Name: hydrogel arrays enable increased throughput for screening effects of matrix components and therapeutics in 3d tumor models
Uploaded: 2022-06-16T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models at JoVE.com

Yazarlar, Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore ve Itay Solomon'a fotojelasyon şemasının önceki yinelemelerine katkılarından dolayı özellikle teşekkür etmek istiyor. GS122 ve GS304 hücre hatları David Nathanson tarafından cömertçe sağlandı. Tüm figürler BioRender.com ile yaratılmıştır. UCLA çekirdek tesisleri, Moleküler Tarama Ortak Kaynakları ve Nano ve Pico Karakterizasyon Laboratuvarı çalışmaya yardımcı oldu. Chen Chia-Chun, UCLA Eli ve Edythe Geniş Rejeneratif Tıp Merkezi ve Kök Hücre Araştırma Eğitim Programı tarafından desteklendi. Grigor Varuzhanyan, Tümör Hücresi Biyolojisi Eğitim Programı NIH Grant (T32 CA 009056) tarafından desteklendi.

Hasta kaynaklı GBM hücre hatları (GS122 ve GS304), bu hatları UCLA Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB # 10-000655) tarafından onaylanan bir protokol altında geliştiren Profesör David Nathanson (ortak çalışanımız) tarafından sağlanmıştır. Hücreler, hücre hatlarının bireysel hastalara geri bağlanamaması için kimliksizleştirilmiş olarak sağlandı.
1. Hidrojel çözeltisinin hazırlanması
<ol><li>HEPES tozunu Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) 20 ...

<ol>
	<li>Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosing+the+decline+in+pharmaceutical+R&amp;D+efficiency.">Diagnosing the decline in pharmaceutical R&amp;D efficiency.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+oncology+drugs+fail+to+gain+US+regulatory+approval.">Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).</li><li>Booth, B., Ma, P., Glassman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncology's+trials.+Market+indicators.">Oncology's trials. Market indicators.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).</li><li>Da Ros, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+chemoresistance:+The+double+play+by+microenvironment+and+blood-brain+barrier.">Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).</li><li>Broekman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+communication+in+the+microenvirons+of+glioblastoma.">Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).</li><li>Grundy, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+response+of+patient-derived+primary+glioblastoma+cells+to+environmental+stiffness.">Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).</li><li>Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+human+glioblastoma+cell+culture+system+for+modeling+drug+and+radiation+responses.">A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses.</a> Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).</li><li>Simoni, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+complexes+with+biological+activity.">Basement membrane complexes with biological activity.</a> Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-mimetic+3D+culture+platforms+allow+investigation+of+cooperative+effects+of+extracellular+matrix+features+on+therapeutic+resistance+in+glioblastoma.">Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma.</a> Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li><li>Spinelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+subtypes+and+differentiation+programmes+of+glioma+stem+cells+as+determinants+of+extracellular+vesicle+profiles+and+endothelial+cell-stimulating+activities.">Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).</li><li>Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBTRUS+statistical+report:+Primary+brain+and+other+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2014-2018.">CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018.</a> Neuro-Oncology. 23, (2021).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Brennan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+somatic+genomic+landscape+of+glioblastoma.">The somatic genomic landscape of glioblastoma.</a> Cell. 155 (2), 462-477 (2013).</li><li>Tomczak, K., Czerwi&#324;ska, P., Wiznerowicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Genome+Atlas+(TCGA):+An+immeasurable+source+of+knowledge.">The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge.</a> Contemporary oncology. 19, 68-77 (2015).</li><li>Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temozolomide+resistance+in+glioblastoma+multiforme.">Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme.</a> Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).</li><li>Joo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+orthotopic+glioblastoma+xenograft+models+recapitulate+the+histopathology+and+biology+of+human+glioblastomas+in+situ.">Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ.</a> Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).</li><li>Levy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+animal+as+models:+Ethical+considerations.">The use of animal as models: Ethical considerations.</a> International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).</li><li>Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitioning+preclinical+glioblastoma+models+to+clinical+settings+with+biomarkers+identified+in+3D+cell-based+models:+A+systematic+scoping+review.">Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+scaffolds+for+3D+culture+demonstrate+extracellular+matrix-mediated+mechanisms+of+chemotherapy+resistance+in+glioblastoma.">Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma.</a> Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).</li><li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening.">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744 (2020).</li><li>Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+evaluation.">Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).</li><li>Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic-acid+based+hydrogels+for+3-dimensional+culture+of+patient-derived+Glioblastoma+Cells.">Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).</li><li>Preston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestion+products+of+the+PH20+hyaluronidase+inhibit+remyelination.">Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination.</a> Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).</li><li>Kim, Y., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44-mediated+adhesion+to+hyaluronic+acid+contributes+to+mechanosensing+and+invasive+motility.">CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility.</a> Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).</li><li>Pibuel, M. A., Poodts, D., D&#237;az, M., Hajos, S. E., Lompard&#237;a, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scrambled+story+between+hyaluronan+and+glioblastoma.">The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma.</a> The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).</li><li>Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+the+glioblastoma+microenvironment+into+engineered+experimental+models.">Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models.</a> Future Science OA. 3 (3), (2017).</li><li>Trombetta-Lima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+proteome+remodeling+in+human+glioblastoma+and+medulloblastoma.">Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma.</a> Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).</li><li>Schregel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+glioblastoma+in+an+orthotopic+mouse+model+with+magnetic+resonance+elastography.">Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography.</a> NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).</li><li>Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic-acid+based+hydrogels+for+3-dimensional+culture+of+patient-derived+glioblastoma+cells.">Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).</li><li>Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=If+cell+mechanics+can+be+described+by+elastic+modulus:+Study+of+different+models+and+probes+used+in+indentation+experiments.">If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).</li><li>Sneddon, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relation+between+load+and+penetration+in+the+axisymmetric+boussinesq+problem+for+a+punch+of+arbitrary+profile.">The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile.</a> International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).</li><li>Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elastic+modulus+of+MatrigelTM+as+determined+by+atomic+force+microscopy.">The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).</li><li>Mayerh&#246;fer, T. G., Popp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer's+law+-+Why+absorbance+depends+(almost)+linearly+on+concentration.">Beer's law - Why absorbance depends (almost) linearly on concentration.</a> Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).</li><li>Puth, M. T., Neuh&#228;user, M., Ruxton, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+variety+of+methods+for+calculating+confidence+intervals+by+bootstrapping.">On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping.</a> Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).</li><li>Lavrentieva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+hydrogels.">Gradient hydrogels.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).</li><li>Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+hydrogels+for+screening+stiffness+effects+on+patient-derived+glioblastoma+xenograft+cellfates+in+3D.">Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).</li><li>da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+glioma+models:+From+patients+to+dish+to+animals.">Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals.</a> Cells. 8 (10), 1177 (2019).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transplantation+of+enteric+neural+crest+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).</li><li>Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inhibitor+cilengitide+for+the+treatment+of+glioblastoma:+A+brief+overview+of+current+clinical+results.">Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results.</a> Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).</li></ol>

Mevcut çalışma, HA tabanlı 3D, minyatür kültürler üretmek için yöntemler sunarken, aynı zamanda integrin katılımı için mevcut matris sertliğini ve peptitleri değiştirmektedir. Bu teknik, matris parametrelerinin hücresel fenotipleri (örneğin, kemoterapiye maruz kalan kanser hücrelerinin yaşayabilirliği) artan verimle nasıl etkilediğinin sistematik olarak incelenmesini sağlar. Burada sunulanlar da dahil olmak üzere önceki yaklaşımlar, daha sert hidrojellerin daha yüksek polimer içeriğine s...

Yeni bir ilaç geliştirmenin beklenen maliyeti, son on yılda istikrarlı bir şekilde artmıştır ve mevcut tahminlerde 1 milyar doların üzerinde 1 milyar dolardan fazladır1. Bu masrafın bir kısmı, klinik çalışmalara giren ilaçların yüksek başarısızlık oranıdır. İlaç adaylarının yaklaşık% 12'si nihayetinde 2019 yılında Amerika Birleşik Devletleri (ABD) Gıda ve İlaç İdaresi'nden (FDA) onay almaktadır. Birçok ilaç, beklenmedik toksisite2 nedeniyle Faz I'de başarısız olurken, güvenlik denemelerini geçen diğerleri etkinlik eksikliği nedeniyle başarısız olabilir3. Etkinliksizlikten kaynaklanan bu yıpranma, kısmen, ilaç geliştirme sırasında kullanılan kanser modellerinin klinik etkinliğin öngörücü olmadığı gerçeğiyle açıklanabilir4.
İn vitro ve in vivo modeller arasındaki fonksiyonel eşitsizlikler, tümör dışı hücreler ve fiziksel ECM 5,6 dahil olmak üzere kanser hücrelerinin doğal mikro ortamlarından çıkarılmasına bağlanabilir. Yaygın olarak, araştırma grupları, kültürlenmiş tümör hücrelerine 3D matris mikro ortamı sağlamak için Matrigel (fare sarkomlarından türetilen proteinli bir bazal membran matrisi) gibi ticari olarak temin edilebilen kültür matrislerini kullanır. 2D kültür ile karşılaştırıldığında, membran matrisindeki 3D kültür, in vitro sonuçların klinik alaka düzeyini geliştirmiştir 7,8. Bununla birlikte, membran matrisi de dahil olmak üzere hücresellikten arındırılmış dokulardan elde edilen kültür biyomateryalleri, tipik olarak, tekrarlanabilirliği tehlikeye atabilecek partiden partiye değişkenlik sergiler9. Ayrıca, incelenenlerden farklı doku kökenlerine sahip tümörlerden türetilen matrisler, uygun fizyolojik ipuçlarını sağlamayabilir10. Son olarak, yüksek derecede intratümöral heterojenliğe sahip kanserler, mikron altı boyuttaki bir ölçekte değişen ve membran matrisinin11'i özetlemek üzere ayarlanamadığı mikroçevresel özelliklere sahiptir.
Glioblastoma (GBM), medyan sağkalım süresi yaklaşık 15 ay olan düzgün ölümcül bir beyin tümörüdür, tedavi gelişiminin özellikle zor olduğu bir kanserdir12,13. GBM için mevcut bakım standardı, primer tümör rezeksiyonu, ardından radyoterapi ve ardından temozolamid (TMZ) kullanılarak kemoterapiden oluşmaktadır 14. Ancak klinik GBM tümörlerinin yarısından fazlası çeşitli mekanizmalarla tedavi direnci göstermektedir15,16,17. Bireysel bir hasta için bir tedavi rejiminin etkinliğini tahmin etmek son derece zordur. Bireysel sonuçları tahmin etmek için kullanılan standart klinik öncesi modeller, immün sistemi baskılanmış farelere ortopik olarak ksenograflanmış hasta kaynaklı tümör hücrelerinden oluşur. Hasta kaynaklı ksenogreftler klinik GBM tümörlerinin birçok yönünü özetleyebilse ve klinik öncesi modeller için değerli olsa da18, doğası gereği pahalı, düşük verimli, zaman alıcı ve etik kaygılar içerir19. Hasta kaynaklı hücrelerin kültürleri, 2D plastik yüzeylerde veya sferoidler olarak, çoğunlukla bu sorunlardan kaçınır. Hasta kaynaklı hücreler genetik anormallikleri korurken, kültürleri 2D veya askıya alınmış sferoidler olarak kemirgenlerde ve orijinal hasta tümörlerinde hasta kaynaklı ksenogreftlerin büyük ölçüde zayıf temsilleri olmuştur20. Daha önce, biz ve diğerleri, beyin dokusunun mekanik ve biyokimyasal özelliklerini taklit eden bir 3D ECM'de kültürlenen GBM hücrelerinin, ilaç direnci fenotipleri10,21,22,23'ü koruyabileceğini göstermiştir.
Beyin ECM'sinde bol miktarda bulunan ve GBM tümörlerinde aşırı eksprese edilen bir polisakkarit olan hyaluronik asit (HA) ile CD44 reseptörü arasındaki etkileşimler, in vitro21,24,25,26,27 ilaç direncinin kazanılmasını modüle eder. Örneğin, HA'nın yumuşak, 3D kültürlere dahil edilmesi, hasta kaynaklı GBM hücrelerinin terapötik direnç kazanma yeteneğini arttırdı. Bu mekano-sorumluluk, GBM hücreleri21 üzerindeki CD44 reseptörlerine HA bağlanmasına bağlıydı. Ek olarak, 3D kültür matrislerine dahil edilen RGD taşıyan peptitlere integrin bağlanması, CD44 aracılı kemodirenci sertliğe bağlı bir şekilde yükseltti21. HA'nın ötesinde, birçoğu RGD bölgeleri içeren birkaç ECM proteininin ekspresyonu, normal beyin ve GBM tümörleri arasında değişir28. Örneğin, bir çalışma, GBM tümörleri29'da 28 farklı ECM proteininin yukarı regüle edildiğini bildirmiştir. Bu karmaşık tümör matriksi mikro ortamında, kanser hücreleri, Young'ın modülünde veya integrin bağlayıcı peptitlerin yoğunluğunda nispeten küçük farklılıklara (örneğin, bir büyüklük sırasından daha az) bağlı olan belirli bir direnç fenotipi üretmek için mekanik ve biyokimyasal ipuçlarını bütünleştirir28,29,30.
Mevcut protokol, tümör hücrelerinin matris ipuçlarının benzersiz kombinasyonlarını nasıl yorumladığını ve tedavi direncini destekleyen karmaşık, hastaya özgü matris mikro ortamlarını nasıl tanımladığını karakterize etmektedir (Şekil 1A). 3B kültür için minyatürleştirilmiş, hassas bir şekilde ayarlanmış matrisler oluşturmak için fotokimyasal bir yöntem, geniş, ortogonal değişken bir alan sağlar. Bir mikrodenetleyici tarafından çalıştırılan özel yapım bir LED dizisi, otomasyonu ve tekrarlanabilirliği artırmak için 384 delikli bir plaka formatında fotoçapraz bağlantı hidrojellerine dahil edildi. Maruz kalma yoğunluğu, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanılarak değerlendirildiği gibi, ortaya çıkan hidrojellerin mikro-mekanik özelliklerini değiştirmek için kuyu boyunca değiştirildi. Bu el yazması aydınlatma dizisinin kendisinin oluşturulmasına odaklanmamakla birlikte, cihaz çoğaltmasına yardımcı olarak bir devre şeması (Şekil 1B) ve parça listesi (Malzeme Tablosu) sağlanmıştır.
Bu rapor, Young modülünün (tek bir büyüklük sırasına göre dört seviye) ve integrin bağlayıcı peptit içeriğinin (dört farklı ECM proteininden türetilmiş) ortogonal olarak değiştirildiği benzersiz, 3D mikro ortamlarda kültürlenmiş bir dizi GBM hücresinin hızlı bir şekilde üretildiğini göstermektedir. Bu yaklaşım daha sonra hidrojel mekaniğinin ve ECM-spesifik integrin katılımının, temozolamid (TMZ) kemoterapisine direnç kazandıkça hasta kaynaklı GBM hücrelerinin yaşayabilirliği ve proliferasyonu üzerindeki göreceli katkılarını araştırmak için kullanıldı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.1 kOhm resistors, 6 W</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>35601k1ft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 nm LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>ltpl-c034uvh365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate</td>
			<td>Bio Greiner One</td>
			<td>781090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>MTC bio</td>
			<td>C4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>4arm-PEG-SH-20K-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 NPN BJTs</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>2n5550ta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 Ohm resistors, 0.125 W</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>erjj-6enf80r6v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa)</td>
			<td>Jenkem Technology</td>
			<td>A7025-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104500</td>
			<td>&#160;cell dissociation&#160; reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Probes</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td>0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 &#181;m SiO2 particle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino IDE</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>1.8.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano</td>
			<td>Makerfire</td>
			<td>Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK8</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>sorvall legend xtr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP100ST</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F148415</td>
			<td>Pipette tips for positive displacement pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubis Semi-Micro Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>MSA225S100DI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - F12 (50-50)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS Ca (-) Mg (-)</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>25-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF100-15</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P</td>
			<td>Add DI water to dilute to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-23C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G21 Supplement</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>400-160</td>
			<td>50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, ACS, 12M</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S25838A</td>
			<td>Add DI water to dilute to 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149-100Ku</td>
			<td>25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H7006-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Air Gun</td>
			<td>Wagner</td>
			<td>HT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , &#62;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP194715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall legend micro 21R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microman E single Channel Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10004</td>
			<td>Positive displacement pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Tips</td>
			<td>Various Manufacturs</td>
			<td></td>
			<td>Various sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLine micropipette</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7250-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>AFM microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ss255-1</td>
			<td>Add DI water to dilute to 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normoicin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td>500x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteopontin Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4000102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Microscope Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664201-A</td>
			<td>Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing</td>
			<td>Processing</td>
			<td>3.5.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater Pipette Tips</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td>30089430</td>
			<td>1 mL sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGD Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>GCGYGRGDSPG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoth Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>12-102,12-104</td>
			<td>5,10 mL Pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder Paste</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>315-NC191LT15T5-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder Wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight dissecting forceps</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82027-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Cell Culture Treated Flask</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temozolomide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2577</td>
			<td>Typically used from 10 &#181;M to 100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenascin-C Peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR 
			GV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA700K5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Spinbar, Flea Micro</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58948-375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrogel arrays enable increased throughput for screening effects of matrix components and therapeutics in 3d tumor models

Hücre-matriks etkileşimleri, biyokimyasal, mekanik ve geometrik ipuçları yoluyla karmaşık fizyolojik süreçlere aracılık eder, patolojik değişiklikleri ve terapötik yanıtları etkiler. İlaç geliştirme boru hattında daha önce matris etkilerinin hesaba katılmasının, yeni terapötiklerin klinik başarı olasılığını artırması beklenmektedir. 3D hücre kültüründe spesifik doku mikroortamlarını özetleyen biyomateryal tabanlı stratejiler mevcuttur, ancak bunları öncelikle ilaç taraması için kullanılan 2D kültür yöntemleriyle bütünleştirmek zor olmuştur. Bu nedenle, burada sunulan protokol, mevcut ilaç tarama boru hatları ve hücre canlılığı için geleneksel analizlerle entegrasyonu kolaylaştırmak için minyatür biyomateryal matrisleri içinde 3D kültür yöntemlerinin çok kuyucuklu bir plaka formatında geliştirilmesini detaylandırmaktadır. Kültürlenmiş hücrelerde klinik olarak ilgili fenotiplerin korunması için kritik öneme sahip matris özelliklerinin yüksek doku ve hastalığa özgü olması beklendiğinden, spesifik uygulamalar için uygun koşulları belirlemek için matris parametrelerinin kombinatoryal taraması gerekli olacaktır. Burada açıklanan yöntemler, matris mekaniğinin ortogonal varyasyonuna ve ligand sunumuna kanser hücresi yanıtlarını değerlendirmek için minyatür bir kültür formatı kullanmaktadır. Spesifik olarak, bu çalışma, matriks parametrelerinin hasta kaynaklı glioblastoma (GBM) hücrelerinin kemoterapiye verdiği yanıtlar üzerindeki etkilerini araştırmak için bu platformun kullanımını göstermektedir.

AFM ölçümleri, özel yapım, Arduino kontrollü bir LED dizisi kullanılarak foto-çapraz bağlama sırasında UV ışınımının (mW /cm2) bir fonksiyonu olarak hidrojel mekaniğinin hassas kontrolünü doğruladı (Şekil 2A). Bu protokolde kullanılan hidrojel formülasyonu Tablo 2'de bulunabilir. Sağlanan şablondaki LED'lerin aralığı, 384 delikli bir plakanın diğer her bir kuyucuğunun aralığıyla eşleşir ve plakanın içinde jellerin oluşması...

Watch this Scientific Journal Video about Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models at JoVE.com

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Bu protokol, mekanik ve biyokimyasal ipuçlarının, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojellerin yüksek verimli fotoçapraz bağlanmasını kolaylaştıran özel yapım bir UV aydınlatma cihazı kullanarak, 3D matris-mimetik kültürlerde hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerinin kemoterapötik yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel bir platform tanımlamaktadır.

Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

Bu yöntem, araştırmacıların matris ipuçlarının 3D kültürdeki hücrelerin fenotipini nasıl etkilediğini sistematik olarak araştırmalarını sağlar. GBM hücrelerinin kültürlerini kullanarak prosedürü gösteriyoruz. Bu tekniğin temel avantajı, birçok matris koşulunu taramamızı sağlayan yüksek verimli uygulamadır.Bu teknik, tümör hücrelerinin ilaç direnci gibi hücre kültürü modellerinde spesifik fonksiyonları koruyan doku-mimetik matrisler geliştirmek ve potansiyel olarak yeni terapötikleri tanımlamak için kullanılabilir. Prosedürü gösteren Mary Epperson ve Kelly Tamura, Seidlits Lab'den lisans araştırmacıları. HEPES tozunu Hanks dengeli tuz çözeltisinde 20 milimolar'da çözerek HEPES-tamponlu çözelti hazırlamaya başlayın.Tam sorbasyonun ardından pH'ı yediye ayarlayın. HEPES-tamponlu çözeltide, tiyollenmiş HA'yı çözün, böylece her glukuronik asit üzerindeki karboksilik asit kalıntılarının% 6 ila% 8'i, tampon çözeltisinde mililitre başına 10 miligram konsantrasyonda bir tiol ile modifiye edilir. Tamamen çözünene kadar, tipik olarak yaklaşık 45 dakika oda sıcaklığında manyetik bir karıştırma plakası kullanarak dakikada 1.000'den az dönüşte karıştırın.HA çözünürken, mililitre başına 100 miligram 8kollu PEG norbornen, mililitre başına 100 miligram 4kollu PEG tiol, dört milimolar sistein veya sistein içeren peptit ve mikrosantrifüj tüplerinde mililitre LAP başına dört miligram ayrı çözeltiler hazırlayın. Bu noktada tek bir hidrojel içine bağlanacak tüm peptitlerin dört milimolar çözeltilerini hazırlayın. Son hidrojel matrisleri için nihai konsantrasyonları elde etmek için HA, PEG norbornen, PEG tiol ve sistein-tiol içeren peptitlerin bireysel çözeltilerini karıştırın.Tamamen karıştırmak için manyetik bir merdiven plakası üzerinde dakikada 1.000'den az dönüşle en az 30 dakika karıştırın. Numuneleri aydınlatma cihazıyla, silikon kalıpların veya 384 delikli plakanın tek bir sütunundaki diğer tüm LED'lerle hizalayın. UV LED Parametrelerini açın ve yoğunluk ve aydınlatma değerlerini girin.Ardından aydınlatmaya başlamak için Son'a tıklayın. Aydınlatmayı takiben, bir köşeye yerleştirildiğinde, kuyu plakasını bir sonraki köşeye taşıyın ve tekrarlayın. Plakanın diğer yarısındaki kuyucukları aydınlatmak için, plakayı tutucudan kaldırın ve 180 derece döndürün.Farklı mekaniklere sahip hidrojeller üretmek için, cam slaytları ve silikon kalıpları temizlemek için bant kullanarak temizlemekle başlayın. Silikon kalıpları cam kızağa yapıştırın, iyi bir sızdırmazlık sağlamak için aşağı bastırın ve hava kabarcıklarının yerini alın. Daha sonra, cam slayt üzerindeki her silikon kalıba 80 mikrolitre hidrojel öncü çözeltisi pipet.Cam kaydırağı, tek bir sütundaki diğer tüm LED'lerle hizalanmış aydınlatma cihazına yerleştirin. Çapraz bağlantıyı fotoğraflamak için hidrojel öncüllerini 15 saniye boyunca UV ışığına maruz bırakın. Aydınlatma durduktan sonra, slaytları alın ve kalıbın iç çevresini ince bir uçla izleyerek jelleri kalıplardan gevşetin.Silikon kalıpları cımbız veya forseps ile çıkarın. 12 delikli bir plakayı iki mililitre DPBS ile doldurun. Çapraz bağlı hidrojelleri, bir spatulayı ıslatarak ve yavaşça cam slayttan iterek ayrı bir kuyu plakasına taşıyın.İstenilen hücreleri tek hücreli bir çözelti olarak hazırlayın. Yaklaşık 150 mikrometre çapındaki glioblastoma sferoidlerini, bir T-75 şişe süspansiyon kültüründen 15 mililitrelik bir konik tüpe toplayın. Artık hücreleri ve ortamları çıkarmak için kültür şişesini beş mililitre DPBS ile durulayın ve bu hacmi konik tüpe ekleyin.Hücreleri içeren konik tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatantı beş mililitrelik bir serolojik pipetle çıkarın, hücre peletini rahatsız etmemeye ve beş mililitre DPBS'de yeniden askıya almaya dikkat edin. Hücreleri yıkamak için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüj yapın.Süpernatantı beş mililitrelik bir serolojik pipetle aspire edin, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin ve ardından hücreleri iki mililitre hücre ayrışma reaktifinde yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika kuluçkaya yatırın. Üç mililitre tam orta ve nazikçe pipet ekleyerek sferoidleri tek hücreli bir süspansiyona parçalayın.Tek hücreli süspansiyonu 400 kez G'de beş dakika boyunca santrifüjle hücrelere oda sıcaklığında pelet haline getirin. Süpernatantı beş mililitrelik bir serolojik pipetle aspire edin, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin. Hücreleri bir mililitre tam ortamda yeniden askıya alın.Bir hemositometre kullanarak saymak için hücrelerin bir kısmını çıkarın. Bu kısmı, canlılığı tehlikeye giren hücrelere nüfuz eden tripan mavisi ile iki kat seyreltin. Sadece canlı, renksiz hücreleri sayın.Kapsülleme için gerekli hücre sayısını belirleyin. Gerekli toplam hücre sayısını içeren bir ortam hacmini steril 1.7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 kez G'de döndürün.Süpernatantı bir mikropipetle aspire edin, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin. Hücre peletini hidrojel öncü çözeltisinde yeniden askıya alın, 1.000 mikrolitrelik bir mikropipetle dört ila beş kez yukarı ve aşağı pipetle iyice karıştırın. Hücreleri, 10 mikrolitre dağıtmak üzere ayarlanmış bir tekrar pipetleyiciye yükleyin.Kabarcıkları ve düzensiz dağıtımı önlemek için, bir atık kabına bir ila iki kez daha dağıtarak tekrarlanan pipetleyiciyi hazırlayın. 384 delikli bir plakanın her bir kuyucuğunda, tekrarlanan pipetleyiciden hidrojel çözeltisinde asılı 10 mikrolitre hücre dağıtın. LED dizisini kullanarak, istenen mekanik özellikleri elde etmek için hücreyi içeren her kuyuyu 15 saniye boyunca aydınlatın.Hücreleri içeren her bir kuyucuğa 40 mikrolitre tam ortam ekleyin. Buharlaşmadan kaynaklanan kayıpları en aza indirmek için jelleri çevreleyen deneysel olmayan kuru kuyucuklara 50 mikrolitre DPBS ekleyin. Glioblastoma hücreleri için, kapsüllemeden üç gün sonra başlayarak, istenen son konsantrasyonu elde etmek için ortam içeren ilacın 40 mikrolitresini ekleyin.Hücreleri içeren her bir kuyucuğa 10 mikrolitre CCK8 reaktifi ekleyin. Üreticinin talimatlarına göre bir ila dört saat boyunca kuluçkaya yatırın. Kuluçkayı takiben tüm kuyular için 450 nanometrede absorbansları okuyun.Tek hidrojellerin yüzeylerindeki mikron ölçekli bölgelerin AFM sorgulaması, daha yumuşak ortalama Young modülüne sahip hidrojellerin de daha sert hidrojellerden daha küçük modül aralıklarına sahip olduğunu göstermiştir. Mililitre başına 2.500.000 hücre yoğunluğunda tohumlanan GS122 hücrelerinin 3D kültürleri, kültürde yedi gün sonra değerlendirildiğinde, mililitre başına 500.000 hücre yoğunluğunda tohumlananlara kıyasla önemli ölçüde daha yüksek canlılıklar sergilemiştir. GS122 hücreleri, osteopontin türevi peptitler matrise dahil edildiğinde sekiz kilopaskal durumda hayatta kalma kazanımları gösterirken, integrin bağlayıcı sialoprotein veya tenasin C türevi peptitlerin dahil edilmesi, zencefil RGD peptidi ile kültür ve matrisler gibi minimal sağkalım yararları sağlamıştır.Buna karşılık, hiçbir peptit 0.8 kilopaskal kültür koşulunda hayatta kalma kazanımları sağlamadı. Hem GS122 hem de GS304 hücreleri, RGD içeren peptitler de dahil olmak üzere yumuşak veya sert hidrojel matrislerinde kültürlendiğinde yayılır. GS122 hücreleri, osteopontin ile hem 0.8 hem de 8 kilopaskallarda benzer bir yayılma eksikliği göstermektedir.Bununla birlikte, GS122 sadece sekiz kilopascals durumunda temozolomide karşı gelişmiş direnç göstermiştir. Son olarak, bu minyatür 3D kültür platformu, ölümcül olarak farklılaşmış nöroendokrin prostat kanseri hücrelerinin canlı organoidleri de dahil olmak üzere diğer tümör tiplerinden insan hücrelerini kültürlemek için kullanılabilir. Bu prosedürü takiben, hücre fenotiplerini daha da karakterize etmek için tek hücreli RNA dizilimi gibi daha ileri teknikler kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

SiRNA Therapeutics teslimi için Gözenekli Silikon Mikropartiküller

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Geliştirilmiş 3D hidrojel Neuroinflammation Vitro modelleme için birincil gliyal hücreler kültürleri

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Bir böbrek korteks ekstraselüler matrisi elde edilen hidrojel imalatı

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Bir İnsan 3D Ekstrasellüler Matrix-Adiposit Kültür Modeli Matrix-Hücre Metabolik Crosstalk Çalışma için

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

In Vivo Nöral Kayıt için Ti3C2 MXen Mikroelektrot Dizilerinin İmalatı

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Hidrojel Tabanlı 3D Kültür Modellerini Otomatik ve StandartLaştırılmış Bir Şekilde Üretecek Açık Kaynaklı Bir Teknoloji Platformu

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Bakteri Taraması, Seçimi ve İzolasyonu için Fotobozunur Hidrojel Arayüzleri

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...