Name: hydrogel arrays enable increased throughput for screening effects of matrix components and therapeutics in 3d tumor models
Uploaded: 2022-06-16T13:10:00
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저자들은 Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore, Itay Solomon이 포토겔화 계획의 초기 반복에 기여한 것에 대해 구체적으로 인정하고 싶습니다. 세포주 GS122 및 GS304는 데이비드 네이선슨에 의해 관대하게 제공되었다. 모든 인물은 BioRender.com 로 만들어졌습니다. UCLA 핵심 시설, 분자 스크리닝 공유 자원 및 나노 및 피코 특성화 실험실이이 작업에 도움이되었습니다. Chen Chia-Chun은 UCLA Eli와 Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program의 지원을 받았습니다. Grigor Varuzhanyan은 종양 세포 생물학 교육 프로그램 NIH 그랜트 (T32 CA 009056)의 지원을 받았다.

환자 유래 GBM 세포주 (GS122 및 GS304)는 UCLA 기관 검토 위원회 (IRB # 10-000655)가 승인 한 프로토콜에 따라이 라인을 개발 한 David Nathanson 교수 (공동 작업자)에 의해 제공되었습니다. 세포주가 개별 환자와 다시 연결될 수 없도록 비확인 세포를 제공하였다.
1. 하이드로겔 용액의 제조
<ol><li>행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)에 HEPES 분말을 20mM로 용해시켜 HEPES 완충 용액?...

<ol>
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현재의 연구는 HA 기반 내에서 3D, 소형화 된 배양물을 생성하는 동시에 인테그린 결합에 사용할 수있는 매트릭스 강성과 펩타이드를 변경하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 매트릭스 파라미터가 증가된 처리량으로 세포 표현형(예를 들어, 화학요법에 노출된 암 세포의 생존력)에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 체계적인 연구를 가능하게 한다. 본원에 제시된 것을 포함하는 이전의 접근법들은 ?...

신약 개발의 예상 비용은 지난 10 년 동안 꾸준히 상승했으며 현재 추정치에서 10 억 달러 이상이었습니다 1. 이 비용의 일부는 임상 시험에 들어가는 약물의 높은 실패율입니다. 약물 후보의 약 12 %는 궁극적으로 2019 년 미국 (미국) 식품 의약품 안전청 (FDA)의 승인을 얻습니다. 많은 약물이 예기치 않은 독성2로 인해 I 단계에서 실패하는 반면, 안전성 시험을 통과 한 다른 약물은 효능 부족으로 인해 실패 할 수 있습니다3. 비효능으로 인한 이러한 감소는 약물 개발 동안 사용되는 암 모델이 임상적 효능의 비예측으로 악명 높다는 사실에 의해 부분적으로 설명될 수 있다4.
시험관내 및 생체내 모델 사이의 기능적 불균형은 비종양 세포 및 물리적 ECM 5,6을 포함하는 그들의 천연 미세환경으로부터 암 세포를 제거하는 것에 기인할 수 있다. 일반적으로 연구 그룹은 Matrigel (마우스 육종에서 유래 한 단백질성 기저막 매트릭스)과 같은 상업적으로 이용 가능한 배양 매트릭스를 사용하여 배양 된 종양 세포에 3D 매트릭스 미세 환경을 제공합니다. 2D 배양과 비교하여, 막 매트릭스에서의 3D 배양은 시험관내 결과 7,8의 임상적 관련성을 개선시켰다. 그러나, 막 매트릭스를 포함하는 탈세포화된 조직으로부터의 배양 생체재료는, 전형적으로 재현성9를 손상시킬 수 있는 배치-배치-배치-배치 가변성을 나타낸다. 더욱이, 연구된 것들로부터 상이한 조직 기원을 갖는 종양으로부터 유래된 매트릭스는 적절한 생리학적 단서(10)를 제공하지 않을 수 있다. 마지막으로, 종양내 이질성이 높은 암은 서브마이크론 크기 규모에 따라 다양하고 막 매트릭스가11을 재조정하도록 조정될 수 없는 미세환경적 특징을 갖는다.
교모세포종(GBM)은 약 15개월의 중간 생존 시간을 갖는 균일하게 치명적인 뇌종양으로, 치료 개발이 특히 어려웠던 암이다12,13. GBM에 대한 현재의 치료 표준은 원발성 종양 절제술, 방사선 요법, 그리고 테모졸로마이드 (TMZ)14를 사용한 화학 요법으로 구성됩니다. 그러나 임상 GBM 종양의 절반 이상이 다양한 메커니즘 15,16,17을 통해 치료 저항성을 나타냅니다. 개별 환자에 대한 치료 요법의 효능을 예측하는 것은 매우 어렵습니다. 개별 결과를 예측하는 데 사용되는 표준 전임상 모델은 면역저하된 마우스에 정형외적으로 이종이식편된 환자 유래 종양 세포로 구성된다. 환자 유래 이종이식편은 임상 GBM 종양의 여러 측면을 재검토할 수 있고 전임상 모델(18)에 가치가 있지만, 본질적으로 비용이 많이 들고, 처리량이 낮고, 시간이 많이 걸리며, 윤리적 관심사19를 수반한다. 환자 유래 세포의 배양, 2D 플라스틱 표면 또는 구상체는 대부분 이러한 문제를 피합니다. 환자 유래 세포는 유전적 수차를 보존하는 반면, 2D 또는 현탁된 구상체로서의 그들의 배양은 설치류 및 원래 환자 종양(20)에서 환자 유래 이종이식편의 표현이 대체로 불량하였다. 이전에 우리와 다른 사람들은 뇌 조직의 기계적 및 생화학 적 특성을 모방 한 3D ECM에서 배양 된 GBM 세포가 약물 내성 표현형10,21,22,23을 보존 할 수 있음을 보여주었습니다.
뇌 ECM에 풍부하며 GBM 종양에서 과발현되는 다당류인 히알루론산(HA)과 이의 CD44 수용체 사이의 상호작용은 시험관내 약물 내성의 획득을 조절한다 21,24,25,26,27. 예를 들어, 연질, 3D 배양물 내에 HA를 포함시키는 것은 치료 내성을 획득하는 환자 유래 GBM 세포의 능력을 증가시켰다. 이러한 메카노-반응성은 GBM 세포21 상의 CD44 수용체에 대한 HA 결합에 의존하였다. 추가적으로, RGD 함유 펩티드에 대한 인테그린 결합은, 3D 배양 매트릭스에 혼입되어, 강성 의존적 방식으로 CD44 매개된 화학저항성을 증폭시켰다21. HA 이외에도, RGD 영역을 함유하는 많은 ECM 단백질의 발현은 정상 뇌와 GBM 종양(28) 사이에서 다양하다. 예를 들어, 한 연구는 GBM 종양29에서 28 개의 별개의 ECM 단백질이 상향 조절되었다고보고했습니다. 이러한 복잡한 종양 매트릭스 미세환경 내에서, 암 세포는 기계적 및 생화학적 단서를 통합하여 특정 내성 표현형을 산출하는데, 이는 인테그린 결합 펩티드28,29,30의 영 모듈러스 또는 밀도에서 상대적으로 작은 차이(예를 들어, 크기 차수 미만)에 의존한다.
본 프로토콜은 종양 세포가 매트릭스 단서의 고유한 조합을 해석하고 치료 저항성을 촉진하는 복잡하고 환자 특정 매트릭스 미세환경을 식별하는 방법을 특성화합니다(그림 1A). 3D 배양을 위해 소형화되고 정밀하게 조정된 매트릭스를 생성하는 광화학적 방법은 크고 직교하는 가변 공간을 제공합니다. 마이크로 컨트롤러에 의해 실행되는 맞춤형 LED 어레이가 384웰 플레이트 형식 내의 포토크로스링크 하이드로젤에 통합되어 자동화 및 재현성을 높였습니다. 노출 강도는 원자력 현미경 (AFM)을 사용하여 평가된 바와 같이 생성된 하이드로젤의 마이크로기계적 특성을 변경시키기 위해 웰에 걸쳐 다양하였다. 이 원고는 조명 어레이 자체를 구성하는 데 초점을 맞추지는 않지만 회로도(그림 1B) 및 부품 목록(재료 표)은 장치 재생을 위한 보조 도구로 제공됩니다.
이 보고서는 영 모듈러스 (단일 크기의 순서에 걸쳐 네 가지 수준)와 인테그린 결합 펩티드 함량 (네 가지 ECM 단백질에서 유래)이 직교적으로 다양한 독특한 3D 미세 환경에서 배양 된 GBM 세포 어레이의 신속한 생성을 보여줍니다. 이 접근법은 테모졸로마이드 (TMZ) 화학요법에 대한 내성을 획득함에 따라 환자 유래 GBM 세포의 생존 가능성 및 증식에 대한 하이드로겔 역학 및 ECM 특이적 인테그린 결합의 상대적 기여를 조사하기 위해 사용되었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.1 kOhm resistors, 6 W</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>35601k1ft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 nm LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>ltpl-c034uvh365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate</td>
			<td>Bio Greiner One</td>
			<td>781090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>MTC bio</td>
			<td>C4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>4arm-PEG-SH-20K-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 NPN BJTs</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>2n5550ta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 Ohm resistors, 0.125 W</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>erjj-6enf80r6v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa)</td>
			<td>Jenkem Technology</td>
			<td>A7025-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104500</td>
			<td>&#160;cell dissociation&#160; reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Probes</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td>0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 &#181;m SiO2 particle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino IDE</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>1.8.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano</td>
			<td>Makerfire</td>
			<td>Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK8</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>sorvall legend xtr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP100ST</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F148415</td>
			<td>Pipette tips for positive displacement pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubis Semi-Micro Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>MSA225S100DI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - F12 (50-50)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS Ca (-) Mg (-)</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>25-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF100-15</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P</td>
			<td>Add DI water to dilute to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-23C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G21 Supplement</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>400-160</td>
			<td>50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, ACS, 12M</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S25838A</td>
			<td>Add DI water to dilute to 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149-100Ku</td>
			<td>25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H7006-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Air Gun</td>
			<td>Wagner</td>
			<td>HT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , &#62;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP194715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall legend micro 21R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microman E single Channel Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10004</td>
			<td>Positive displacement pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Tips</td>
			<td>Various Manufacturs</td>
			<td></td>
			<td>Various sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLine micropipette</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7250-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>AFM microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ss255-1</td>
			<td>Add DI water to dilute to 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normoicin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td>500x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteopontin Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4000102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Microscope Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664201-A</td>
			<td>Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing</td>
			<td>Processing</td>
			<td>3.5.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater Pipette Tips</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td>30089430</td>
			<td>1 mL sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGD Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>GCGYGRGDSPG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoth Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>12-102,12-104</td>
			<td>5,10 mL Pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder Paste</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>315-NC191LT15T5-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder Wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight dissecting forceps</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82027-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Cell Culture Treated Flask</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temozolomide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2577</td>
			<td>Typically used from 10 &#181;M to 100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenascin-C Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR 
			GV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA700K5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Spinbar, Flea Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58948-375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrogel arrays enable increased throughput for screening effects of matrix components and therapeutics in 3d tumor models

세포 - 매트릭스 상호 작용은 생화학적, 기계적, 기하학적 단서를 통해 복잡한 생리 학적 과정을 중재하여 병리학 적 변화와 치료 반응에 영향을 미칩니다. 약물 개발 파이프라인 초기에 매트릭스 효과를 고려하면 새로운 치료제의 임상 성공 가능성이 높아질 것으로 예상된다. 3D 세포 배양에서 특정 조직 미세 환경을 재순환시키는 생체 재료 기반 전략은 존재하지만 이를 약물 스크리닝에 주로 사용되는 2D 배양 방법과 통합하는 것은 어려운 과제였습니다. 따라서, 여기에 제시된 프로토콜은 세포 생존을 위한 기존 약물 스크리닝 파이프라인 및 종래의 분석과의 통합을 용이하게 하기 위해 다중 웰 플레이트 포맷으로 소형화된 생체재료 매트릭스 내에서 3D 배양을 위한 방법의 개발을 상세히 기술한다. 배양된 세포에서 임상적으로 관련된 표현형을 보존하는데 중요한 매트릭스 특징이 고도로 조직- 및 질병-특이적일 것으로 예상되기 때문에, 매트릭스 파라미터의 조합 스크리닝은 특정 적용을 위한 적절한 조건을 식별하기 위해 필요할 것이다. 여기에 설명된 방법들은 매트릭스 역학 및 리간드 프리젠테이션의 직교 변이에 대한 암 세포 반응을 평가하기 위해 소형화된 배양 포맷을 사용한다. 구체적으로, 본 연구는 화학요법에 대한 환자 유래 교모세포종 (GBM) 세포의 반응에 대한 매트릭스 파라미터의 효과를 조사하기 위해 이 플랫폼의 사용을 입증한다.

AFM 측정은 맞춤형 Arduino 제어 LED 어레이를 사용하여 광가교 중에 UV 조도(mW/cm2)의 함수로서 하이드로겔 역학의 정밀한 제어를 확인했다(그림 2A). 이 프로토콜에 사용된 하이드로겔 제형은 표 2에서 확인할 수 있다. 제공된 템플릿에 있는 LED의 간격은 384웰 플레이트의 다른 모든 웰의 간격과 일치하므로 플레이트 내부에 젤을 형성할 수 있습니다(<strong class...

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Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

본 프로토콜은 맞춤형 UV 조명 장치를 사용하여 3D 매트릭스-모방 배양물에서 환자 유래 교모세포종 세포의 화학요법 반응에 대한 기계적 및 생화학적 단서의 영향을 평가하기 위한 실험 플랫폼을 기술하며, 조정 가능한 기계적 특징을 갖는 하이드로젤의 고처리량 광가교를 용이하게 한다.

하이드로겔 어레이는 3D 종양 모델에서 매트릭스 성분 및 치료제의 스크리닝 효과를 위한 처리량 증가를 가능하게 합니다.

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

이 방법을 통해 연구자들은 매트릭스 단서가 3D 배양에서 세포의 표현형에 어떻게 영향을 미치는지 체계적으로 조사 할 수 있습니다. GBM 세포의 배양물을 이용한 절차를 입증한다. 이 기술의 가장 큰 장점은 많은 매트릭스 조건을 스크리닝 할 수있는 높은 처리량 구현입니다.이 기술은 종양 세포의 약물 내성과 같은 세포 배양 모델에서 특정 기능을 보존하고 잠재적으로 새로운 치료제를 식별하는 조직 모방 매트릭스를 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 Seidlits Lab의 학부 연구원 인 Mary Epperson과 Kelly Tamura입니다. 행크스 균형 잡힌 소금 용액에 HEPES 분말을 20 밀리몰로 용해시켜 HEPES 완충 용액을 준비하는 것으로 시작하십시오.완전 흡착 후 pH를 일곱 개로 조정하십시오. HEPES 완충 용액에서, 티올화된 HA를 용해시켜 각 글루쿠론산 상의 6 내지 8%의 카르복실산 잔기가 완충 용액 중에 밀리리터당 10밀리그램의 농도로 티올로 개질되도록 한다. 완전히 용해될 때까지, 전형적으로 약 45분 동안 실온에서 자석 교반 플레이트를 사용하여 분당 1, 000회 회전으로 교반한다.HA가 용해되는 동안, 마이크로원심분리 튜브에서 8arm PEG 노르보르넨의 밀리리터당 100밀리그램, 4arm PEG 티올의 밀리리터당 100밀리그램, 시스테인 또는 시스테인 함유 펩티드의 4밀리몰, 및 LAP의 밀리리터당 4밀리그램의 분리된 용액을 준비한다. 이 시점에서 단일 하이드로겔 내에 테더링될 모든 펩티드의 네 밀리몰 용액을 준비한다. HA, PEG 노보넨, PEG 티올, 및 시스테인-티올-함유 펩티드의 개별 용액을 혼합하여 최종 히드로겔 매트릭스에 대한 최종 농도를 달성한다.자기 계단 플레이트에서 분당 1, 000회 미만으로 30분 이상 저어주어 완전히 혼합합니다. 샘플을 실리콘 몰드 또는 384웰 플레이트의 단일 컬럼에 있는 다른 모든 LED와 조명 장치와 정렬합니다. UV LED 매개 변수를 열고 강도 및 조명 값을 입력하십시오.그런 다음 마침을 클릭하여 조명을 시작하십시오. 조명에 이어 한쪽 모서리에 놓으면 웰 플레이트를 다음 모서리로 이동하고 반복하십시오. 플레이트의 나머지 절반에 있는 웰을 비추려면 플레이트를 홀더에서 들어올려 180도 회전시킵니다.다양한 역학을 가진 하이드로젤을 생성하려면 테이프를 사용하여 유리 슬라이드와 실리콘 몰드를 청소하여 이물질을 제거하십시오. 실리콘 몰드를 유리 슬라이드에 부착하고 아래로 눌러 좋은 씰을 보장하고 기포를 대체하십시오. 다음으로, 80 마이크로리터의 하이드로겔 전구체 용액을 유리 슬라이드 상의 각 실리콘 몰드에 피펫팅한다.유리 슬라이드를 단일 열의 다른 모든 LED와 정렬된 조명 장치 위에 놓습니다. 하이드로겔 전구체를 15초 동안 자외선에 노출시켜 포토 가교결합시킨다. 조명이 멈 추면 슬라이드를 검색하고 미세한 팁으로 금형의 내부 둘레를 추적하여 금형에서 젤을 느슨하게하십시오.핀셋이나 포셉으로 실리콘 몰드를 제거하십시오. 12웰 플레이트에 2밀리리터의 DPBS를 채웁니다. 가교 된 하이드로 젤을 주걱을 적시고 유리 슬라이드에서 부드럽게 밀어 넣어 개별 웰 플레이트로 옮깁니다.원하는 세포를 단일 세포 용액으로 준비하십시오. 직경 약 150 마이크로미터의 교모세포종 구상체를 T-75 플라스크 현탁액 배양물에서 15밀리리터 원뿔형 튜브로 수집합니다. 배양 플라스크를 다섯 밀리리터의 DPBS로 헹구어 잔류 세포 및 배지를 제거하고 이 부피를 원뿔형 튜브에 첨가한다.세포를 함유하는 원뿔형 튜브를 실온에서 5분 동안 200배 G에서 원심분리한다. 원심분리 후, 상층액을 다섯 밀리리터 혈청학적 피펫으로 제거하고, 세포 펠릿을 교란시키지 않도록 주의하고, 다섯 밀리리터의 DPBS에 재현탁시킨다. 실온에서 5분 동안 200배 G에서 원심분리하여 세포를 세척한다.상층액을 다섯 밀리리터 혈청 학적 피펫으로 흡인하고, 세포 펠릿을 방해하지 않도록주의 한 다음 세포를 두 밀리리터의 세포 해리 시약으로 재현탁하십시오. 실온에서 10 내지 15분 동안 인큐베이션한다. 세 밀리리터의 완전한 배지를 넣고 부드럽게 피펫을 세 번에서 다섯 번 넣어 구상체를 단일 세포 현탁액으로 분해합니다.단일 세포 현탁액을 실온에서 세포를 펠릿화하기 위해 5분 동안 400배 G에서 원심분리한다. 상층액을 다섯 밀리리터 혈청 학적 피펫으로 흡인하여 세포 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오. 세포를 한 밀리리터의 완전한 배지에 재현탁하십시오.혈구측정기를 사용하여 계수하기 위해 세포의 일부를 제거하십시오. 이 부분을 트립판 블루로 두 배로 희석하여 생존력이 손상된 세포에 침투시킵니다. 살아있는 무색 세포 만 계산하십시오.캡슐화에 필요한 셀 수를 결정합니다. 필요한 총 세포 수를 포함하는 배지의 부피를 멸균 1.7밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 옮긴다. 실온에서 5분 동안 400배 G에서 회전합니다.상층액을 마이크로 피펫으로 흡인하고, 세포 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오. 세포 펠릿을 하이드로겔 전구체 용액에 재현탁시키고, 1, 000 마이크로리터 마이크로피펫으로 네 번 내지 다섯 번 위아래로 피펫팅함으로써 잘 혼합한다. 세포를 10 마이크로리터를 분배하도록 설정된 반복 피미터에 로드하십시오.거품과 고르지 않은 분배를 피하려면 폐기물 용기에 한 두 번 추가로 분배하여 반복 배관기를 프라이밍하십시오. 384-웰 플레이트의 각 웰에서, 하이드로겔 용액에 현탁된 10 마이크로리터의 세포를 반복 피펫터로부터 분배한다. LED 어레이를 사용하여 셀이 포함된 각 웰을 15초 동안 비추어 원하는 기계적 특성을 달성합니다.세포를 포함하는 각 웰에 40 마이크로리터의 완전한 배지를 첨가한다. 50 마이크로리터의 DPBS를 겔을 둘러싸고 있는 비실험적 건조 웰에 첨가하여 증발로 인한 손실을 최소화합니다. 교모세포종 세포의 경우, 캡슐화 후 사흘 후에 시작하여 최종 원하는 농도를 달성하기 위해 배지 함유 약물 40 마이크로리터를 첨가하십시오.10 마이크로리터의 CCK8 시약을 세포가 들어있는 각 웰에 첨가한다. 제조업체의 지침에 따라 한 시간에서 네 시간 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후 모든 웰에 대해 450 나노미터에서 흡광도를 판독하십시오.단일 하이드로젤의 표면에서 미크론 스케일 영역에 대한 AFM 심문은 더 부드러운 평균 영 모듈리를 갖는 하이드로젤이 또한 더 뻣뻣한 하이드로젤보다 더 작은 모듈리 범위를 갖는다는 것을 보여주었다. 밀리리터 당 2, 500, 000 세포의 밀도로 시딩된 GS122 세포의 3D 배양물은 밀리리터 당 500, 000 세포의 밀도로 시딩된 것과 비교하여 배양에서 7일 후에 평가되었을 때 실질적으로 더 높은 생존력을 나타내었다. GS122 세포는 오스테오폰틴 유래 펩타이드가 매트릭스에 포함되었을 때 8킬로파스칼 조건에서 생존 이득을 보인 반면, 인테그린 결합 시알로단백질 또는 테나신 C 유래 펩타이드의 혼입은 생강 RGD 펩타이드와 배양 및 매트릭스와 같은 최소한의 생존 이점을 제공했다.대조적으로, 어떠한 펩티드도 0.8 킬로파스칼 배양 조건에서 생존 이득을 부여하지 않았다. GS122 및 GS304 세포 둘 다 RGD 함유 펩티드를 포함하는 연질 또는 뻣뻣한 하이드로겔 매트릭스에서 배양될 때 확산된다. GS122 세포는 오스테오폰틴과 함께 0.8 및 8 킬로파스칼 모두에서 확산의 유사한 결핍을 보여준다.그러나, GS122는 단지 8킬로파스칼 조건에서 테모졸로마이드에 대한 향상된 내성을 나타냈다. 마지막으로, 이 소형화된 3D 배양 플랫폼은 말기 분화된 신경내분비 전립선암 세포의 실행 가능한 오가노이드를 포함하는 다른 종양 유형으로부터 인간 세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 이 절차에 따라, 단세포 RNA 시퀀싱과 같은 추가 기술을 사용하여 세포 표현형을 추가로 특성화할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

입자 추적 microrheology은을 사용하여 3D 종양 모델에서 세포 외 매트릭스 강성의 경도 측정

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

연구

생체공학

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

siRNA를 치료제의 전달을위한 다공성 실리콘 미세 입자

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

생체 외에서 Neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 Glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

날조는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 하이드로 겔

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

매트릭스 세포 대사 크로스토크 연구를 위한 인간 3D 세포외 세포외 매트릭스-세포세포 배양 모델

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

생체 내 신경 녹음을 위한 Ti3C2 MXene 마이크로 전극 어레이 의 제조

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

하이드로겔 기반 3D 문화 모델을 자동화및 표준화방식으로 제조하는 오픈 소스 기술 플랫폼

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

박테리아 스크리닝, 선택 및 격리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...