Name: preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures
Uploaded: 2022-06-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

Vi takker Corinne A. Fairchild og Katie L. Vermillion, som deltog i udviklingen af vores version af chick cranial neural fold culture protocol.

Enhver sort af Gallus gallus racer kan anvendes, herunder White Leghorn, Golden Sex Link eller Rhode Island Red. De kyllingæg, der blev anvendt i denne undersøgelse, var af forskellige racer og hentet fra flere kilder, herunder lokale gårde og rugerier.
1. Fremstilling af opløsninger og materialer
<ol><li>Ringers opløsning fremstilles ved at blande 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl 2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na 2 HPO 4 og 0,147 mMKH2 PO4</sub...

<ol>
	<li>Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+border:+Induction,+specification+and+maturation+of+the+territory+that+generates+neural+crest+cells.">The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells.</a> Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).</li><li>Tang, W., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+lineage+analysis:+From+past+to+future+trajectory.">Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory.</a> Development. 147 (20), (2021).</li><li>Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+different+migration+strategies+as+viewed+from+the+neural+crest.">Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+bulldoze+through+the+microenvironment+using+Aquaporin+1+to+stabilize+filopodia.">Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia.</a> Development. 147 (1), 185231 (2020).</li><li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+fragment+C3a+controls+mutual+cell+attraction+during+collective+cell+migration.">Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration.</a> Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).</li><li>Giovannone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slits+affect+the+timely+migration+of+neural+crest+cells+via+robo+receptor.">Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor.</a> Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).</li><li>Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+methylation+is+essential+for+neural+crest+migration.">Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration.</a> Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).</li><li>Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongator+Protein+3+(Elp3)+stabilizes+Snail1+and+regulates+neural+crest+migration+in+Xenopus.">Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Gonzalez Malagon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3+controls+migration+of+the+neural+crest+lineage+in+mouse+and+Xenopus.">Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).</li><li>Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+promotes+neural+crest+migration+via+yap/tead+signaling.">Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling.</a> Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).</li><li>Jacques-Fricke, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+NSD3-dependent+neural+crest+gene+expression+reveals+known+and+novel+candidate+regulatory+factors.">Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors.</a> Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).</li><li>Bronner-Fraser, M., Garc&#237;a-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+manipulations+of+neural+crest+cells+or+their+migratory+pathways.">Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways.</a> Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation.">Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).</li><li>Malagon, S. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+culture+and+analysis+of+primary+cranial+neural+crest+cells+from+mouse+for+the+study+of+neural+crest+cell+delamination+and+migration.">Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+delamination+and+migration:+From+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration.">Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).</li><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus.">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryological+and+genetic+manipulation+of+chick+development.">Embryological and genetic manipulation of chick development.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).</li><li>Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phalloidin+binding+site+of+F-actin.">The phalloidin binding site of F-actin.</a> The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).</li><li>Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+stages+of+trunk+neural+crest+migration+in+avian+embryos+using+monoclonal+antibody+HNK-1.">Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1.</a> Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations.">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations.</a> Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).</li><li>Haupt, A., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+their+own+shape+-+mechanisms+to+probe+cell+geometry+and+their+implications+in+cellular+organization+and+function.">How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li><li>Ezin, M., Fraser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+time-lapse+imaging+of+the+early+avian+embryo.">Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+live+imaging+of+avian+embryos.">In ovo live imaging of avian embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).</li><li>McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+neural+crest+cell+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+the+chick+embryo.">Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo.</a> Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).</li><li>Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+cranial+neural+crest+cells+release+extracellular+vesicles+that+are+critical+for+their+migration.">Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration.</a> Journal of Cell Science. , (2022).</li><li>Williams, R., Sauka-Spengler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+ovo+electroporation+of+early+chicken+embryos.">Ex ovo electroporation of early chicken embryos.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).</li><li>Moulton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+morpholinos+to+control+gene+expression.">Using morpholinos to control gene expression.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).</li><li>Gandhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-plasmid+approach+for+genome+editing+coupled+with+long-term+lineage+analysis+in+chick+embryos.">A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos.</a> Development. 148 (7), (2021).</li><li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+Global+Neural+Crest+Gene+Regulatory+Network+In+Vivo.">Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo.</a> Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).</li></ol>

Teknikken beskrevet her giver en tilpasningsdygtig metode til at isolere chick neurale folder og plating dem for at skabe kulturer af migrerende kraniale NCC'er. Disse kulturer giver forenklede 2D-betingelser for nem analyse af chick NCC-migration og morfologi, der kan supplere mere teknisk udfordrende i ovo-billeddannelsesmetoder 24,25,26. Selv om denne in vitro-metode er forholdsvis enkel, afhænger de konsis...

Neurale kamceller (NCC'er) er en forbigående cellepopulation i hvirveldyrembryoner. NCC'er specificeres ved grænserne af den neurale plade og gennemgår en epitel-til-mesenkymal overgang (EMT) for at migrere fra dorsalneuralrøret1. Efter EMT spredes NCC'er i vid udstrækning gennem embryoet og differentierer og bidrager i sidste ende til forskellige strukturer, herunder kraniofacial skelet, hjertets udstrømningskanal og størstedelen af det perifere nervesystem2. Ændringer i cellepolaritet, cytoskelettet og vedhæftningsegenskaber ligger til grund for dette skift fra en præmigrativ til en migrerende cellepopulation3. At studere NCC EMT og migration giver indsigt i grundlæggende mekanismer for cellemotilitet og informerer indsatsen for at forebygge og behandle fødselsdefekter og kræftmetastase.
Mens in vivo-analyse er afgørende for at forstå NCC-udviklingsprocesser i en embryonal sammenhæng, tilbyder in vitro-metoder visuel og fysisk tilgængelighed, der letter yderligere eksperimentelle veje. I et forenklet 2D-miljø kan NCC-morfologi, cytoskeletale strukturer og migreret afstand evalueres. Desuden kan virkningerne af genetisk eller opløselig faktorforstyrrelse på migrerende adfærd hos bevægelige NCC'er analyseres 4,5,6,7,8,9,10. Derudover kan isolerede præmigratoriske eller migrerende NCC'er indsamles, samles og bruges til metoder med høj kapacitet til at studere udviklingsreguleringen af NCC'er gennem proteomisk, transkriptomisk og epigenomisk profilering 7,11. Mens der findes metoder til fremstilling af kraniale NCC'er fra forskellige udviklingsmodelorganismer12,13,14, demonstrerer denne artikel mekanikken i tilgangen for dem, der først lærer at dyrke kranial NCC fra kyllingembryoner.
Den nuværende protokol beskriver en alsidig teknik til fremstilling af chick kraniale NCC-kulturer (figur 1). Fordi NCC'er migrerer let fra explantede neurale folder på et kultursubstrat, adskilles chick NCC'er naturligt fra embryonalt væv, og primære kulturer genereres let. Da NCC'er i mellemhjernen migrerer en masse fra kraniale neurale folder (i modsætning til den langvarige cell-for-celle-delaminering i bagagerummet15), består disse kulturer hovedsageligt af migrerende kraniale neurale kamceller, med indledende neurale foldudskæringer, der giver en indsamlingsmetode til præmigratoriske NCC'er. En grundlæggende metode til dissekering og dyrkning af chick kraniale neurale folder er detaljeret, og der tilbydes forslag til forskellige applikationer og variationer af denne metode.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig01v2.jpg"> Figur 1: Skematisk oversigt over chick cranial neural fold kultur protokol. (A,B) Kraniale neurale folder (skitseret med blåt) udskæres fra et kyllingembryo med fem somitter (vist i dorsal visning i A). Grå bånd, hjertehalvmåne. (C) Når de er belagt med fibronectin, kommer migrerende neurale kamceller ud af de neurale folder og spredes på substratet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63799/63799fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber dishes (glass bottom, single or divided)</td>
			<td>MatTek; Cell Vis</td>
			<td>P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) 
			X000NOK1OJ (Cellvis)</td>
			<td>Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>633029, 633031, 633033, 633035, 633037</td>
			<td>circles, 0.13&#8211;0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Alternative for L15 media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Sportsman</td>
			<td>1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40008A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>grade 3MM chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (blunt)</td>
			<td>Fisher Scientific; Thomas Scientific</td>
			<td>08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td>Free image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold)</td>
			<td>Vector Laboratories; Thermofisher Scientific</td>
			<td>H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td>10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>VWR (or similar)</td>
			<td></td>
			<td>60 mm, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>multiple flurophores available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td>For tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (dissection)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td>35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>Variety of sources</td>
			<td></td>
			<td>0.01&#34; diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures

Under hvirveldyrudvikling migrerer neurale kamceller (NCC'er) i vid udstrækning og differentierer sig til forskellige celletyper, der bidrager til strukturer som det kraniofaciale skelet og det perifere nervesystem. Selvom det er afgørende at forstå NCC-migration i forbindelse med et 3D-embryo, letter isolering af migrerende celler i 2D-kultur visualisering og funktionel karakterisering, der supplerer embryonale undersøgelser. Den nuværende protokol demonstrerer en metode til isolering af chick kraniale neurale folder for at generere primære NCC-kulturer. Migrerende NCC'er kommer ud af neurale fold explants belagt på et fibronectinbelagt substrat. Dette resulterer i spredte, vedhængende NCC-populationer, der kan vurderes ved farvning og kvantitative morfologiske analyser. Denne forenklede kulturtilgang er meget tilpasningsdygtig og kan kombineres med andre teknikker. For eksempel kan NCC-emigration og migrerende adfærd evalueres ved time-lapse-billeddannelse eller funktionelt forespørges ved at inkludere hæmmere eller eksperimentelle manipulationer af genekspression (f.eks. DNA, morpholino eller CRISPR-elektroporation). På grund af sin alsidighed giver denne metode et kraftfuldt system til undersøgelse af kranial NCC-udvikling.

En oversigt over denne protokol er vist i figur 1. De inkuberede æg blev åbnet, og æggeblommen med embryoet på overfladen blev isoleret ved forsigtigt at hælde i håndfladen på en behandsket hånd (figur 2A, B). Efter at albuminet er blevet fjernet (figur 2C), blev der påført filterpapirrammer på æggeblommemembranen, der omgiver embryoet, for at lette skæring og løft af embryoet fra æggeblommen, som beg...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Denne alsidige protokol beskriver isoleringen af præmigratoriske neurale kamceller (NCC'er) gennem udskæring af kraniale neurale folder fra kyllingembryoner. Ved plettering og inkubation kommer migrerende NCC'er ud af neurale foldeksplanter, hvilket giver mulighed for vurdering af cellemorfologi og migration i et forenklet 2D-miljø.

Forberedelse og morfologisk analyse af chick kraniale neurale crestcellekulturer

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Neurale kamceller emigrerer fra kraniale neurale folder i embryoner eller når de placeres i kultur. Dette giver en bekvem metode til at isolere primære migrerende neurale kamceller uden celledissociation. Mens neural crest-migration typisk forekommer inden for det tredimensionelle embryonale miljø, muliggør todimensionel kultur visualisering og undersøgelse af migrationsrelaterede processer.Selvom der findes kraniale neurale foldkulturprotokoller, kræver denne metode træning og organismespecifikke trin. Denne video demonstrerer teknikker til at lette den reproducerbare forberedelse af chick kraniale neurale foldkulturer. Begyndere kæmper ofte med at dissekere og plettere neurale folder og vurdere kulturresultater.Ved at følge dissektionsretningslinjerne og anvende den morfometriske analyse, der er beskrevet her, kan der opnås konsistente, kvantitative resultater. Til at begynde med skal du placere de befrugtede æg i opretstående stilling inde i en befugtet inkubator ved 38 grader Celsius. Efter fjernelse af æggene fra inkubatoren desinficeres skallerne ved grundigt at sprøjte 70% ethanol og lade dem tørre.Til fastgørelse og farvning af kulturerne skal du bruge glasdæksler placeret i en multi-well vævskulturskål og pipette nok fibronectinopløsning til at dække bunden af brønden. Udskift derefter låget, og inkuber pladen med fibronectinopløsning i en befugtet inkubator ved 38 grader Celsius i mindst en time, mens du dissekerer neurale folder. Brug stump tang til at stikke et lille hul i skallen ved 1/4 til 1/3 af æggets længde.Indsæt forsigtigt de stumpe tang i det lille hul, og sørg for ikke at forstyrre æggeblommen. Skær derefter gennem æggeskallen omkring ægget, fjern toppen af æggeskallen, og placer embryoet til isolering. Forbered embryoet ved forsigtigt at bruge den flade kant af lukkede stumpe tang til at tørre overskydende albumin væk på æggeblommens overflade, der dækker embryoet.Brug tang til at placere en filterpapirstøtteramme over embryoet med embryoet i rammens vindue. Tryk forsigtigt ned på filterpapiret for at klæbe til æggeblommen. Skær rundt om ydersiden af filterpapirrammen med dissektionssaks.Brug tang eller saksespidser til at gribe fat i kanten af rammen, og løft forsigtigt embryoet væk fra æggeblommen. Placer embryoet med papirrammens side nedad i en 60 eller 100 milliliter petriskål fyldt med Ringer's med pen-strep. Opbevar skålen med embryoner på is, hvis du samler dem til en RNA- eller proteinfølsom downstream-applikation.Overfør et embryo til en ren skål, der indeholder Ringers pen-strep-opløsning. Sving forsigtigt embryoet frem og tilbage for at fjerne enhver æggeblomme, der skjuler udsigten, og byt Ringers pen-strep-opløsning eller overfør den til en frisk skål, hvis den bliver overskyet. Placer embryoets dorsale og rammeside opad under et dissekerende mikroskop.Lad embryoet stå på papirrammen for at holde det strakt og holdt på plads. Fjern derefter vitellinmembranen ved hjælp af tang for at udsætte de neurale folder. Inkluder væv caudal til de ekspanderende optiske vesikler og rostral til baghjernen, hvor rhombomere indsnævringer lige er begyndt at dukke op.Brug fjedersaksen til forsigtigt at skære mellemhjernens neurale folder. Sørg for at fjerne det dorsale aspekt af neuralfolden med minimal forurening af neuralrøret og ikke-neurale ektoderm, og overfør neurale folder til en ren skål, der indeholder Ringers pen-strep-opløsning ved hjælp af en P20-pipettor eller en steril pasteur-pipette i glas skyllet med yolky Ringers pen-strep-opløsning. Opbevar indsamlede folder på is, mens du dissekerer yderligere folder.Når du har fjernet kulturskålen fra inkubatoren, skal du bruge en pipettor eller Pasteur-pipette til at fjerne fibronectinopløsningen fra dæksedler, skål eller brønd. Efter skylning af det fibronectinbelagte substrat med Ringers pen-strep-opløsning tilsættes et passende volumen komplette kulturmedier til skålen eller brønden. For at blokere plasten og forhindre vævet i at klæbe, skal du bruge en P20- eller P200-pipettor og skylle pipettespidsen med yolky Ringers pen-strep-opløsning.Overfør derefter de isolerede neurale folder mod midten af den fibronectinbelagte dækslip, og sørg for at overføre så lidt Ringers pen-strep-opløsning som muligt. Efter at have ladet explanterne slå sig ned i 10 til 15 minutter, skal du placere dem i et befugtet kammer ved 38 grader Celsius ved langsomt og forsigtigt at bære kulturskålen med belagte neurale folder. Fjern kulturmediet med en Pasteur-pipette, og skyl brøndene med filtersteriliseret PBS.Tilsæt 4% paraformaldehyd, og hold det på en platformryster i 15 minutter ved stuetemperatur. Ved afslutningen af inkubationen fjernes paraformaldehyd, brøndene skylles tre gange med PBS, og PBST indeholdende 5% serum. Nu pipetteres 30 mikroliter 200-nanomolar Oregon Green konjugeret phalloidin på en glat overflade for hver dækslip.Brug et par tang til at fjerne dækslippet fra PBST, der indeholder 5% serum, hvilket sikrer orienteringen af cellerne, der vender opad. Væg overskydende væske af ved kort at røre dækslipens kant til en delikat opgavevisker. Placer forsigtigt hver dækslipcelle side nedad på dråben af fortyndet phalloidin, og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.Efter inkubationsperioden skal du løfte dækselslippet fra farvningsopløsningen og placere det tilbage i kulturskålen og vende det om, så cellesiden er oppe. Sørg for at dække dækslappen med PBST, og læg den på en platformryster i 10 minutter, så dækslerne holdes dækket og i mørke. Fjern PBST, og gentag vask af dækslyngerne to gange i alt tre 10-minutters vaske.Placer en dråbe monteringsmedier på et mikroskopglas. Monter dækslipcellens side nedad ved langsomt at sænke dækslikket i en vinkel på monteringsmediet for at undgå at skabe bobler, og lad mediet sætte sig før billeddannelse. Til sidst skal du afbilde de farvede celler og eksportere dem som TIFF-filer.De neurale kamceller begyndte at dukke op fra vedhæftede neurale foldeksplanter inden for tre til fire timer efter inkubation, og migrationen blev afsluttet efter ca. 20 timer. De migrerende neurale kamceller blev mærket ved hjælp af HNK-1, og de fleste celler syntes at være HNK-1-positive. De migrerede neurale kamceller blev visualiseret ved farvning af filamentøs actin med phalloidin.Billeder af de phalloidinfarvede celler blev behandlet ved hjælp af ImageJ for at producere et tærskelbillede, hvor celler syntes sorte med en hvid baggrund. Tærskelbilledet blev analyseret, og forskellige målinger blev vist i kontrasterende søjlediagrammer eller violinplotter. For eksempel var det gennemsnitlige areal af de 69 analyserede celler ca. 802, 11 kvadratmikrometer, der spænder fra 60, 27 til 2.664, 53 kvadratmikrometer.Cirkularitet afspejler cellens fremspring og varierer fra 0,101 til 0,875. De lavere værdier angiver en langstrakt form, mens en værdi af en angiver en perfekt cirkel. De fleste celler udviste en langstrakt form, som lettest ses i violinplottet.Migrerende neurale kamceller i dette felt havde et gennemsnitligt billedformat på ca. 2,13, og et billedformat på en indikerer en symmetrisk form. Omhyggelig excision og explant plating er afgørende for vellykkede kulturer. Lad neurale folder sætte sig med skæresiden nedad i 10 til 15 minutter, og overfør derefter langsomt til inkubatoren for at tilskynde til vedhæftning.Variationer af disse teknikker omfatter forbigående genetisk manipulation før dyrkning og time-lapse billeddannelse under inkubation. Derudover giver denne protokol mulighed for indsamling af præmigratoriske og migrerende neurale kamcellepopulationer til analyse på omics-niveau.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiering af en human neural stamcelle Line på tredimensionelle kulturer, Analyse af MicroRNA og formodede målgener

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dobbelt mærkning af neurale crest celler og blodkar i kyllingembryoner ved hjælp af ChickGFP Neural Tube Poding og Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Levering af<em&gt; In vivo</em&gt; Akut intermitterende Hypoxi i Neonatal Gnavere til premierminister subventrikulære Zone-afledte Neural progenitorcelle kulturer

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Frem Genetisk tilgang til Afdække Stress resistensgener i mus - En Højkapacitetsforskning skærm i ES-celler

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generering af genetisk modificerede Organotypiske Skin Cultures Brug devitaliseret Menneskelig Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dyrkning Menneskelig pluripotente og neurale stamceller i en Lukket Cell Culture System for Basic og Prækliniske Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Etablering af proliferativ Tetraploide Celler fra transformerede humane fibroblaster

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi Photon tid bortfalder Imaging til at visualisere udvikling i realtid: visualisering af overflytning neurale Crest celler i zebrafisk embryoner

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika Virus infektion af kulturperler menneskelige fostrets hjerne neurale stamceller til andre analyse

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering af Tangential celle Migration i den udviklende Chick optiske Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...