Name: hydrogel arrays enable increased throughput for screening effects of matrix components and therapeutics in 3d tumor models
Uploaded: 2022-06-16T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות באופן ספציפי לקרולין קים, אמליה לאו, ריאן סטוטמור ואיטאי סולומון על תרומתם לאיטרציות מוקדמות יותר של תוכנית הפוטוגלציה. קווי הסלולר GS122 ו-GS304 סופקו בנדיבות על ידי דייוויד נתנזון. כל הדמויות נוצרו עם BioRender.com. מתקני הליבה של UCLA, המשאבים המשותפים לסינון מולקולרי והמעבדה לאפיון ננו ופיקו סייעו לעבודה. צ'ן צ'יה-צ'ון נתמך על ידי מרכז ההכשרה לרפואה רגנרטיבית ותאי גזע באוניברסיטת UCLA. גריגור ורוז'אניאן נתמך על ידי תוכנית הכשרה לביולוגיה של תאי הגידול מענק NIH (T32 CA 009056).

קווי תאי GBM שמקורם בחולה (GS122 ו- GS304) סופקו על ידי פרופסור דיוויד נתנזון (משתף הפעולה שלנו), שפיתח קווים אלה תחת פרוטוקול שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של UCLA (IRB# 10-000655). התאים סופקו ללא זיהוי כך שלא ניתן היה לקשר את קווי התאים בחזרה לחולים הבודדים.
1. הכנת תמיסת הידרוג'ל</stron...

<ol>
	<li>Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosing+the+decline+in+pharmaceutical+R&amp;D+efficiency.">Diagnosing the decline in pharmaceutical R&amp;D efficiency.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+oncology+drugs+fail+to+gain+US+regulatory+approval.">Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).</li><li>Booth, B., Ma, P., Glassman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncology's+trials.+Market+indicators.">Oncology's trials. Market indicators.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).</li><li>Da Ros, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+chemoresistance:+The+double+play+by+microenvironment+and+blood-brain+barrier.">Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).</li><li>Broekman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+communication+in+the+microenvirons+of+glioblastoma.">Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).</li><li>Grundy, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+response+of+patient-derived+primary+glioblastoma+cells+to+environmental+stiffness.">Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).</li><li>Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+human+glioblastoma+cell+culture+system+for+modeling+drug+and+radiation+responses.">A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses.</a> Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).</li><li>Simoni, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+complexes+with+biological+activity.">Basement membrane complexes with biological activity.</a> Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-mimetic+3D+culture+platforms+allow+investigation+of+cooperative+effects+of+extracellular+matrix+features+on+therapeutic+resistance+in+glioblastoma.">Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma.</a> Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li><li>Spinelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+subtypes+and+differentiation+programmes+of+glioma+stem+cells+as+determinants+of+extracellular+vesicle+profiles+and+endothelial+cell-stimulating+activities.">Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).</li><li>Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBTRUS+statistical+report:+Primary+brain+and+other+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2014-2018.">CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018.</a> Neuro-Oncology. 23, (2021).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Brennan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+somatic+genomic+landscape+of+glioblastoma.">The somatic genomic landscape of glioblastoma.</a> Cell. 155 (2), 462-477 (2013).</li><li>Tomczak, K., Czerwi&#324;ska, P., Wiznerowicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Genome+Atlas+(TCGA):+An+immeasurable+source+of+knowledge.">The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge.</a> Contemporary oncology. 19, 68-77 (2015).</li><li>Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temozolomide+resistance+in+glioblastoma+multiforme.">Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme.</a> Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).</li><li>Joo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+orthotopic+glioblastoma+xenograft+models+recapitulate+the+histopathology+and+biology+of+human+glioblastomas+in+situ.">Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ.</a> Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).</li><li>Levy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+animal+as+models:+Ethical+considerations.">The use of animal as models: Ethical considerations.</a> International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).</li><li>Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitioning+preclinical+glioblastoma+models+to+clinical+settings+with+biomarkers+identified+in+3D+cell-based+models:+A+systematic+scoping+review.">Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+scaffolds+for+3D+culture+demonstrate+extracellular+matrix-mediated+mechanisms+of+chemotherapy+resistance+in+glioblastoma.">Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma.</a> Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).</li><li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening.">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744 (2020).</li><li>Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+evaluation.">Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).</li><li>Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic-acid+based+hydrogels+for+3-dimensional+culture+of+patient-derived+Glioblastoma+Cells.">Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).</li><li>Preston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestion+products+of+the+PH20+hyaluronidase+inhibit+remyelination.">Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination.</a> Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).</li><li>Kim, Y., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44-mediated+adhesion+to+hyaluronic+acid+contributes+to+mechanosensing+and+invasive+motility.">CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility.</a> Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).</li><li>Pibuel, M. A., Poodts, D., D&#237;az, M., Hajos, S. E., Lompard&#237;a, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scrambled+story+between+hyaluronan+and+glioblastoma.">The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma.</a> The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).</li><li>Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+the+glioblastoma+microenvironment+into+engineered+experimental+models.">Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models.</a> Future Science OA. 3 (3), (2017).</li><li>Trombetta-Lima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+proteome+remodeling+in+human+glioblastoma+and+medulloblastoma.">Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma.</a> Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).</li><li>Schregel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+glioblastoma+in+an+orthotopic+mouse+model+with+magnetic+resonance+elastography.">Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography.</a> NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).</li><li>Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic-acid+based+hydrogels+for+3-dimensional+culture+of+patient-derived+glioblastoma+cells.">Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).</li><li>Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=If+cell+mechanics+can+be+described+by+elastic+modulus:+Study+of+different+models+and+probes+used+in+indentation+experiments.">If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).</li><li>Sneddon, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relation+between+load+and+penetration+in+the+axisymmetric+boussinesq+problem+for+a+punch+of+arbitrary+profile.">The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile.</a> International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).</li><li>Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elastic+modulus+of+MatrigelTM+as+determined+by+atomic+force+microscopy.">The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).</li><li>Mayerh&#246;fer, T. G., Popp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer's+law+-+Why+absorbance+depends+(almost)+linearly+on+concentration.">Beer's law - Why absorbance depends (almost) linearly on concentration.</a> Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).</li><li>Puth, M. T., Neuh&#228;user, M., Ruxton, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+variety+of+methods+for+calculating+confidence+intervals+by+bootstrapping.">On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping.</a> Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).</li><li>Lavrentieva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+hydrogels.">Gradient hydrogels.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).</li><li>Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+hydrogels+for+screening+stiffness+effects+on+patient-derived+glioblastoma+xenograft+cellfates+in+3D.">Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).</li><li>da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+glioma+models:+From+patients+to+dish+to+animals.">Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals.</a> Cells. 8 (10), 1177 (2019).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transplantation+of+enteric+neural+crest+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).</li><li>Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inhibitor+cilengitide+for+the+treatment+of+glioblastoma:+A+brief+overview+of+current+clinical+results.">Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results.</a> Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).</li></ol>

העבודה הנוכחית מציגה שיטות ליצירת תרביות תלת-ממדיות ממוזערות בתוך תרבויות מבוססות HA ובמקביל לשנות את נוקשות המטריצה והפפטידים הזמינים למעורבות באינטגרין. טכניקה זו מאפשרת מחקר שיטתי של האופן שבו פרמטרים של מטריצה משפיעים על פנוטיפים תאיים (למשל, הכדאיות של תאים סרטניים שנחשפו לכימותרפי...

העלות הצפויה של פיתוח תרופה חדשה עלתה בהתמדה בעשור האחרון, עם יותר ממיליארד דולר בהערכות הנוכחיות1. חלק מהוצאה זו הוא שיעור הכשל הגבוה של תרופות הנכנסות לניסויים קליניים. כ-12% מהמועמדים לתרופות מקבלים בסופו של דבר את אישור מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) בשנת 2019. תרופות רבות נכשלות בשלב I עקב רעילות בלתי צפויה2, בעוד שאחרות שעוברות ניסויי בטיחות עלולות להיכשל בשל חוסר יעילות3. התשה זו עקב אי-יעילות יכולה להיות מוסברת בחלקה על ידי העובדה שמודלים סרטניים המשמשים במהלך פיתוח תרופות ידועים לשמצה בכך שאינם מנבאים את היעילות הקלינית4.
ניתן לייחס פערים תפקודיים בין מודלים in vitro ו-in vivo להסרת תאים סרטניים מהמיקרו-סביבה הטבעית שלהם, כולל תאים שאינם סרטניים ו-ECM 5,6 הפיזי. בדרך כלל, קבוצות מחקר משתמשות במטריצות תרבית הזמינות מסחרית, כגון Matrigel (מטריצת קרום מרתף חלבונית שמקורה בסרקומות עכברים) כדי לספק לתאי גידול בתרבית מיקרו-סביבה של מטריצה תלת-ממדית. בהשוואה לתרבית דו-ממדית, תרבית תלת-ממדית במטריצת הממברנה שיפרה את הרלוונטיות הקלינית של תוצאות במבחנה 7,8. עם זאת, ביו-חומרים בתרבית מרקמות שעברו דה-תאיזציה, כולל מטריצת הממברנה, מפגינים בדרך כלל שונות מאצווה לאצווה שעלולה לפגוע בשכפול9. יתר על כן, מטריצות שמקורן בגידולים עם מקורות רקמה שונים מאלה שנחקרו עשויות שלא לספק את הרמזים הפיזיולוגיים המתאימים10. לבסוף, לסרטן עם דרגות גבוהות של הטרוגניות תוך-טוראלית יש תכונות מיקרו-סביבתיות המשתנות בסולם בגודל תת-מיקרון ואשר לא ניתן לכוונן את מטריצת הממברנה כדי לשחזר11.
גליובלסטומה (GBM), גידול מוח קטלני אחיד עם זמן הישרדות חציוני של כ -15 חודשים, הוא סרטן שעבורו התפתחות הטיפול הייתה קשה במיוחד12,13. סטנדרט הטיפול הנוכחי ב- GBM מורכב מכריתת גידול ראשונית, ולאחר מכן הקרנות, ולאחר מכן כימותרפיה באמצעות טמוזולומיד (TMZ)14. עם זאת, יותר ממחצית מגידולי ה-GBM הקליניים מפגינים עמידות לטיפול באמצעות מנגנונים שונים 15,16,17. חיזוי היעילות של משטר טיפול עבור מטופל בודד הוא קשה ביותר. מודלים פרה-קליניים סטנדרטיים המשמשים לחיזוי התוצאות האינדיבידואליות מורכבים מתאי גידול שמקורם בחולה, המושתלים באופן אורתוטופי בעכברים מדוכאי חיסון. בעוד ש-xenografts שמקורם בחולה יכולים לשחזר היבטים רבים של גידולי GBM קליניים והם בעלי ערך עבור מודלים פרה-קליניים18, הם יקרים מטבעם, בעלי תפוקה נמוכה, גוזלים זמן רב, וכרוכים בדאגות אתיות19. תרביות של תאים שמקורם בחולה, על משטחי פלסטיק דו-ממדיים או כספרואידים, נמנעות לרוב מבעיות אלה. בעוד שתאים שמקורם בחולה משמרים סטיות גנטיות, התרביות שלהם בדו-ממד או כספרואידים מרחפים היו במידה רבה ייצוגים גרועים של קסנוגרפטים שמקורם בחולה במכרסמים ובגידולי חולים מקוריים20. בעבר, אנו, ואחרים, הראינו שתאי GBM בתרבית ב-ECM תלת-ממדי המחקה את התכונות המכניות והביוכימיות של רקמת המוח יכולים לשמר פנוטיפים של עמידות לתרופות 10,21,22,23.
אינטראקציות בין חומצה היאלורונית (HA), רב-סוכר הנפוץ ב-ECM במוח וביטוי יתר בגידולי GBM, לבין קולטן ה-CD44 שלה מווסתים את רכישת העמידות לתרופות במבחנה 21,24,25,26,27. לדוגמה, הכללת HA בתוך תרביות תלת-ממדיות רכות הגדילה את היכולת של תאי GBM שמקורם בחולה לרכוש עמידות טיפולית. תגובתיות מכנית זו הייתה תלויה בקשירת HA לקולטני CD44 בתאי GBM21. בנוסף, קשירת אינטגרין לפפטידים נושאי RGD, ששולבו במטריצות תרבית תלת-ממדיות, הגבירה את הכימורסיסטנציה בתיווך CD44 באופן תלוי נוקשות21. מעבר ל-HA, הביטוי של מספר חלבוני ECM, שרבים מהם מכילים אזורי RGD, משתנה בין גידולים רגילים במוח ובגידולי GBM28. לדוגמה, מחקר אחד דיווח כי 28 חלבוני ECM שונים היו מווסתים מוגברת בגידולי GBM29. בתוך מיקרו-סביבה מורכבת זו של מטריצת הגידול, תאים סרטניים משלבים רמזים מכניים וביוכימיים כדי להניב פנוטיפ התנגדות מסוים, התלוי בהבדלים קטנים יחסית (למשל, פחות מסדר גודל) במודולוס של יאנג או בצפיפות של פפטידים קושרי אינטגרין 28,29,30.
הפרוטוקול הנוכחי מאפיין כיצד תאי הגידול מפרשים שילובים ייחודיים של רמזי מטריצה ומזהים מיקרו-סביבה מורכבת וספציפית לחולה, המקדמת עמידות לטיפול (איור 1A). שיטה פוטוכימית ליצירת מטריצות ממוזערות ומכווננות במדויק עבור תרבית תלת-ממדית מספקת מרחב משתנה גדול ואורתוגונלי. מערך שנבנה בהתאמה אישית של נורות LED, המופעל על ידי מיקרו-בקר, שולב בהידרוג'לים של פוטו-קרוסלינק בפורמט לוחית של 384 בארות כדי להגביר את האוטומציה ואת יכולת השכפול. עוצמת החשיפה השתנתה לרוחב היטב כדי לשנות תכונות מיקרו-מכניות של הידרוג'לים שהתקבלו, כפי שהוערך באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM). בעוד שכתב יד זה אינו מתמקד בבניית מערך ההארה עצמו, דיאגרמת מעגלים (איור 1B) ורשימת חלקים (טבלת חומרים) מסופקים ככלי עזר לשעתוק המכשיר.
דו"ח זה מדגים את הדור המהיר של מערך של תאי GBM בתרבית במיקרו-סביבה תלת-ממדית ייחודית, שבה המודולוס של יאנג (ארבע רמות בסדר גודל אחד) ותכולת הפפטידים הקושרים אינטגרין (שמקורם בארבעה חלבוני ECM שונים) היו מגוונים באופן אורתוגונלי. הגישה שימשה אז כדי לחקור את התרומות היחסיות של מכניקת ההידרוג'ל ומעורבות האינטגרין הספציפית ל-ECM על הכדאיות וההתפשטות של תאי GBM שמקורם בחולה כשהם רוכשים עמידות לכימותרפיה של טמוזולומיד (TMZ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.1 kOhm resistors, 6 W</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>35601k1ft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 nm LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>ltpl-c034uvh365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate</td>
			<td>Bio Greiner One</td>
			<td>781090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>MTC bio</td>
			<td>C4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>4arm-PEG-SH-20K-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 NPN BJTs</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>2n5550ta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 Ohm resistors, 0.125 W</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>erjj-6enf80r6v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa)</td>
			<td>Jenkem Technology</td>
			<td>A7025-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104500</td>
			<td>&#160;cell dissociation&#160; reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Probes</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td>0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 &#181;m SiO2 particle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino IDE</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>1.8.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano</td>
			<td>Makerfire</td>
			<td>Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK8</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>sorvall legend xtr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP100ST</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F148415</td>
			<td>Pipette tips for positive displacement pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubis Semi-Micro Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>MSA225S100DI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - F12 (50-50)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS Ca (-) Mg (-)</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>25-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF100-15</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P</td>
			<td>Add DI water to dilute to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-23C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G21 Supplement</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>400-160</td>
			<td>50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, ACS, 12M</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S25838A</td>
			<td>Add DI water to dilute to 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149-100Ku</td>
			<td>25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H7006-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Air Gun</td>
			<td>Wagner</td>
			<td>HT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , &#62;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP194715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall legend micro 21R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microman E single Channel Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10004</td>
			<td>Positive displacement pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Tips</td>
			<td>Various Manufacturs</td>
			<td></td>
			<td>Various sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLine micropipette</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7250-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>AFM microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ss255-1</td>
			<td>Add DI water to dilute to 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normoicin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td>500x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteopontin Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4000102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Microscope Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664201-A</td>
			<td>Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing</td>
			<td>Processing</td>
			<td>3.5.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater Pipette Tips</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td>30089430</td>
			<td>1 mL sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGD Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>GCGYGRGDSPG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoth Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>12-102,12-104</td>
			<td>5,10 mL Pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder Paste</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>315-NC191LT15T5-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder Wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight dissecting forceps</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82027-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Cell Culture Treated Flask</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temozolomide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2577</td>
			<td>Typically used from 10 &#181;M to 100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenascin-C Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR 
			GV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA700K5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Spinbar, Flea Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58948-375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrogel arrays enable increased throughput for screening effects of matrix components and therapeutics in 3d tumor models

אינטראקציות בין מטריצת תאים מתווכות תהליכים פיזיולוגיים מורכבים באמצעות רמזים ביוכימיים, מכניים וגיאומטריים, ומשפיעות על שינויים פתולוגיים ותגובות טיפוליות. התחשבות בהשפעות מטריצה מוקדם יותר בצנרת פיתוח התרופות צפויה להגדיל את הסבירות להצלחה קלינית של טיפולים חדשניים. קיימות אסטרטגיות מבוססות-חומר ביולוגי המשחזרות מיקרו-סביבה של רקמות ספציפיות בתרבית תאים תלת-ממדית, אך שילובן עם שיטות התרבית הדו-ממדיות המשמשות בעיקר לבדיקת תרופות היה מאתגר. לפיכך, הפרוטוקול המוצג כאן מפרט את פיתוח השיטות לתרבית תלת-ממדית בתוך מטריצות חומריות ביולוגיות ממוזערות בפורמט של לוחות רב-בארים כדי להקל על אינטגרציה עם צינורות סינון תרופות קיימים ומבחנים קונבנציונליים לכדאיות התא. מכיוון שתכונות המטריצה הקריטיות לשימור פנוטיפים רלוונטיים מבחינה קלינית בתאים בתרבית צפויות להיות ספציפיות מאוד לרקמות ולמחלות, יהיה צורך בסינון קומבינטורי של פרמטרי מטריצה כדי לזהות תנאים מתאימים ליישומים ספציפיים. השיטות המתוארות כאן משתמשות בתבנית תרבית ממוזערת כדי להעריך את תגובות התאים הסרטניים לשונות אורתוגונלית של מכניקת המטריצות והצגת הליגנד. באופן ספציפי, מחקר זה מדגים את השימוש בפלטפורמה זו כדי לחקור את ההשפעות של פרמטרי מטריצה על התגובות של תאי גליובלסטומה (GBM) שמקורם בחולה לכימותרפיה.

מדידות AFM אישרו שליטה מדויקת במכניקת ההידרוג'ל כפונקציה של קרינת UV (mW/cm2) במהלך הצלבת תמונות באמצעות מערך LED שנבנה בהתאמה אישית, הנשלט על ידי Arduino (איור 2A). את נוסחת ההידרוג'ל המשמשת בפרוטוקול זה ניתן למצוא בטבלה 2. הריווח של נוריות ה-LED בתבנית שסופקה תואם את הריוו...

Watch this Scientific Journal Video about Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models at JoVE.com

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פלטפורמה ניסיונית להערכת ההשפעות של רמזים מכניים וביוכימיים על תגובות כימותרפיות של תאי גליובלסטומה שמקורם בחולה בתרביות מטריצה-מימטיות תלת-ממדיות באמצעות התקן תאורת UV מותאם אישית המאפשר פוטו-קרוסלינקינג בתפוקה גבוהה של הידרוג'לים עם תכונות מכניות הניתנות לכוונון.

מערכי הידרוג'ל מאפשרים תפוקה מוגברת לסינון השפעות של רכיבי מטריצה וטיפולים במודלים תלת-ממדיים של גידולים

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור באופן שיטתי כיצד רמזי מטריצה משפיעים על הפנוטיפ של תאים בתרבית תלת-ממדית. אנו מדגימים את ההליך באמצעות תרביות של תאי GBM. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא יישום תפוקה גבוהה, המאפשר לנו לסנן תנאי מטריצה רבים.טכניקה זו יכולה לשמש לפיתוח מטריצות חיקוי רקמות המשמרות תפקודים ספציפיים במודלים של תרביות תאים, כמו עמידות לתרופות של תאי הגידול, וייתכן שהן מזהות טיפולים חדשים. המדגימות את ההליך יהיו מרי אפרסון וקלי טמורה, חוקרות לתואר ראשון ממעבדת Seidlits. התחילו בהכנת תמיסה עם חציצה HEPES על ידי המסת אבקת HEPES ב-20 מילימולאר בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס.התאימו את ה-pH לשבעה לאחר התפשטות מלאה. בתמיסה המכילה חציצה HEPES, ממיסים את ה-HA התיולטיבי כך ש-6%עד 8% משאריות החומצה הקרבוקסילית על כל חומצה גלוקורונית משתנות עם תיול בריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר בתמיסת חיץ. יש לערבב בפחות מ-1, 000 סיבובים לדקה באמצעות לוח ערבוב מגנטי בטמפרטורת החדר עד להמסה מלאה, בדרך כלל כ-45 דקות.בזמן ש-HA מתמוסס, הכינו תמיסות נפרדות של 100 מיליגרם למיליליטר של 8 גרם PEG norbornene, 100 מיליגרם למיליליטר של תיול PEG 4arm, ארבעה מילימולר של ציסטאין או פפטיד המכיל ציסטאין, וארבעה מיליגרם למיליליטר של LAP בצינורות מיקרוצנטריפוגה. הכן תמיסות של ארבעה מילימולרים של כל הפפטידים כדי להיות קשור בתוך הידרוג'ל יחיד בשלב זה. ערבבו את התמיסות הבודדות של פפטידים המכילים HA, PEG norbornene, PEG thiol ו-cysteine-thiol כדי להשיג את הריכוזים הסופיים עבור מטריצות ההידרוג'ל הסופיות.יש לערבב בפחות מ-1, 000 סיבובים בדקה על לוח מדרגות מגנטי למשך 30 דקות לפחות כדי לערבב באופן מלא. יישר את הדגימות עם התקן התאורה עם כל נורית LED אחרת בעמודה אחת של תבניות הסיליקון או צלחת 384 הבאר. פתח פרמטרים של UV LED והזן ערכים לעוצמה ותאורה.לאחר מכן לחץ על סיום כדי להתחיל בתאורה. לאחר התאורה, כאשר היא ממוקמת בפינה אחת, הזיזו את צלחת הבאר לפינה הבאה וחזרו על הפעולה. כדי להאיר בארות בחצי השני של הצלחת, הרימו את הצלחת מהמחזיק וסובבו 180 מעלות.כדי ליצור הידרוג'לים עם מכניקה משתנה, התחילו בניקוי מגלשות הזכוכית ותבניות הסיליקון באמצעות סרט הדבקה להסרת פסולת. הדביקו את תבניות הסיליקון למגלשת הזכוכית, לחצו למטה כדי להבטיח אטימה טובה והזיזו את בועות האוויר. לאחר מכן, פיפטה 80 microliters של תמיסת הידרוג'ל מבשר לתוך כל תבנית סיליקון על מגלשת הזכוכית.מקם את שקופית הזכוכית על התקן התאורה מיושר עם כל נורית LED אחרת בעמודה אחת. חשוף את מבשרי ההידרוג'ל לאור UV למשך 15 שניות כדי לצלם קישור צולב. לאחר הפסקת התאורה, שלפו את המגלשות ושחררו את הג'לים מהתבניות על ידי התחקות אחר ההיקף הפנימי של התבנית עם קצה דק.הסר תבניות סיליקון עם פינצטה או מלקחיים. מלאו צלחת של 12 בארות בשני מיליליטרים של DPBS. הזז הידרוג'לים מקושרים לתוך צלחת באר בודדת על ידי הרטבת מרית ודחיפה עדינה שלהם ממגלשת הזכוכית.הכן את התאים הרצויים כתמיסה חד-תאית. אספו כדוריות גליובלסטומה, בקוטר של כ-150 מיקרומטרים, מתרבית תרחיף של צלוחית T-75 לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. יש לשטוף את בקבוקון התרבית בחמישה מיליליטרים של DPBS כדי להסיר את שאריות התאים והמדיה ולהוסיף נפח זה לצינור החרוטי.צנטריפוגה הצינור החרוטי המכיל תאים ב 200 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנאטנט עם פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, תוך הקפדה שלא להפריע לכדור התא ולהחייאתו בחמישה מיליליטרים של DPBS. צנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לשטוף תאים.לשאוף את הסופרנטנט עם פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטרים, תוך הקפדה שלא להפריע לכדור התא, ולאחר מכן להחיות תאים בשני מיליליטרים של מגיב דיסוציאציה של תאים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות. הוסיפו שלושה מיליליטרים של מדיום שלם ובעדינות פיפטה שלוש עד חמש פעמים כדי לפרק את הספרואידים לתרחיף חד-תאי.צנטריפוגה של ההשעיה החד-תאית ב-400 פעמים G במשך חמש דקות כדי לכדור תאים בטמפרטורת החדר. לשאוף את supernatant עם פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, תוך הקפדה לא להפריע לכדור התא. תאי החייאה במיליליטר אחד של מדיום שלם.הסר חלק מהתאים לספירה באמצעות המוציטומטר. דיללו את החלק הזה פי שניים בכחול טריפאן, המחלחל לתאים עם יכולת קיום נפגעת. ספרו רק את התאים החיים וחסרי הצבע.קבע את מספר התאים הדרושים לאנקפסולציה. העבר נפח של מדיה המכילה את המספר הכולל של התאים הדרושים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.7 מיליליטר. סובבו כלפי מטה ב-400 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לשאוף את supernatant עם micropipette, תוך הקפדה לא להפריע לכדור התא. בצעו החייאה של גלולת התא בתמיסת מבשר ההידרוג'ל, תוך ערבוב טוב על ידי צנרת למעלה ולמטה עם מיקרופיפטה של 1, 000 מיקרוליטר ארבע עד חמש פעמים. טען את התאים לתוך ערכת צינורות חוזרת כדי לחלק 10 מיקרוליטרים.כדי למנוע בועות וחלוקה לא אחידה, הכינו את הצינור החוזר על ידי חלוקה של פעם או פעמיים נוספות למיכל פסולת. בכל באר של צלחת של 384 קידוחים, מחלקים 10 מיקרוליטרים של תאים התלויים בתמיסת הידרוג'ל מהפייטר החוזר. באמצעות מערך ה-LED, האירו כל תא המכיל באר למשך 15 שניות כדי להשיג את התכונות המכניות הרצויות.הוסיפו 40 מיקרוליטרים של מדיה מלאה לכל באר המכילה את התאים. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של DPBS לבארות יבשות שאינן ניסיוניות המקיפות את הג'לים כדי למזער הפסדים עקב אידוי. עבור תאי גליובלסטומה, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של התרופה המכילה מדיה כדי להשיג את הריכוז הרצוי הסופי, החל משלושה ימים לאחר האנקפסולציה.הוסף 10 מיקרוליטרים של ריאגנט CCK8 לכל באר המכילה את התאים. דגירה למשך שעה עד ארבע שעות, על פי הוראות היצרן. קרא את הספיגה ב-450 ננומטר לכל הבארות לאחר הדגירה.חקירת AFM של אזורים בקנה מידה של מיקרון על פני השטח של הידרוג'לים בודדים הראתה כי להידרוג'לים עם מודולי יאנג ממוצע רך יותר היו גם טווחים קטנים יותר של מודולי מאשר הידרוג'לים נוקשים יותר. תרביות תלת-ממדיות של תאי GS122 שנזרעו בצפיפות של 2, 500, 000 תאים למיליליטר הפגינו יכולת גבוהה משמעותית כאשר הוערכו לאחר שבעה ימים בתרבית בהשוואה לאלה שנזרעו בצפיפות של 500, 000 תאים למיליליטר. תאי GS122 הראו עליות הישרדות במצב של שמונה קילופסקל כאשר פפטידים שמקורם באוסטאופונטין נכללו במטריצה, בעוד ששילובם של פפטידי סיאלופרוטאין קושרי אינטגרין או פפטידים שמקורם בטנסין C סיפק יתרונות הישרדותיים מינימליים, כגון תרבית ומטריצות עם פפטיד RGD ג'ינג'ר.לעומת זאת, אף פפטיד לא העניק רווחי הישרדות במצב תרבית של 0.8 קילופסקל. גם תאי GS122 וגם תאי GS304 מתפשטים כאשר הם מתרבים במטריצות הידרוג'ל רכות או נוקשות, כולל פפטידים המכילים RGD. תאי GS122 מראים חוסר התפשטות דומה גם ב-0.8 וגם ב-8 קילופסקלים עם אוסטאופונטין.עם זאת, GS122 הראה רק עמידות מוגברת לטמוזולומיד במצב של שמונה קילופסקלים. לבסוף, פלטפורמת תרבית תלת-ממדית ממוזערת זו יכולה לשמש לתרבית תאים אנושיים מסוגי גידולים אחרים, כולל אורגנואידים בני קיימא של תאי סרטן ערמונית נוירואנדוקריניים ממוינים סופניים. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בטכניקות נוספות כגון ריצוף RNA חד-תאי כדי לאפיין עוד יותר את הפנוטיפים של התא.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

הנקבובי הסיליקון microparticles למשלוח Therapeutics siRNA

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel פיגומים למפרקים הכונדרוציטים תרבות וסחוס דור

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

שיפור תרבויות הידרוג 3D של תאי גליה העיקרי עבור במבחנה דוגמנות של Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

בדיית כליות קורטקס חוץ-תאית מטריקס-Derived הידרוג

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

הייצור של Ti3C2 Mxene מערכים מיקרואלקטרודה בVivo הקלטה עצבית

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

פלטפורמת טכנולוגיית קוד פתוח לייצור דגמי תרבות תלת-ממדית מבוססי הידרוג'ל באופן אוטומטי ומתוקנן

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

ממשקי הידרוג'ל הניתנים לצילום להקרנת חיידקים, בחירה ובידוד

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...