Name: preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures
Uploaded: 2022-06-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

نشكر كورين أ. فيرتشايلد وكاتي ل. فيرمليون ، اللتين شاركتا في تطوير نسختنا من بروتوكول زراعة الطيات العصبية في الجمجمة الفرخية.

يمكن استخدام أي مجموعة متنوعة من سلالات جالوس جالوس ، بما في ذلك White Leghorn أو Golden Sex Link أو Rhode Island Red. كان بيض الدجاج المستخدم في هذه الدراسة من سلالات مختلفة وتم الحصول عليه من مصادر متعددة ، بما في ذلك المزارع المحلية والمفرخات.
1. إعداد الحلول والمواد
<ol><li>قم بإعد...

<ol>
	<li>Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+border:+Induction,+specification+and+maturation+of+the+territory+that+generates+neural+crest+cells.">The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells.</a> Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).</li><li>Tang, W., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+lineage+analysis:+From+past+to+future+trajectory.">Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory.</a> Development. 147 (20), (2021).</li><li>Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+different+migration+strategies+as+viewed+from+the+neural+crest.">Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+bulldoze+through+the+microenvironment+using+Aquaporin+1+to+stabilize+filopodia.">Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia.</a> Development. 147 (1), 185231 (2020).</li><li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+fragment+C3a+controls+mutual+cell+attraction+during+collective+cell+migration.">Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration.</a> Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).</li><li>Giovannone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slits+affect+the+timely+migration+of+neural+crest+cells+via+robo+receptor.">Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor.</a> Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).</li><li>Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+methylation+is+essential+for+neural+crest+migration.">Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration.</a> Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).</li><li>Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongator+Protein+3+(Elp3)+stabilizes+Snail1+and+regulates+neural+crest+migration+in+Xenopus.">Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Gonzalez Malagon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3+controls+migration+of+the+neural+crest+lineage+in+mouse+and+Xenopus.">Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).</li><li>Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+promotes+neural+crest+migration+via+yap/tead+signaling.">Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling.</a> Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).</li><li>Jacques-Fricke, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+NSD3-dependent+neural+crest+gene+expression+reveals+known+and+novel+candidate+regulatory+factors.">Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors.</a> Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).</li><li>Bronner-Fraser, M., Garc&#237;a-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+manipulations+of+neural+crest+cells+or+their+migratory+pathways.">Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways.</a> Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation.">Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).</li><li>Malagon, S. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+culture+and+analysis+of+primary+cranial+neural+crest+cells+from+mouse+for+the+study+of+neural+crest+cell+delamination+and+migration.">Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+delamination+and+migration:+From+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration.">Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).</li><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus.">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryological+and+genetic+manipulation+of+chick+development.">Embryological and genetic manipulation of chick development.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).</li><li>Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phalloidin+binding+site+of+F-actin.">The phalloidin binding site of F-actin.</a> The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).</li><li>Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+stages+of+trunk+neural+crest+migration+in+avian+embryos+using+monoclonal+antibody+HNK-1.">Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1.</a> Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations.">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations.</a> Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).</li><li>Haupt, A., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+their+own+shape+-+mechanisms+to+probe+cell+geometry+and+their+implications+in+cellular+organization+and+function.">How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li><li>Ezin, M., Fraser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+time-lapse+imaging+of+the+early+avian+embryo.">Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+live+imaging+of+avian+embryos.">In ovo live imaging of avian embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).</li><li>McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+neural+crest+cell+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+the+chick+embryo.">Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo.</a> Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).</li><li>Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+cranial+neural+crest+cells+release+extracellular+vesicles+that+are+critical+for+their+migration.">Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration.</a> Journal of Cell Science. , (2022).</li><li>Williams, R., Sauka-Spengler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+ovo+electroporation+of+early+chicken+embryos.">Ex ovo electroporation of early chicken embryos.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).</li><li>Moulton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+morpholinos+to+control+gene+expression.">Using morpholinos to control gene expression.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).</li><li>Gandhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-plasmid+approach+for+genome+editing+coupled+with+long-term+lineage+analysis+in+chick+embryos.">A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos.</a> Development. 148 (7), (2021).</li><li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+Global+Neural+Crest+Gene+Regulatory+Network+In+Vivo.">Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo.</a> Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).</li></ol>

توفر التقنية الموصوفة هنا طريقة قابلة للتكيف لعزل الطيات العصبية للكتاكيت وطلائها لإنشاء ثقافات من NCCs الجمجمية المهاجرة. توفر هذه الثقافات ظروفا مبسطة ثنائية الأبعاد لسهولة تحليل هجرة NCC ومورفولوجيا الفرخ التي يمكن أن تكمل أكثر تحديا تقنيا في طرق تصوير البويضة 24،<sup class=...

خلايا القمة العصبية (NCCs) هي مجموعة خلايا عابرة في أجنة الفقاريات. يتم تحديد NCCs عند حدود الصفيحة العصبية وتخضع لانتقال ظهاري إلى وسيط (EMT) للهجرة من الأنبوب العصبي الظهري1. بعد EMT ، تنتشر NCCs على نطاق واسع في جميع أنحاء الجنين ، مما يؤدي في النهاية إلى التمييز والمساهمة في هياكل مختلفة ، بما في ذلك الهيكل العظمي القحفي الوجهي ، ومسار التدفق الخارجي للقلب ، وغالبية الجهاز العصبي المحيطي2. التغيرات في قطبية الخلية ، والهيكل الخلوي ، وخصائص الالتصاق وراء هذا التحول من مجموعة الخلايا المهاجرة إلى الخلايا المهاجرة3. توفر دراسة NCC EMT والهجرة نظرة ثاقبة على الآليات الأساسية لحركية الخلايا وإبلاغ الجهود المبذولة لمنع وعلاج العيوب الخلقية وورم خبيث السرطان.
في حين أن التحليل في الجسم الحي أمر حيوي لفهم العمليات التنموية NCC في سياق جنيني ، فإن الأساليب في المختبر توفر إمكانية الوصول البصري والمادي التي تسهل طرقا تجريبية إضافية. في بيئة 2D مبسطة ، يمكن تقييم مورفولوجيا NCC والهياكل الهيكلية الخلوية والمسافة التي تم ترحيلها. علاوة على ذلك ، يمكن تحليل آثار اضطراب العوامل الوراثية أو القابلة للذوبان على سلوكيات الهجرة ل NCCs المتحركة 4,5,6,7,8,9,10. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن جمع NCCs المعزولة قبل الهجرة أو الهجرة وتجميعها واستخدامها في منهجيات عالية الإنتاجية لدراسة التنظيم التنموي ل NCCs من خلال التنميط البروتيني والنسخي واللاجينومي 7,11. في حين أن الطرق متاحة لإعداد NCCs الجمجمة من مختلف الكائنات الحية النموذجية التنموية12،13،14 ، توضح هذه المقالة آليات النهج لأولئك الذين يتعلمون أولا لزراعة NCC الجمجمة من أجنة الكتاكيت.
يصف البروتوكول الحالي تقنية متعددة الاستخدامات لإعداد مزارع NCC في الجمجمة الفركتية (الشكل 1). نظرا لأن NCCs تهاجر بسهولة من الطيات العصبية المزروعة إلى ركيزة مستزرعة ، فإن NCCs الكتاكيت تنفصل بشكل طبيعي عن الأنسجة الجنينية ، ويتم توليد الثقافات الأولية بسهولة. مع هجرة NCCs في الدماغ المتوسط بشكل جماعي من الطيات العصبية القحفية (على النقيض من التفكيك المطول لكل خلية على حدة في الجذع15) ، تتكون هذه الثقافات بشكل رئيسي من خلايا القمة العصبية القحفية المهاجرة ، مع استئصال الطية العصبية الأولية التي توفر طريقة جمع ل NCCs المهاجرة. يتم تفصيل طريقة أساسية لتشريح وزراعة الطيات العصبية القحفية للكتاكيت ، ويتم تقديم اقتراحات لتطبيقات واختلافات مختلفة على هذه الطريقة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig01v2.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على بروتوكول زراعة الطيات العصبية في الجمجمة (A,B) يتم استئصال الطيات العصبية القحفية (الموضحة باللون الأزرق) من جنين الفرخ مع خمسة سوميت (كما هو موضح في المنظر الظهري في A). العصابات الرمادية ، الهلال القلبي. (ج) عندما تكون مطلية على الفيبرونيكتين ، تخرج خلايا القمة العصبية المهاجرة من الطيات العصبية وتنتشر على الركيزة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63799/63799fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber dishes (glass bottom, single or divided)</td>
			<td>MatTek; Cell Vis</td>
			<td>P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) 
			X000NOK1OJ (Cellvis)</td>
			<td>Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>633029, 633031, 633033, 633035, 633037</td>
			<td>circles, 0.13&#8211;0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Alternative for L15 media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Sportsman</td>
			<td>1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40008A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>grade 3MM chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (blunt)</td>
			<td>Fisher Scientific; Thomas Scientific</td>
			<td>08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td>Free image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold)</td>
			<td>Vector Laboratories; Thermofisher Scientific</td>
			<td>H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td>10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>VWR (or similar)</td>
			<td></td>
			<td>60 mm, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>multiple flurophores available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td>For tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (dissection)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td>35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>Variety of sources</td>
			<td></td>
			<td>0.01&#34; diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures

أثناء تطور الفقاريات ، تهاجر خلايا القمة العصبية (NCCs) على نطاق واسع وتتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا التي تساهم في هياكل مثل الهيكل العظمي القحفي الوجهي والجهاز العصبي المحيطي. في حين أنه من الأهمية بمكان فهم هجرة NCC في سياق الجنين 3D ، فإن عزل الخلايا المهاجرة في ثقافة 2D يسهل التصور والتوصيف الوظيفي ، مكملا الدراسات الجنينية. يوضح البروتوكول الحالي طريقة لعزل الطيات العصبية القحفية للكتاكيت لتوليد مزارع NCC الأولية. تنبثق NCCs المهاجرة من الطيات العصبية المطلية على ركيزة مغلفة بالفيبرونيكتين. وينتج عن ذلك مجموعات سكانية مشتتة ومترابطة تابعة ل NCC يمكن تقييمها عن طريق التحليق والتحليلات المورفولوجية الكمية. هذا النهج الثقافي المبسط قابل للتكيف بشكل كبير ويمكن دمجه مع تقنيات أخرى. على سبيل المثال، يمكن تقييم سلوكيات الهجرة والهجرة NCC عن طريق التصوير بالفاصل الزمني أو الاستعلام عنها وظيفيا من خلال تضمين مثبطات أو تلاعبات تجريبية بالتعبير الجيني (على سبيل المثال، الحمض النووي، أو مورفولينو، أو كريسبر إلكتروبوراتيون). بسبب تنوعها ، توفر هذه الطريقة نظاما قويا للتحقيق في تطوير NCC في الجمجمة.

ويرد في الشكل 1 عرض عام لهذا البروتوكول. تم فتح البيض المحتضن ، وتم عزل صفار البيض ، مع الجنين على السطح ، عن طريق سكبه بلطف في راحة يد قفاز (الشكل 2A ، B). بعد إزالة الألبومين (الشكل 2C) ، تم تطبيق إطارات ورق الترشيح على غشاء صفار البيض ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

يصف هذا البروتوكول متعدد الاستخدامات عزل خلايا القمة العصبية المهاجرة (NCCs) من خلال استئصال الطيات العصبية القحفية من أجنة الكتاكيت. عند الطلاء والحضانة ، تظهر NCCs المهاجرة من الطيات العصبية ، مما يسمح بتقييم مورفولوجيا الخلية والهجرة في بيئة 2D مبسطة.

إعداد وتحليل مورفولوجي لمزارع خلايا القمة العصبية القحفية للكتكوت

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

تهاجر خلايا القمة العصبية من الطيات العصبية القحفية في الأجنة أو عند وضعها في الثقافة. وهذا يوفر طريقة ملائمة لعزل خلايا القمة العصبية المهاجرة الأولية دون تفكك الخلايا. في حين أن هجرة القمة العصبية تحدث عادة داخل البيئة الجنينية ثلاثية الأبعاد ، فإن الثقافة ثنائية الأبعاد تمكن من تصور والتحقيق في العمليات المتعلقة بالهجرة.على الرغم من وجود بروتوكولات زراعة الطيات العصبية القحفية ، إلا أن هذه الطريقة تتطلب التدريب والخطوات الخاصة بالكائن الحي. يوضح هذا الفيديو تقنيات لتسهيل التحضير القابل للتكرار لمزارع الطيات العصبية في الجمجمة الكتكانية. غالبا ما يكافح المبتدئون مع تشريح وطلاء الطيات العصبية وتقييم نتائج الثقافة.يسمح اتباع إرشادات التشريح وتطبيق التحليل المورفومتري الموصوف هنا بالحصول على نتائج كمية متسقة. للبدء ، ضع البيض المخصب في وضع مستقيم داخل حاضنة رطبة عند 38 درجة مئوية. بعد إزالة البيض من الحاضنة ، قم بتطهير الأصداف عن طريق رش 70٪ من الإيثانول جيدا وتركها تجف.لإصلاح الثقافات وتلوينها ، استخدم زلات الغطاء الزجاجي الموضوعة في طبق زراعة الأنسجة متعدد الآبار ، وماصة ما يكفي من محلول الفيبرونيكتين لتغطية قاع البئر. بعد ذلك ، استبدل الغطاء ، واحتضن اللوحة بمحلول فيبرونيكتين في حاضنة رطبة عند 38 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل أثناء تشريح الطيات العصبية. استخدم ملقط حاد لكزة ثقب صغير في القشرة عند 1/4 إلى 1/3 من طول البيضة.أدخل الملقط الحاد بعناية في الحفرة الصغيرة ، مما يضمن عدم تعطيل صفار البيض. ثم ، قطع قشر البيض حول البيضة ، وإزالة الجزء العلوي من قشر البيض ، ووضع الجنين للعزل. قم بتحضير الجنين باستخدام الحافة المسطحة للملقط الحاد المغلق بلطف لمسح أي ألبومين زائد على سطح صفار البيض الذي يغطي الجنين.استخدم الملقط لوضع إطار دعم ورقة الترشيح فوق الجنين، مع وجود الجنين في نافذة الإطار. اضغط برفق لأسفل على ورقة الترشيح للالتصاق بصفار البيض. قطع حول الجزء الخارجي من إطار ورقة الترشيح مع مقص تشريح.استخدم الملقط أو أطراف المقص للإمساك بحافة الإطار، وارفع الجنين برفق بعيدا عن صفار البيض. ضع الجنين مع الإطار الورقي جانبا لأسفل في طبق بتري سعة 60 أو 100 ملليلتر مملوء ب Ringer's مع بكتيريا القلم. احتفظ بطبق الأجنة على الجليد إذا قمت بجمعها من أجل تطبيق الحمض النووي الريبي أو المصب الحساس للبروتين.انقل جنينا إلى طبق نظيف يحتوي على محلول القلم العقدي من رينجر. حرك الجنين بلطف ذهابا وإيابا لإزالة أي صفار يحجب الرؤية ، واستبدل محلول القلم العقدي في Ringer أو انقله إلى طبق طازج إذا أصبح غائما. ضع الجنين ظهريا وإطار جانبي تحت مجهر تشريح.اتركي الجنين على الإطار الورقي لإبقائه ممتدا ومثبتا في مكانه. ثم ، قم بإزالة غشاء vitelline ، باستخدام ملقط لفضح الطيات العصبية. قم بتضمين الأنسجة الذيلية إلى الحويصلات البصرية المتوسعة والسطح إلى الدماغ الخلفي ، حيث بدأت انقباضات المعينات في الظهور للتو.باستخدام مقص الربيع ، قم باستئصال الطيات العصبية في الدماغ المتوسط بعناية. احرص على استئصال الجانب الظهري من الطية العصبية مع الحد الأدنى من تلوث الأنبوب العصبي والأديم الخارجي غير العصبي ، ونقل الطيات العصبية إلى طبق نظيف يحتوي على محلول Ringer's pen-strep باستخدام ماصة P20 أو ماصة Pasteur الزجاجية المعقمة التي يتم شطفها بمحلول Ringer's Pen-strep الخاص ب Yolky. تخزين الطيات المجمعة على الجليد أثناء تشريح طيات إضافية.بعد إزالة طبق الثقافة من الحاضنة ، استخدم ماصة أو ماصة باستور لإزالة محلول الفيبرونيكتين من زلات الغطاء أو الطبق أو البئر. بعد شطف الركيزة المغلفة بالفيبرونيكتين بمحلول Ringer's pen-strep ، أضف حجما مناسبا من وسائط الثقافة الكاملة إلى الطبق أو جيدا. لمنع البلاستيك ومنع الأنسجة من الالتصاق ، استخدم ماصة P20 أو P200 ، واشطف طرف الماصة بمحلول القلم العقدي من Ringer.بعد ذلك ، انقل الطيات العصبية المعزولة نحو وسط زلة الغطاء المطلية بالفيبرونيكتين ، مع الحرص على نقل أقل قدر ممكن من محلول القلم العقدي من Ringer. بعد السماح للنباتات بالاستقرار لمدة 10 إلى 15 دقيقة ، ضعها في غرفة رطبة عند 38 درجة مئوية عن طريق حمل طبق الثقافة ببطء وبعناية مع طيات عصبية مطلية. قم بإزالة وسائط الاستزراع باستخدام ماصة باستور ، وشطف الآبار باستخدام PBS المعقم بالفلتر.أضف 4٪ بارافورمالديهايد ، واحتفظ به على شاكر المنصة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة بارافورمالدهيد ، وشطف الآبار ثلاث مرات باستخدام PBS ، وإضافة PBST التي تحتوي على مصل 5٪. الآن ، ماصة 30 ميكرولتر من 200-nanomolar أوريغون الأخضر المترافقة phalloidin على سطح أملس لكل زلة غطاء.باستخدام زوج من الملقط ، قم بإزالة زلة الغطاء من PBST التي تحتوي على مصل 5٪ ، مما يضمن اتجاه الخلايا المتجهة لأعلى. تخلص من السائل الزائد عن طريق لمس حافة الغطاء لفترة وجيزة إلى ممسحة مهام حساسة. ضع بلطف كل خلية انزلاق الغطاء جانبا على قطرة من الفلويدين المخفف ، واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد فترة الحضانة ، ارفع الغطاء من محلول التلطيخ وضعه مرة أخرى في طبق الثقافة ، وقلبه حتى يكون جانب الخلية لأعلى. تأكد من تغطية الغطاء ب PBST ، وضعه على شاكر المنصة لمدة 10 دقائق ، مع الحفاظ على قسائم الغطاء مغطاة وفي الظلام. قم بإزالة PBST ، وكرر غسل الغطاء مرتين لما مجموعه ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق.ضع قطرة واحدة من وسائط التركيب على شريحة المجهر. قم بتركيب خلية انزلاق الغطاء جانبا لأسفل عن طريق خفض انزلاق الغطاء ببطء بزاوية على وسائط التركيب لتجنب إنشاء فقاعات، والسماح للوسائط بضبط نفسها قبل التصوير. أخيرا ، قم بتصوير الخلايا الملطخة ، وقم بتصديرها كملفات TIFF.بدأت خلايا القمة العصبية في الظهور من الطية العصبية الملتصقة في غضون ثلاث إلى أربع ساعات من الحضانة ، وتم الانتهاء من الهجرة بعد حوالي 20 ساعة. تم تصنيف خلايا القمة العصبية المهاجرة باستخدام HNK-1 ، ويبدو أن معظم الخلايا إيجابية HNK-1. تم تصور خلايا القمة العصبية المهاجرة عن طريق تلطيخ الأكتين الخيطي مع الفيلويدين.تمت معالجة صور الخلايا الملطخة بالفيلويدين باستخدام ImageJ لإنتاج صورة عتبة تظهر فيها الخلايا سوداء مع خلفية بيضاء. تم تحليل صورة العتبة وعرض قياسات مختلفة في الرسوم البيانية الشريطية المتناقضة أو قطع الكمان. على سبيل المثال ، كان متوسط مساحة الخلايا ال 69 التي تم تحليلها حوالي 802.11 ميكرومتر مربع ، يتراوح من 60.27 إلى 2،664.53 ميكرومتر مربع.يعكس الدائري بروز الخلية ويتراوح من 0.101 إلى 0.875. تشير القيم السفلية إلى شكل ممدود ، بينما تشير قيمة واحد إلى دائرة مثالية. أظهرت معظم الخلايا شكلا ممدودا ، والذي يمكن رؤيته بسهولة في مؤامرة الكمان.كان متوسط نسبة العرض إلى الارتفاع لخلايا القمة العصبية المهاجرة في هذا المجال حوالي 2.13 ، وتشير نسبة العرض إلى الارتفاع لواحد إلى شكل متماثل. يعد الاستئصال الدقيق والطلاء الخارجي أمرا بالغ الأهمية للثقافات الناجحة. اسمح للطيات العصبية بالاستقرار على الجانب المقطوع لمدة 10 إلى 15 دقيقة ، ثم انقلها ببطء إلى الحاضنة لتشجيع الالتصاق.وتشمل الاختلافات في هذه التقنيات التلاعب الجيني العابر قبل الزراعة والتصوير بفاصل زمني أثناء الحضانة. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح هذا البروتوكول بجمع مجموعات خلايا القمة العصبية المهاجرة والمهاجرة للتحليل على مستوى omics.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

التمايز من العصبية البشرية خط الخلايا الجذعية على الثقافات الثلاث الأبعاد، تحليل الجينات الرنا الميكروي، واعتبارا الهدف

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

وضع العلامات المزدوجة من خلايا كريست العصبية والأوعية الدموية داخل أجنة الدجاج باستخدام الفرخGFP تطعيم الأنبوب العصبي وكاروتشيانين صبغ DiI حقن

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

تسليم<em&gt; في فيفو</em&gt; الحاد المتقطع نقص الأكسجة في الأطفال حديثي الولادة القوارض لرئيس Subventricular المنطقة المستمدة من الثقافات خلية العصبية السلف

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

المنهج الوراثي إلى الأمام للكشف عن الإجهاد الجينات المقاومة في الفئران - شاشة عالية الإنتاجية في خلايا ES

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

جيل المعدلة وراثيا الثقافات الجلد الميتة عضوي عن طريق الأدمة الإنسان

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

زراعة متعددة القدرات البشرية والعصبية الخلايا الجذعية في نظام زراعة الخلايا المغلقة للبحوث الأساسية وقبل السريرية

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

إنشاء خلايا التكاثري رباعي الصيغة الصبغية من Nontransformed الخلايا الليفية الإنسان

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

تصوير مرور الوقت فوتون متعددة لتصور التنمية في الوقت الحقيقي: التصور لترحيل الخلايا العصبية كريست في الأجنة الزرد

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

العدوى بفيروس زكى من الخلايا الجذعية العصبية في مخ الجنين البشري مثقف لتحليل إيمونوسيتوتشيميكال

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

التصور للهجرة الخلية عرضية في تيكتوم الألياف الضوئية النامية في الفرخ

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...