Name: hydrogel arrays enable increased throughput for screening effects of matrix components and therapeutics in 3d tumor models
Uploaded: 2022-06-16T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models at JoVE.com

Die Autoren möchten Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore und Itay Solomon ausdrücklich für ihre Beiträge zu früheren Iterationen des Photogelationsschemas danken. Die Zelllinien GS122 und GS304 wurden großzügig von David Nathanson zur Verfügung gestellt. Alle Figuren wurden mit BioRender.com erstellt. Die Kerneinrichtungen der UCLA, die Molecular Screening Shared Resources und das Nano and Pico Characterization Laboratory waren maßgeblich an der Arbeit beteiligt. Chen Chia-Chun wurde von der UCLA Eli und dem Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program unterstützt. Grigor Varuzhanyan wurde durch ein Tumor Cell Biology Training Program NIH Grant (T32 CA 009056) unterstützt.

Von Patienten abgeleitete GBM-Zelllinien (GS122 und GS304) wurden von Professor David Nathanson (unserem Mitarbeiter) zur Verfügung gestellt, der diese Linien im Rahmen eines vom UCLA Institutional Review Board genehmigten Protokolls (IRB # 10-000655) entwickelte. Zellen wurden de-identifiziert zur Verfügung gestellt, so dass die Zelllinien nicht mit den einzelnen Patienten in Verbindung gebracht werden konnten.
1. Herstellung von Hydrogellösung
<ol><li>Bereiten Sie HEPES...

<ol>
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Die aktuelle Arbeit präsentiert Methoden zur Erzeugung von 3D-, miniaturisierten Kulturen innerhalb von HA-basierten bei gleichzeitiger Veränderung der Matrixsteifigkeit und der für das Integrin-Engagement verfügbaren Peptide. Diese Technik ermöglicht die systematische Untersuchung, wie Matrixparameter zelluläre Phänotypen (z. B. die Lebensfähigkeit von Krebszellen, die einer Chemotherapie ausgesetzt sind) mit erhöhtem Durchsatz beeinflussen. Frühere Ansätze, einschließlich der hier vorgestellten, haben die H...

Die erwarteten Kosten für die Entwicklung eines neuen Medikaments sind in den letzten zehn Jahren stetig gestiegen, mit über 1 Milliarde US-Dollar in aktuellen Schätzungen1. Ein Teil dieser Kosten ist die hohe Ausfallrate von Medikamenten, die in klinische Studien aufgenommen werden. Etwa 12% der Arzneimittelkandidaten erhalten schließlich im Jahr 2019 die Zulassung der US-amerikanischen Food & Drug Administration (FDA). Viele Medikamente versagen in Phase I aufgrund unvorhergesehener Toxizität2, während andere, die Sicherheitsstudien bestehen, aufgrund mangelnder Wirksamkeitscheitern können 3. Diese Fluktuation aufgrund der Nichtwirksamkeit kann teilweise durch die Tatsache erklärt werden, dass Krebsmodelle, die während der Arzneimittelentwicklung verwendet werden, notorisch nicht prädiktiv für die klinische Wirksamkeitsind 4.
Funktionelle Unterschiede zwischen In-vitro- und In-vivo-Modellen können auf die Entfernung von Krebszellen aus ihrer nativen Mikroumgebung zurückgeführt werden, einschließlich Nicht-Tumorzellen und der physikalischen ECM 5,6. Häufig verwenden Forschungsgruppen kommerziell erhältliche Kulturmatrizen wie Matrigel (eine proteinhaltige Basalmembranmatrix, die von Maussarkomen abgeleitet ist), um kultivierten Tumorzellen eine 3D-Matrix-Mikroumgebung zur Verfügung zu stellen. Im Vergleich zur 2D-Kultur hat die 3D-Kultur in der Membranmatrix die klinische Relevanz der In-vitro-Ergebnisse verbessert 7,8. Kulturbiomaterialien aus dezellularisierten Geweben, einschließlich der Membranmatrix, weisen jedoch typischerweise eine Variabilität von Charge zu Charge auf, die die Reproduzierbarkeit beeinträchtigenkann 9. Darüber hinaus liefern Matrizen, die von Tumoren stammen, deren Gewebeursprung sich von den untersuchten unterscheidet, möglicherweise nicht die geeigneten physiologischen Hinweise10. Schließlich weisen Krebsarten mit hohem Grad an intratumoraler Heterogenität mikroökologische Merkmale auf, die auf einer Submikrometer-Größenskala variieren und deren Rekapitulation der Membranmatrix nicht abgestimmt werdenkann 11.
Das Glioblastom (GBM), ein gleichmäßig tödlicher Hirntumor mit einer medianen Überlebenszeit von etwa 15 Monaten, ist eine Krebserkrankung, bei der die Behandlungsentwicklung besonders schwierig war12,13. Der derzeitige Behandlungsstandard für GBM besteht aus einer primären Tumorresektion, gefolgt von einer Strahlentherapie und einer anschließenden Chemotherapie mit Temozolomid (TMZ)14. Dennoch zeigen mehr als die Hälfte der klinischen GBM-Tumoren eine Behandlungsresistenz durch verschiedene Mechanismen15,16,17. Die Vorhersage der Wirksamkeit eines Behandlungsschemas für einen einzelnen Patienten ist äußerst schwierig. Präklinische Standardmodelle, die zur Vorhersage individueller Ergebnisse verwendet werden, bestehen aus von Patienten abgeleiteten Tumorzellen, die orthotopisch in immungeschwächte Mäuse xenotransplantiert werden. Während von Patienten abgeleitete Xenotransplantate viele Aspekte klinischer GBM-Tumoren rekapitulieren können und für präklinische Modellewertvoll sind 18, sind sie von Natur aus teuer, geringer Durchsatz, zeitaufwendig und beinhalten ethische Bedenken19. Kulturen von Patientenzellen, auf 2D-Kunststoffoberflächen oder als Sphäroide vermeiden diese Probleme meistens. Während patientenabgeleitete Zellen genetische Aberrationen bewahren, waren ihre Kulturen in 2D oder als suspendierte Sphäroide weitgehend schlechte Darstellungen von patientenabgeleiteten Xenotransplantaten in Nagetieren und ursprünglichen Patiententumoren20. Zuvor haben wir und andere gezeigt, dass GBM-Zellen, die in einem 3D-ECM kultiviert werden, das die mechanischen und biochemischen Eigenschaften des Hirngewebes nachahmt, die Phänotypen 10,21,22,23 der Arzneimittelresistenz erhalten können.
Wechselwirkungen zwischen Hyaluronsäure (HA), einem Polysaccharid, das im Gehirn-ECM reichlich vorhanden ist und in GBM-Tumoren überexprimiert wird, und seinem CD44-Rezeptor modulieren den Erwerb von Arzneimittelresistenzen in vitro 21,24,25,26,27. Zum Beispiel erhöhte die Einbeziehung von HA in weiche 3D-Kulturen die Fähigkeit von von Patienten abgeleiteten GBM-Zellen, therapeutische Resistenzen zu erlangen. Diese Mechano-Responsivität war abhängig von der HA-Bindung an CD44-Rezeptoren auf GBM-Zellen21. Zusätzlich verstärkte die Integrinbindung an RGD-tragende Peptide, die in 3D-Kulturmatrizen eingebaut wurden, CD44-vermittelte Chemoresistenz in einer steifigkeitsabhängigen Weise21. Über HA hinaus variiert die Expression mehrerer ECM-Proteine, von denen viele RGD-Regionen enthalten, zwischen normalen Hirn- und GBM-Tumoren28. Zum Beispiel berichtete eine Studie, dass 28 verschiedene ECM-Proteine in GBM-Tumoren hochreguliert wurden29. Innerhalb dieser komplexen Tumormatrix-Mikroumgebung integrieren Krebszellen mechanische und biochemische Hinweise, um einen bestimmten Resistenzphänotyp zu erhalten, der von relativ kleinen Unterschieden (z. B. weniger als einer Größenordnung) im Elastizitätsmodul oder der Dichte der integrinbindenden Peptide28,29,30 abhängt.
Das vorliegende Protokoll charakterisiert, wie Tumorzellen einzigartige Kombinationen von Matrixhinweisen interpretieren und komplexe, patientenspezifische Matrixmikroumgebungen identifizieren, die die Behandlungsresistenz fördern (Abbildung 1A). Eine photochemische Methode zur Erzeugung miniaturisierter, präzise abgestimmter Matrizen für die 3D-Kultur bietet einen großen, orthogonalen variablen Raum. Ein speziell angefertigtes Array von LEDs, die von einem Mikrocontroller betrieben werden, wurde integriert, um Hydrogele innerhalb eines 384-Well-Plattenformats zu vernetzen, um die Automatisierung und Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Die Expositionsintensität wurde im gesamten Bohrloch variiert, um die mikromechanischen Eigenschaften der resultierenden Hydrogele zu verändern, wie sie mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) bewertet wurden. Während sich dieses Manuskript nicht auf die Konstruktion des Illuminationsarrays selbst konzentriert, werden ein Schaltplan (Abbildung 1B) und eine Stückliste (Table of Materials) als Hilfsmittel für die Gerätereproduktion bereitgestellt.
Dieser Bericht zeigt die schnelle Erzeugung einer Reihe von GBM-Zellen, die in einzigartigen 3D-Mikroumgebungen kultiviert wurden, in denen der Elastizitätsmodul (vier Ebenen über eine einzige Größenordnung) und der integrinbindende Peptidgehalt (abgeleitet von vier verschiedenen ECM-Proteinen) orthogonal variiert waren. Der Ansatz wurde dann verwendet, um die relativen Beiträge der Hydrogelmechanik und des ECM-spezifischen Integrin-Engagements auf die Lebensfähigkeit und Proliferation von patientenabgeleiteten GBM-Zellen zu untersuchen, wenn sie eine Resistenz gegen Temozolomid (TMZ) -Chemotherapie erwerben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.1 kOhm resistors, 6 W</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>35601k1ft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 nm LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>ltpl-c034uvh365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate</td>
			<td>Bio Greiner One</td>
			<td>781090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>MTC bio</td>
			<td>C4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>4arm-PEG-SH-20K-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 NPN BJTs</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>2n5550ta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 Ohm resistors, 0.125 W</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>erjj-6enf80r6v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa)</td>
			<td>Jenkem Technology</td>
			<td>A7025-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104500</td>
			<td>&#160;cell dissociation&#160; reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Probes</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td>0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 &#181;m SiO2 particle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino IDE</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>1.8.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano</td>
			<td>Makerfire</td>
			<td>Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK8</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>sorvall legend xtr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP100ST</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F148415</td>
			<td>Pipette tips for positive displacement pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubis Semi-Micro Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>MSA225S100DI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - F12 (50-50)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS Ca (-) Mg (-)</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>25-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF100-15</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P</td>
			<td>Add DI water to dilute to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-23C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G21 Supplement</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>400-160</td>
			<td>50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, ACS, 12M</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S25838A</td>
			<td>Add DI water to dilute to 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149-100Ku</td>
			<td>25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H7006-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Air Gun</td>
			<td>Wagner</td>
			<td>HT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , &#62;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP194715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall legend micro 21R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microman E single Channel Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10004</td>
			<td>Positive displacement pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Tips</td>
			<td>Various Manufacturs</td>
			<td></td>
			<td>Various sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLine micropipette</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7250-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>AFM microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ss255-1</td>
			<td>Add DI water to dilute to 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normoicin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td>500x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteopontin Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4000102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Microscope Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664201-A</td>
			<td>Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing</td>
			<td>Processing</td>
			<td>3.5.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater Pipette Tips</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td>30089430</td>
			<td>1 mL sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGD Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>GCGYGRGDSPG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoth Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>12-102,12-104</td>
			<td>5,10 mL Pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder Paste</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>315-NC191LT15T5-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder Wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight dissecting forceps</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82027-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Cell Culture Treated Flask</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temozolomide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2577</td>
			<td>Typically used from 10 &#181;M to 100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenascin-C Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR 
			GV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA700K5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Spinbar, Flea Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58948-375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrogel arrays enable increased throughput for screening effects of matrix components and therapeutics in 3d tumor models

Zell-Matrix-Interaktionen vermitteln komplexe physiologische Prozesse durch biochemische, mechanische und geometrische Hinweise und beeinflussen pathologische Veränderungen und therapeutische Reaktionen. Es wird erwartet, dass die Berücksichtigung von Matrixeffekten zu einem früheren Zeitpunkt in der Arzneimittelentwicklungspipeline die Wahrscheinlichkeit des klinischen Erfolgs neuartiger Therapeutika erhöhen wird. Es gibt auf Biomaterialien basierende Strategien, die spezifische Gewebemikroumgebungen in 3D-Zellkultur rekapitulieren, aber die Integration dieser mit den 2D-Kulturmethoden, die hauptsächlich für das Drogenscreening verwendet werden, war eine Herausforderung. Daher beschreibt das hier vorgestellte Protokoll die Entwicklung von Methoden für die 3D-Kultur in miniaturisierten Biomaterialmatrizen in einem Multi-Well-Plattenformat, um die Integration in bestehende Wirkstoff-Screening-Pipelines und konventionelle Assays für die Zelllebensfähigkeit zu erleichtern. Da von den Matrixmerkmalen, die für die Erhaltung klinisch relevanter Phänotypen in kultivierten Zellen entscheidend sind, ein hochgradig gewebe- und krankheitsspezifisches Screening erwartet wird, wird ein kombinatorisches Screening von Matrixparametern erforderlich sein, um geeignete Bedingungen für spezifische Anwendungen zu identifizieren. Die hier beschriebenen Methoden verwenden ein miniaturisiertes Kulturformat, um die Reaktionen von Krebszellen auf orthogonale Variation der Matrixmechanik und der Ligandenpräsentation zu bewerten. Insbesondere zeigt diese Studie die Verwendung dieser Plattform, um die Auswirkungen von Matrixparametern auf die Reaktionen von patientenabgeleiteten Glioblastomzellen (GBM) auf die Chemotherapie zu untersuchen.

AFM-Messungen bestätigten die präzise Kontrolle der Hydrogelmechanik in Abhängigkeit von der UV-Bestrahlungsstärke (mW/cm2) während der Fotovernetzung mit einem speziell angefertigten, Arduino-gesteuerten LED-Array (Abbildung 2A). Die in diesem Protokoll verwendete Hydrogelformulierung ist in Tabelle 2 aufgeführt. Der Abstand der LEDs auf der mitgelieferten Schablone stimmt mit dem Abstand für jede andere Vertiefung einer 384-Well-Platte überein, wodurch d...

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Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine experimentelle Plattform zur Bewertung der Auswirkungen mechanischer und biochemischer Hinweise auf chemotherapeutische Reaktionen von patientenabgeleiteten Glioblastomzellen in 3D-matrixmimetischen Kulturen unter Verwendung eines maßgeschneiderten UV-Beleuchtungsgeräts, das die Hochdurchsatz-Photovernetzung von Hydrogelen mit abstimmbaren mechanischen Eigenschaften ermöglicht.

Hydrogel-Arrays ermöglichen erhöhten Durchsatz für Screening-Effekte von Matrixkomponenten und Therapeutika in 3D-Tumormodellen

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

Mit dieser Methode können Forscher systematisch untersuchen, wie sich Matrixhinweise auf den Phänotyp von Zellen in 3D-Kultur auswirken. Wir demonstrieren das Verfahren anhand von Kulturen von GBM-Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Implementierung mit hohem Durchsatz, die es uns ermöglicht, viele Matrixbedingungen zu überprüfen.Diese Technik kann verwendet werden, um gewebemimetische Matrizen zu entwickeln, die spezifische Funktionen in Zellkulturmodellen, wie z.B. die Arzneimittelresistenz von Tumorzellen, beibehalten und möglicherweise neue Therapeutika identifizieren. Mary Epperson und Kelly Tamura, Studentinnen des Seidlits Lab, demonstrieren das Verfahren. Beginnen Sie mit der Herstellung von HEPES-gepufferter Lösung, indem Sie HEPES-Pulver bei 20-Millimolar in Hanks ausgewogener Salzlösung auflösen.Stellen Sie den pH-Wert nach vollständiger Sorption auf sieben ein. In der HEPES-gepufferten Lösung wird thioliertes HA so gelöst, dass 6 bis 8% Carbonsäurereste auf jeder Glucuronsäure mit einem Thiol in einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter in Pufferlösung modifiziert werden. Mit weniger als 1.000 Umdrehungen pro Minute mit einer magnetischen Rührplatte bei Raumtemperatur umrühren, bis sie sich vollständig aufgelöst hat, typischerweise etwa 45 Minuten.Während HA auflöst, bereiten Sie separate Lösungen von 100 Milligramm pro Milliliter 8arm PEG Norbornen, 100 Milligramm pro Milliliter 4arm PEG Thiol, vier Millimolar Cystein oder Cystein-haltiges Peptid und vier Milligramm pro Milliliter LAP in Mikrozentrifugenröhrchen vor. Bereiten Sie vier-millimolare Lösungen aller Peptide vor, die an dieser Stelle in einem einzigen Hydrogel angebunden werden sollen. Mischen Sie die einzelnen Lösungen von HA, PEG-Norbornen, PEG-Thiol und Cystein-Thiol-haltigen Peptiden, um die Endkonzentrationen für die endgültigen Hydrogelmatrizen zu erreichen.Rühren Sie mit weniger als 1.000 Umdrehungen pro Minute auf einer magnetischen Treppenplatte für mindestens 30 Minuten, um sich vollständig zu mischen. Richten Sie die Proben mit dem Beleuchtungsgerät mit jeder anderen LED in einer einzigen Säule der Silikonformen oder der 384-Well-Platte aus. Öffnen Sie die UV-LED-Parameter und geben Sie Werte für Intensität und Beleuchtung ein.Klicken Sie dann auf Fertig stellen, um die Beleuchtung zu starten. Wenn Sie nach der Beleuchtung in einer Ecke platziert sind, bewegen Sie die Bohrlochplatte in die nächste Ecke und wiederholen Sie den Vorgang. Um Vertiefungen auf der anderen Hälfte der Platte zu beleuchten, heben Sie die Platte aus der Halterung und drehen Sie sie um 180 Grad.Um Hydrogele mit unterschiedlicher Mechanik zu erzeugen, beginnen Sie mit der Reinigung der Glasobjektträger und Silikonformen mit Klebeband, um Ablagerungen zu entfernen. Kleben Sie die Silikonformen auf den Glasschieber, drücken Sie sie nach unten, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten, und verdrängen Sie Luftblasen. Als nächstes pipettieren Sie 80 Mikroliter Hydrogel-Vorläuferlösung in jede Silikonform auf dem Glasobjektträger.Legen Sie den Glasschieber in einer einzigen Spalte auf das Beleuchtungsgerät, das mit jeder anderen LED ausgerichtet ist. Setzen Sie die Hydrogel-Vorläufer 15 Sekunden lang UV-Licht aus, um Fotos zu vernetzen. Sobald die Beleuchtung gestoppt ist, holen Sie die Dias zurück und lösen Sie die Gele aus den Formen, indem Sie den inneren Umfang der Form mit einer feinen Spitze verfolgen.Entfernen Sie Silikonformen mit einer Pinzette oder Pinzette. Füllen Sie eine 12-Well-Platte mit zwei Millilitern DPBS. Bewegen Sie vernetzte Hydrogele in die einzelne Wellplatte, indem Sie einen Spatel benetzen und vorsichtig vom Glasobjektträger drücken.Bereiten Sie die gewünschten Zellen als Einzelzelllösung vor. Sammeln Sie Glioblastom-Sphäroide mit einem Durchmesser von etwa 150 Mikrometern aus einer T-75-Kolbensuspensionskultur in ein 15-Milliliter-konisches Rohr. Spülen Sie den Kulturkolben mit fünf Millilitern DPBS ab, um Restzellen und Medien zu entfernen, und fügen Sie dieses Volumen dem konischen Röhrchen hinzu.Zentrieren Sie das konische Röhrchen, das die Zellen enthält, bei 200 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette, wobei Sie darauf achten, das Zellpellet nicht zu stören und in fünf Millilitern DPBS zu resuspendieren. Zentrifugieren Sie bei 200 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um Zellen zu waschen.Aspirieren Sie den Überstand mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette, achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören, und resuspendieren Sie dann die Zellen in zwei Millilitern Zelldissoziationsreagenz. Bei Raumtemperatur 10 bis 15 Minuten inkubieren. Fügen Sie drei Milliliter vollständiges Medium hinzu und pipettieren Sie vorsichtig drei- bis fünfmal, um die Sphäroide zu einer Einzelzellsuspension abzubauen.Zentrifugieren Sie die Einzelzellsuspension bei 400 mal G für fünf Minuten, um die Zellen bei Raumtemperatur zu pelletieren. Saugen Sie den Überstand mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette ab und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie Zellen in einem Milliliter vollständigem Medium.Entfernen Sie einen Teil der Zellen zum Zählen mit einem Hämozytometer. Verdünnen Sie diesen Teil zweifach mit Trypanblau, das Zellen mit beeinträchtigter Lebensfähigkeit durchdringt. Zählen Sie nur die lebenden, farblosen Zellen.Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen, die für die Verkapselung erforderlich sind. Übertragen Sie ein Medienvolumen mit der Gesamtzahl der benötigten Zellen in ein steriles 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Bei Raumtemperatur fünf Minuten lang mit 400 g nach unten drehen.Saugen Sie den Überstand mit einer Mikropipette ab und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie das Zellpellet in der Hydrogel-Vorläuferlösung und mischen Sie gut, indem Sie vier- bis fünfmal mit einer 1.000-Mikroliter-Mikropipette auf und ab pipettieren. Laden Sie die Zellen in ein wiederholtes Pipetteraggregat, um 10 Mikroliter abzugeben.Um Blasen und ungleichmäßiges Dosieren zu vermeiden, grundieren Sie den Wiederholungspipetter, indem Sie ein bis zwei Mal zusätzlich in einen Abfallbehälter dosieren. Geben Sie in jeder Vertiefung einer 384-Well-Platte 10 Mikroliter Zellen ab, die in Hydrogellösung aus dem Wiederholungspipetter suspendiert sind. Beleuchten Sie mit dem LED-Array jede Well-enthaltende Zelle 15 Sekunden lang, um die gewünschten mechanischen Eigenschaften zu erzielen.Fügen Sie 40 Mikroliter vollständiges Medium zu jeder Vertiefung hinzu, die die Zellen enthält. Fügen Sie 50 Mikroliter DPBS zu nicht-experimentellen Trockenbrunnen hinzu, die die Gele umgeben, um Verluste durch Verdunstung zu minimieren. Für Glioblastomzellen fügen Sie 40 Mikroliter des medienhaltigen Arzneimittels hinzu, um die endgültige gewünschte Konzentration zu erreichen, beginnend drei Tage nach der Verkapselung.Fügen Sie 10 Mikroliter CCK8-Reagenz zu jeder Vertiefung hinzu, die die Zellen enthält. Inkubieren Sie für ein bis vier Stunden, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Lesen Sie die Absorptionsraten bei 450 Nanometern für alle Vertiefungen nach der Inkubation.AFM-Befragungen von mikrometerskaligen Regionen an den Oberflächen einzelner Hydrogele zeigten, dass Hydrogele mit weicheren durchschnittlichen Young-Moduli auch kleinere Modulbereiche aufwiesen als steifere Hydrogele. 3D-Kulturen von GS122-Zellen, die mit einer Dichte von 2.500.000 Zellen pro Milliliter ausgesät wurden, zeigten nach sieben Tagen in Kultur eine wesentlich höhere Lebensfähigkeit als diejenigen, die mit einer Dichte von 500.000 Zellen pro Milliliter ausgesät wurden. GS122-Zellen zeigten Überlebensgewinne in der Acht-Kilopascal-Bedingung, wenn Osteopontin-abgeleitete Peptide in die Matrix aufgenommen wurden, während der Einbau von integrinbindenden Sialoprotein- oder Tenascin-C-abgeleiteten Peptiden minimale Überlebensvorteile wie Kultur und Matrizen mit dem Ingwer-RGD-Peptid bot.Im Gegensatz dazu verschafften keine Peptide Überlebensgewinne in der 0,8-Kilopascal-Kulturbedingung. Sowohl GS122- als auch GS304-Zellen breiten sich aus, wenn sie in weichen oder steifen Hydrogelmatrizen, einschließlich RGD-haltiger Peptide, kultiviert werden. GS122-Zellen zeigen einen ähnlichen Mangel an Streuung sowohl bei 0,8 als auch bei 8 Kilopascal mit Osteopontin.GS122 zeigte jedoch nur im Zustand von acht Kilopascal eine erhöhte Resistenz gegen Temozolomid. Schließlich kann diese miniaturisierte 3D-Kulturplattform verwendet werden, um menschliche Zellen aus anderen Tumorarten zu kultivieren, einschließlich lebensfähiger Organoide von terminaldifferenzierten neuroendokrinen Prostatakrebszellen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Techniken wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung zur weiteren Charakterisierung von Zellphänotypen eingesetzt werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Forschung

Biotechnik

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Poröses Silizium Mikropartikel für die Lieferung von siRNA-Therapeutika

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

3D Hydrogel Kulturen von primären Gliazellen für In-vitro- Modellierung von Neuroinflammation verbessert

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Herstellung einer Niere Cortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Herstellung von Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays für In Vivo Neural Recording

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Eine Open-Source-Technologieplattform zur automatisierten und standardisierten Herstellung von Hydrogel-basierten 3D-Kulturmodellen

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Photodegradierbare Hydrogel-Grenzflächen für Bakterienscreening, -selektion und -isolierung

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...