het voorspellen van de werkzaamheid van een behandelingsregime voor een individuele patiënt is uiterst moeilijk. Standaard preklinische modellen die worden gebruikt om individuele uitkomsten te voorspellen, bestaan uit van patiënten afgeleide tumorcellen die orthotopisch zijn getransplanteerd in immuungecompromitteerde muizen. Hoewel patiënt-afgeleide xenografts veel aspecten van klinische GBM-tumoren kunnen samenvatten en waardevol zijn voor preklinische modellen18, zijn ze inherent duur, lage doorvoer, tijdrovend en brengen ze ethische problemen met zich mee19. Culturen van patiënt-afgeleide cellen, op 2D-plastic oppervlakken of als sferoïden, vermijden deze problemen meestal. Terwijl van patiënten afgeleide cellen genetische afwijkingen behouden, zijn hun culturen in 2D of als gesuspendeerde sferoïden grotendeels slechte representaties van patiënt-afgeleide xenografts bij knaagdieren en originele patiënttumoren20. Eerder hebben wij, en anderen, aangetoond dat GBM-cellen gekweekt in een 3D ECM die de mechanische en biochemische eigenschappen van hersenweefsel nabootst, medicijnresistentiefenotypen 10,21,22,23 kunnen behouden.
Interacties tussen hyaluronzuur (HA), een polysaccharide die overvloedig aanwezig is in de hersenen ECM en overexpressie in GBM-tumoren, en zijn CD44-receptor moduleren de verwerving van geneesmiddelresistentie in vitro 21,24,25,26,27. De opname van HA in zachte, 3D-culturen verhoogde bijvoorbeeld het vermogen van van de patiënt afgeleide GBM-cellen om therapeutische resistentie te verwerven. Deze mechano-responsiviteit was afhankelijk van HA-binding aan CD44-receptoren op GBM-cellen21. Bovendien versterkte integrinebinding aan RGD-dragende peptiden, opgenomen in 3D-cultuurmatrices, CD44-gemedieerde chemoresistantie op een stijfheidsafhankelijke manier21. Naast HA varieert de expressie van verschillende ECM-eiwitten, waarvan er vele RGD-regio's bevatten, tussen normale hersenen en GBM-tumoren28. Een studie meldde bijvoorbeeld dat 28 verschillende ECM-eiwitten werden geupreguleerd in GBM-tumoren29. Binnen deze complexe tumormatrix micro-omgeving integreren kankercellen mechanische en biochemische signalen om een bepaald resistentiefenotype te produceren, dat afhankelijk is van relatief kleine verschillen (bijvoorbeeld minder dan een orde van grootte) in Young's modulus of dichtheid van integrinebindende peptiden 28,29,30.
Het huidige protocol karakteriseert hoe tumorcellen unieke combinaties van matrixsignalen interpreteren en complexe, patiëntspecifieke matrixmicro-omgevingen identificeren die behandelingsresistentie bevorderen (figuur 1A). Een fotochemische methode voor het genereren van geminiaturiseerde, nauwkeurig afgestemde matrices voor 3D-cultuur biedt een grote, orthogonale variabele ruimte. Een op maat gemaakte reeks LED's, gerund door een microcontroller, werd opgenomen in photocrosslink hydrogels binnen een 384-well plaatformaat om de automatisering en reproduceerbaarheid te vergroten. De intensiteit van de blootstelling varieerde goed om de micromechanische eigenschappen van de resulterende hydrogels te veranderen, zoals beoordeeld met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM). Hoewel dit manuscript zich niet richt op het construeren van de verlichtingsarray zelf, worden een schakelschema (figuur 1B) en een onderdelenlijst (tabel met materialen) verstrekt als hulpmiddelen voor de reproductie van apparaten.
Dit rapport toont de snelle generatie van een reeks GBM-cellen gekweekt in unieke, 3D-micro-omgevingen waarin Young's modulus (vier niveaus in een enkele orde van grootte) en integrine-bindende peptide-inhoud (afgeleid van vier verschillende ECM-eiwitten) orthogonaal werden gevarieerd. De aanpak werd vervolgens gebruikt om de relatieve bijdragen van hydrogelmechanica en ECM-specifieke integrine-betrokkenheid op de levensvatbaarheid en proliferatie van patiënt-afgeleide GBM-cellen te onderzoeken als ze resistentie verwerven tegen temozolomide (TMZ) chemotherapie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.1 kOhm resistors, 6 W</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>35601k1ft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 nm LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>ltpl-c034uvh365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate</td>
			<td>Bio Greiner One</td>
			<td>781090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>MTC bio</td>
			<td>C4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>4arm-PEG-SH-20K-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 NPN BJTs</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>2n5550ta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 Ohm resistors, 0.125 W</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>erjj-6enf80r6v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa)</td>
			<td>Jenkem Technology</td>
			<td>A7025-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104500</td>
			<td>&#160;cell dissociation&#160; reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Probes</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td>0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 &#181;m SiO2 particle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino IDE</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>1.8.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano</td>
			<td>Makerfire</td>
			<td>Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK8</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>sorvall legend xtr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP100ST</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F148415</td>
			<td>Pipette tips for positive displacement pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubis Semi-Micro Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>MSA225S100DI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - F12 (50-50)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS Ca (-) Mg (-)</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>25-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF100-15</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P</td>
			<td>Add DI water to dilute to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-23C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G21 Supplement</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>400-160</td>
			<td>50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, ACS, 12M</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S25838A</td>
			<td>Add DI water to dilute to 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149-100Ku</td>
			<td>25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H7006-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Air Gun</td>
			<td>Wagner</td>
			<td>HT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , &#62;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP194715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall legend micro 21R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microman E single Channel Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10004</td>
			<td>Positive displacement pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Tips</td>
			<td>Various Manufacturs</td>
			<td></td>
			<td>Various sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLine micropipette</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7250-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>AFM microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ss255-1</td>
			<td>Add DI water to dilute to 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normoicin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td>500x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteopontin Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4000102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Microscope Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664201-A</td>
			<td>Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing</td>
			<td>Processing</td>
			<td>3.5.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater Pipette Tips</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td>30089430</td>
			<td>1 mL sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGD Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>GCGYGRGDSPG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoth Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>12-102,12-104</td>
			<td>5,10 mL Pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder Paste</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>315-NC191LT15T5-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder Wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight dissecting forceps</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82027-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Cell Culture Treated Flask</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temozolomide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2577</td>
			<td>Typically used from 10 &#181;M to 100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenascin-C Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR 
			GV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA700K5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Spinbar, Flea Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58948-375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrogel arrays enable increased throughput for screening effects of matrix components and therapeutics in 3d tumor models

Cel-matrix interacties bemiddelen complexe fysiologische processen door middel van biochemische, mechanische en geometrische signalen, die pathologische veranderingen en therapeutische reacties beïnvloeden. Rekening houden met matrixeffecten eerder in de pijplijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen zal naar verwachting de kans op klinisch succes van nieuwe therapieën vergroten. Er bestaan op biomateriaal gebaseerde strategieën die specifieke weefselmicro-omgevingen in 3D-celkweek samenvatten, maar het integreren van deze met de 2D-kweekmethoden die voornamelijk worden gebruikt voor geneesmiddelenscreening is een uitdaging geweest. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft dus de ontwikkeling van methoden voor 3D-cultuur binnen geminiaturiseerde biomateriaalmatrices in een multi-well plaatformaat om integratie met bestaande medicijnscreeningpijplijnen en conventionele testen voor cel levensvatbaarheid te vergemakkelijken. Aangezien de matrixkenmerken die van cruciaal belang zijn voor het behoud van klinisch relevante fenotypen in gekweekte cellen naar verwachting zeer weefsel- en ziektespecifiek zullen zijn, zal combinatorische screening van matrixparameters nodig zijn om geschikte omstandigheden voor specifieke toepassingen te identificeren. De hier beschreven methoden gebruiken een geminiaturiseerd cultuurformaat om kankercelresponsen op orthogonale variatie van matrixmechanica en ligandpresentatie te beoordelen. Specifiek toont deze studie het gebruik van dit platform om de effecten van matrixparameters op de reacties van van patiënten afgeleide glioblastoom (GBM) cellen op chemotherapie te onderzoeken.

AFM-metingen bevestigden een nauwkeurige controle van hydrogelmechanica als functie van UV-straling (mW / cm2) tijdens foto-crosslinking met behulp van een op maat gemaakte, Arduino-gestuurde LED-array (figuur 2A). De hydrogelformulering die in dit protocol wordt gebruikt, is te vinden in tabel 2. De afstand van de LED's op de meegeleverde sjabloon komt overeen met de afstand voor elke andere put van een 384-well plaat, waardoor de vorming van gels in de plaat mog...

Watch this Scientific Journal Video about Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models at JoVE.com

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Het huidige protocol beschrijft een experimenteel platform om de effecten van mechanische en biochemische signalen op chemotherapeutische reacties van patiënt-afgeleide glioblastoomcellen in 3D matrix-mimetische culturen te beoordelen met behulp van een op maat gemaakt UV-verlichtingsapparaat dat high-throughput photocrosslinking van hydrogels met instelbare mechanische kenmerken mogelijk maakt.

Hydrogel-arrays maken een verhoogde doorvoer mogelijk voor screeningseffecten van matrixcomponenten en therapeutica in 3D-tumormodellen

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

Deze methode stelt onderzoekers in staat om systematisch te onderzoeken hoe matrix cues het fenotype van cellen in 3D-cultuur beïnvloeden. We demonstreren de procedure met behulp van culturen van GBM-cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is een implementatie met hoge doorvoer, waardoor we veel matrixcondities kunnen screenen.Deze techniek kan worden gebruikt om weefsel-mimetische matrices te ontwikkelen die specifieke functies in celkweekmodellen behouden, zoals medicijnresistentie van tumorcellen, en mogelijk nieuwe therapieën identificeren. Mary Epperson en Kelly Tamura, niet-gegradueerde onderzoekers van het Seidlits Lab, demonstreren de procedure. Begin met het bereiden van HEPES-gebufferde oplossing door HEPES-poeder op te lossen bij 20-millimolar in Hanks gebalanceerde zoutoplossing.Stel de pH in op zeven na volledige sorptie. Los in de HEPES-gebufferde oplossing thiolated HA op zodat 6 tot 8% van de carbonzuurresiduen op elk glucuronzuur worden gemodificeerd met een thiol in een concentratie van 10 milligram per milliliter in bufferoplossing. Roer met minder dan 1.000 omwentelingen per minuut met behulp van een magnetische roerplaat op kamertemperatuur totdat deze volledig is opgelost, meestal ongeveer 45 minuten.Terwijl HA oplost, bereidt u afzonderlijke oplossingen van 100 milligram per milliliter 8arm PEG norborneen, 100 milligram per milliliter 4arm PEG thiol, vier millimol cysteïne of cysteïnebevattend peptide en vier milligram per milliliter LAP in microcentrifugebuizen. Bereid vier millimolaire oplossingen van alle peptiden die op dit punt in een enkele hydrogel moeten worden vastgebonden. Meng de afzonderlijke oplossingen van HA, PEG norborneen, PEG thiol en cysteïne-thiol-bevattende peptiden om de uiteindelijke concentraties voor de uiteindelijke hydrogelmatrices te bereiken.Roer met minder dan 1.000 omwentelingen per minuut op een magnetische trapplaat gedurende ten minste 30 minuten om volledig te mengen. Lijn de monsters uit met het verlichtingsapparaat met elke andere LED in een enkele kolom van de siliconen mallen of 384-well plaat. Open UV LED-parameters en voer waarden in voor intensiteit en verlichting.Klik vervolgens op Voltooien om de verlichting te starten. Na verlichting, wanneer geplaatst in een hoek, verplaats de putplaat naar de volgende hoek en herhaal. Om putjes op de andere helft van de plaat te verlichten, tilt u de plaat uit de houder en draait u 180 graden.Om hydrogels met verschillende mechanica te genereren, begint u met het reinigen van de glasglaasjes en siliconen mallen met behulp van tape om vuil te verwijderen. Bevestig de siliconen mallen aan de glasschuif, druk naar beneden om een goede afdichting te garanderen en verplaats eventuele luchtbellen. Pipetteer vervolgens 80 microliter hydrogel precursor-oplossing in elke siliconenmal op de glasschuif.Plaats de glasschuif op het verlichtingsapparaat dat is uitgelijnd met elke andere LED in een enkele kolom. Stel de hydrogelvoorlopers gedurende 15 seconden bloot aan UV-licht om crosslinks te fotograferen. Zodra de verlichting is gestopt, haalt u de dia's op en maakt u de gels los van de mallen door de binnenomtrek van de mal met een fijne punt te volgen.Verwijder siliconen mallen met een pincet of tang. Vul een 12-well plaat met twee milliliter DPBS. Verplaats verknoopte hydrogels in een individuele putplaat door een spatel nat te maken en ze voorzichtig van de glazen glijbaan te duwen.Bereid de gewenste cellen voor als een eencellige oplossing. Verzamel glioblastoomsferoïden, ongeveer 150 micrometer in diameter, van een T-75 kolf suspensiecultuur in een conische buis van 15 milliliter. Spoel de kweekkolf af met vijf milliliter DPBS om eventuele restcellen en media te verwijderen en voeg dit volume toe aan de conische buis.Centrifugeer de conische buis met cellen op 200 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na centrifugatie het supernatant met een serologische pipet van vijf milliliter, zorg ervoor dat de celpellet niet wordt verstoord en resuspendeert in vijf milliliter DPBS. Centrifugeer op 200 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om cellen te wassen.Adem het supernatant op met een serologische pipet van vijf milliliter, zorg ervoor dat de celpellet niet wordt verstoord en resuspendeer vervolgens cellen in twee milliliter celdissociatiereagens. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten. Voeg drie milliliter compleet medium toe en pipetteer voorzichtig drie tot vijf keer om de sferoïden af te breken tot een eencellige suspensie.Centrifugeer de eencellige suspensie bij 400 maal G gedurende vijf minuten tot pelletcellen bij kamertemperatuur. Aspirateer het supernatant met een serologische pipet van vijf milliliter en zorg ervoor dat de celpellet niet wordt verstoord. Resuspend cellen in één milliliter compleet medium.Verwijder een deel van de cellen om te tellen met behulp van een hemocytometer. Verdun dit deel tweevoudig met trypan blue, dat cellen met een gecompromitteerde levensvatbaarheid doordringt. Tel alleen de levende, kleurloze cellen.Bepaal het aantal cellen dat nodig is voor inkapseling. Breng een volume media met het totale aantal benodigde cellen over in een steriele microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Draai vijf minuten lang op 400 maal G bij kamertemperatuur.Aspirateer het supernatant met een micropipette en zorg ervoor dat de celpellet niet wordt verstoord. Resuspendeer de celpellet in de hydrogel precursoroplossing en meng goed door vier tot vijf keer op en neer te pipetteren met een micropipette van 1.000 microliter. Laad de cellen in een herhalingspijptterset om 10 microliter af te geven.Om bubbels en ongelijke dosering te voorkomen, primeert u de herhaalde pipetter door een extra één tot twee keer in een afvalcontainer te doseren. Doseer in elke put van een 384-well plaat 10 microliter cellen gesuspendeerd in hydrogeloplossing van de herhaalde pipetter. Gebruik de LED-array om elke put met cel gedurende 15 seconden te verlichten om de gewenste mechanische eigenschappen te bereiken.Voeg 40 microliter volledige media toe aan elk putje dat de cellen bevat. Voeg 50 microliter DPBS toe aan niet-experimentele droge putten rond de gels om verliezen als gevolg van verdamping te minimaliseren. Voeg voor glioblastoomcellen 40 microliter van het mediabevattende medicijn toe om de uiteindelijke gewenste concentratie te bereiken, te beginnen drie dagen na inkapseling.Voeg 10 microliter CCK8-reagens toe aan elk putje dat de cellen bevat. Incubeer gedurende één tot vier uur, volgens de instructies van de fabrikant. Lees absorptiewaarden op 450 nanometer voor alle putten na incubatie.AFM-ondervraging van micronschaalgebieden aan de oppervlakken van enkele hydrogels toonde aan dat hydrogels met zachtere gemiddelde Young's moduli ook kleinere modulibereiken hadden dan stijvere hydrogels. 3D-culturen van GS122-cellen gezaaid met dichtheden van 2.500.000 cellen per milliliter vertoonden aanzienlijk hogere viabiliteiten bij beoordeling na zeven dagen in cultuur in vergelijking met die gezaaid bij dichtheden van 500.000 cellen per milliliter. GS122-cellen vertoonden overlevingswinsten in de acht kilopascal-conditie wanneer osteopontine-afgeleide peptiden werden opgenomen in de matrix, terwijl de opname van integrine-bindende sialoproteïne of tenascine C-afgeleide peptiden minimale overlevingsvoordelen opleverde, zoals cultuur en matrices met het gember RGD-peptide.Daarentegen leverden geen peptiden overlevingswinst op in de 0,8 kilopascal kweekconditie. Zowel GS122- als GS304-cellen verspreiden zich wanneer ze worden gekweekt in zachte of stijve hydrogelmatrices, waaronder RGD-bevattende peptiden. GS122-cellen vertonen een vergelijkbaar gebrek aan verspreiding in zowel 0,8 als 8 kilopascal met osteopontine.GS122 vertoonde echter alleen een verhoogde weerstand tegen temozolomide in de acht kilopascals-toestand. Ten slotte kan dit geminiaturiseerde 3D-kweekplatform worden gebruikt om menselijke cellen van andere tumortypen te kweken, waaronder levensvatbare organoïden van terminaal gedifferentieerde neuro-endocriene prostaatkankercellen. Na deze procedure kunnen verdere technieken zoals single-cell RNA sequencing worden gebruikt om celfenotypen verder te karakteriseren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Longitudinale Meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D Tumor modellen met-Particle Tracking Microreologie

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Poreuze Silicon Micropartikels voor Levering van siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel Stellingen voor Articulaire Chondrocyte Cultuur en Kraakbeen Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Verbeterd 3D Hydrogel culturen van primaire gliacellen voor In Vitro modellering van Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Fabriceren van een nier Cortex extracellulaire Matrix afkomstige Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Een menselijke 3D-extracellulaire matrix-Adipocyte cultuur model voor het bestuderen van matrix-cel metabole Overspraak

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Fabricage van Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays voor In Vivo Neural Recording

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Een open source technologieplatform om op Hydrogel gebaseerde 3D-cultuurmodellen op een geautomatiseerde en gestandaardiseerde manier te produceren

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Fotoafbreekbare hydrogelinterfaces voor screening, selectie en isolatie van bacteriën

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...