Name: preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures
Uploaded: 2022-06-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

We bedanken Corinne A. Fairchild en Katie L. Vermillion, die hebben deelgenomen aan de ontwikkeling van onze versie van het chick cranial neural fold culture protocol.

Elke variëteit van Gallus gallus rassen kan worden gebruikt, met inbegrip van White Leghorn, Golden Sex Link, of Rhode Island Red. De kippeneieren die in deze studie werden gebruikt, waren van verschillende rassen en verkregen uit meerdere bronnen, waaronder lokale boerderijen en broederijen.
1. Bereiding van oplossingen en materialen
<ol><li>Bereid de oplossing van Ringer door 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na2HPO4</...

<ol>
	<li>Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+border:+Induction,+specification+and+maturation+of+the+territory+that+generates+neural+crest+cells.">The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells.</a> Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).</li><li>Tang, W., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+lineage+analysis:+From+past+to+future+trajectory.">Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory.</a> Development. 147 (20), (2021).</li><li>Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+different+migration+strategies+as+viewed+from+the+neural+crest.">Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+bulldoze+through+the+microenvironment+using+Aquaporin+1+to+stabilize+filopodia.">Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia.</a> Development. 147 (1), 185231 (2020).</li><li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+fragment+C3a+controls+mutual+cell+attraction+during+collective+cell+migration.">Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration.</a> Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).</li><li>Giovannone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slits+affect+the+timely+migration+of+neural+crest+cells+via+robo+receptor.">Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor.</a> Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).</li><li>Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+methylation+is+essential+for+neural+crest+migration.">Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration.</a> Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).</li><li>Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongator+Protein+3+(Elp3)+stabilizes+Snail1+and+regulates+neural+crest+migration+in+Xenopus.">Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Gonzalez Malagon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3+controls+migration+of+the+neural+crest+lineage+in+mouse+and+Xenopus.">Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).</li><li>Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+promotes+neural+crest+migration+via+yap/tead+signaling.">Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling.</a> Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).</li><li>Jacques-Fricke, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+NSD3-dependent+neural+crest+gene+expression+reveals+known+and+novel+candidate+regulatory+factors.">Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors.</a> Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).</li><li>Bronner-Fraser, M., Garc&#237;a-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+manipulations+of+neural+crest+cells+or+their+migratory+pathways.">Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways.</a> Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation.">Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).</li><li>Malagon, S. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+culture+and+analysis+of+primary+cranial+neural+crest+cells+from+mouse+for+the+study+of+neural+crest+cell+delamination+and+migration.">Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+delamination+and+migration:+From+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration.">Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).</li><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus.">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryological+and+genetic+manipulation+of+chick+development.">Embryological and genetic manipulation of chick development.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).</li><li>Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phalloidin+binding+site+of+F-actin.">The phalloidin binding site of F-actin.</a> The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).</li><li>Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+stages+of+trunk+neural+crest+migration+in+avian+embryos+using+monoclonal+antibody+HNK-1.">Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1.</a> Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations.">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations.</a> Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).</li><li>Haupt, A., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+their+own+shape+-+mechanisms+to+probe+cell+geometry+and+their+implications+in+cellular+organization+and+function.">How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li><li>Ezin, M., Fraser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+time-lapse+imaging+of+the+early+avian+embryo.">Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+live+imaging+of+avian+embryos.">In ovo live imaging of avian embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).</li><li>McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+neural+crest+cell+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+the+chick+embryo.">Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo.</a> Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).</li><li>Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+cranial+neural+crest+cells+release+extracellular+vesicles+that+are+critical+for+their+migration.">Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration.</a> Journal of Cell Science. , (2022).</li><li>Williams, R., Sauka-Spengler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+ovo+electroporation+of+early+chicken+embryos.">Ex ovo electroporation of early chicken embryos.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).</li><li>Moulton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+morpholinos+to+control+gene+expression.">Using morpholinos to control gene expression.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).</li><li>Gandhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-plasmid+approach+for+genome+editing+coupled+with+long-term+lineage+analysis+in+chick+embryos.">A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos.</a> Development. 148 (7), (2021).</li><li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+Global+Neural+Crest+Gene+Regulatory+Network+In+Vivo.">Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo.</a> Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).</li></ol>

De hier beschreven techniek biedt een aanpasbare methode om kuikenneuraalplooien te isoleren en te platen om culturen van migrerende craniale NCC's te creëren. Deze culturen bieden vereenvoudigde 2D-voorwaarden voor eenvoudige analyse van NCC-migratie en morfologie van kuikens die een aanvulling kunnen vormen op de meer technisch uitdagende ovo-beeldvormingsmethoden 24,25,26. Hoewel deze in vitro methode rela...

Neurale kamcellen (NCC's) zijn een voorbijgaande celpopulatie in gewervelde embryo's. NCC's worden gespecificeerd aan de randen van de neurale plaat en ondergaan een epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT) om te migreren vanuit de dorsale neurale buis1. Na EMT verspreiden NCC's zich uitgebreid door het embryo, waardoor uiteindelijk onderscheid wordt gemaakt en wordt bijgedragen aan verschillende structuren, waaronder het craniofaciale skelet, het uitstroomkanaal van het hart en het grootste deel van het perifere zenuwstelsel2. Veranderingen in celpolariteit, het cytoskelet en adhesie-eigenschappen liggen ten grondslag aan deze verschuiving van een premigratory naar een migrerende celpopulatie3. Het bestuderen van NCC EMT en migratie biedt inzicht in fundamentele mechanismen van celmotiliteit en informeert inspanningen om geboorteafwijkingen en kankermetastase te voorkomen en te behandelen.
Hoewel in vivo analyse van vitaal belang is voor het begrijpen van NCC-ontwikkelingsprocessen in een embryonale context, bieden in vitro methoden visuele en fysieke toegankelijkheid die aanvullende experimentele wegen mogelijk maakt. In een vereenvoudigde 2D-omgeving kunnen NCC-morfologie, cytoskeletstructuren en gemigreerde afstand worden geëvalueerd. Bovendien kunnen de effecten van genetische of oplosbare factorverstoring op migratiegedrag van beweeglijke NCC's worden geanalyseerd 4,5,6,7,8,9,10. Bovendien kunnen geïsoleerde premigratory of migrerende NCC's worden verzameld, gepoold en gebruikt voor high-throughput methodologieën om de ontwikkelingsregulatie van NCC's te bestuderen door middel van proteomische, transcriptomische en epigenomische profilering 7,11. Hoewel er methoden beschikbaar zijn voor het bereiden van craniale NCC's van verschillende ontwikkelingsmodelorganismen 12,13,14, demonstreert dit artikel de mechanica van de aanpak voor degenen die voor het eerst leren om craniale NCC te kweken uit kuikenembryo's.
Het huidige protocol beschrijft een veelzijdige techniek voor het bereiden van kuiken craniale NCC-culturen (figuur 1). Omdat NCC's gemakkelijk migreren van geëxplanteerde neurale plooien naar een kweeksubstraat, scheiden kuiken-NCC's zich op natuurlijke wijze van embryonaal weefsel en worden primaire culturen gemakkelijk gegenereerd. Aangezien midbrain NCCs massaal migreren uit de craniale neurale plooien (in tegenstelling tot de langdurige, cel-voor-cel delaminatie in de stam15), bestaan deze culturen voornamelijk uit migrerende craniale neurale crest-cellen, waarbij initiële neurale vouwexcisie een verzamelmethode biedt voor premigratory NCC's. Een basismethode voor het ontleden en kweken van kuiken craniale neurale plooien is gedetailleerd en suggesties voor verschillende toepassingen en variaties op deze methode worden aangeboden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig01v2.jpg"> Figuur 1: Schematisch overzicht van het kuiken craniale neurale vouwcultuurprotocol. (A,B) Craniale neurale plooien (omlijnd in blauw) worden weggesneden uit een kuikenembryo met vijf somites (weergegeven in dorsale weergave in A). Grijze banden, cardiale halve maan. (C) Wanneer ze op fibronectine worden geplaatst, komen migrerende neurale kamcellen uit de neurale plooien en verspreiden zich op het substraat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63799/63799fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber dishes (glass bottom, single or divided)</td>
			<td>MatTek; Cell Vis</td>
			<td>P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) 
			X000NOK1OJ (Cellvis)</td>
			<td>Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>633029, 633031, 633033, 633035, 633037</td>
			<td>circles, 0.13&#8211;0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Alternative for L15 media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Sportsman</td>
			<td>1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40008A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>grade 3MM chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (blunt)</td>
			<td>Fisher Scientific; Thomas Scientific</td>
			<td>08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td>Free image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold)</td>
			<td>Vector Laboratories; Thermofisher Scientific</td>
			<td>H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td>10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>VWR (or similar)</td>
			<td></td>
			<td>60 mm, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>multiple flurophores available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td>For tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (dissection)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td>35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>Variety of sources</td>
			<td></td>
			<td>0.01&#34; diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures

Tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren migreren neurale crestcellen (NCC's) uitgebreid en differentiëren ze in verschillende celtypen die bijdragen aan structuren zoals het craniofaciale skelet en het perifere zenuwstelsel. Hoewel het van cruciaal belang is om NCC-migratie te begrijpen in de context van een 3D-embryo, vergemakkelijkt het isoleren van migrerende cellen in 2D-cultuur visualisatie en functionele karakterisering, als aanvulling op embryonale studies. Het huidige protocol demonstreert een methode voor het isoleren van kuiken craniale neurale plooien om primaire NCC-culturen te genereren. Migrerende NCC's komen voort uit neurale vouwexplantaten die op een met fibronectine gecoat substraat zijn geplaatst. Dit resulteert in verspreide, aanhangende NCC-populaties die kunnen worden beoordeeld door kleuring en kwantitatieve morfologische analyses. Deze vereenvoudigde cultuurbenadering is zeer aanpasbaar en kan worden gecombineerd met andere technieken. NCC-emigratie en migratiegedrag kunnen bijvoorbeeld worden geëvalueerd door time-lapse-beeldvorming of functioneel worden bevraagd door remmers of experimentele manipulaties van genexpressie op te nemen (bijv. DNA, morfolino of CRISPR-elektroporatie). Vanwege zijn veelzijdigheid biedt deze methode een krachtig systeem voor het onderzoeken van craniale NCC-ontwikkeling.

Een overzicht van het huidige protocol is weergegeven in figuur 1. De bebroede eieren werden geopend en de dooier, met het embryo op het oppervlak, werd geïsoleerd door voorzichtig in de palm van een gehandschoende hand te gieten (figuur 2A, B). Na het opruimen van het albumine (figuur 2C), werden filterpapierframes aangebracht op het dooiermembraan rond het embryo om het snijden en optillen van het embryo uit de d...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Dit veelzijdige protocol beschrijft de isolatie van premigratory neural crest cells (NCC's) door de excisie van craniale neurale plooien van kuikenembryo's. Bij plating en incubatie komen migrerende NCC's tevoorschijn uit neurale vouwexplantaten, waardoor celmorfologie en migratie in een vereenvoudigde 2D-omgeving kunnen worden beoordeeld.

Voorbereiding en morfologische analyse van Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Neurale kamcellen emigreren uit schedelneuraalplooien in embryo's of wanneer ze in cultuur worden geplaatst. Dit biedt een handige methode om primaire migrerende neurale crest-cellen te isoleren zonder celdissociatie. Terwijl neurale crestmigratie meestal plaatsvindt binnen de driedimensionale embryonale omgeving, maakt tweedimensionale cultuur visualisatie en onderzoek van migratiegerelateerde processen mogelijk.Hoewel er craniale neurale vouwcultuurprotocollen bestaan, vereist deze methode training en organismespecifieke stappen. Deze video demonstreert technieken om de reproduceerbare voorbereiding van kuiken craniale neurale vouwculturen te vergemakkelijken. Beginners worstelen vaak met het ontleden en plating van neurale plooien en het beoordelen van cultuurresultaten.Door de dissectierichtlijnen te volgen en de hier beschreven morfometrische analyse toe te passen, kunnen consistente, kwantitatieve resultaten worden verkregen. Plaats om te beginnen de bevruchte eieren rechtop in een bevochtigde incubator bij 38 graden Celsius. Nadat u de eieren uit de incubator hebt verwijderd, desinfecteert u de schelpen door 70% ethanol grondig te spuiten en te laten drogen.Gebruik voor het bevestigen en kleuren van de culturen glazen afdekglijders die in een weefselkweekschaal met meerdere putten zijn geplaatst en pipetteer voldoende fibronectine-oplossing om de bodem van de put te bedekken. Vervang vervolgens het deksel en incubeer de plaat met fibronectine-oplossing in een bevochtigde incubator bij 38 graden Celsius gedurende ten minste een uur terwijl neurale plooien worden ontleed. Gebruik een stompe tang om een klein gaatje in de schaal te prikken op 1/4 tot 1/3 van de lengte van het ei.Steek de stompe tang voorzichtig in het kleine gat en zorg ervoor dat de dooier niet wordt verstoord. Snijd vervolgens de eierschaal rond het ei door, verwijder de bovenkant van de eierschaal en plaats het embryo voor isolatie. Bereid het embryo voor door voorzichtig de platte rand van een gesloten stompe tang te gebruiken om overtollig albumine op het oppervlak van de dooier die het embryo bedekt weg te vegen.Gebruik een tang om een filterpapieren steunframe over het embryo te plaatsen, met het embryo in het raam van het frame. Druk zachtjes op het filtreerpapier om aan de dooier te hechten. Knip rond de buitenkant van het filterpapierframe met een dissectieschaar.Gebruik een tang of schaartips om de rand van het frame vast te pakken en til het embryo voorzichtig weg van de dooier. Plaats het embryo met de papierlijstzijde naar beneden in een petrischaaltje van 60 of 100 milliliter gevuld met Ringer's met penstreep. Bewaar de schaal met embryo's op ijs als je ze verzamelt voor een RNA- of eiwitgevoelige downstream-toepassing.Breng een embryo over naar een schone schaal met Ringer's pen-strep-oplossing. Zwaai het embryo voorzichtig heen en weer om alle dooiers die het zicht verduisteren op te ruimen en wissel de Pen-streptokokkenoplossing van de Ringer in of breng het over naar een vers gerecht als het troebel wordt. Plaats het embryo dorsaal en frame met de zijkant naar boven onder een ontleedmicroscoop.Laat het embryo op het papieren frame liggen om het uitgerekt en op zijn plaats te houden. Verwijder vervolgens het vitellinemembraan en gebruik een tang om de neurale plooien bloot te leggen. Neem weefsel caudaal op aan de uitdijende optische blaasjes en rostral aan de achterhersenen, waar rhombomere vernauwingen net beginnen te verschijnen.Snijd met behulp van een veerschaar voorzichtig de neurale plooien van de middenhersenen weg. Zorg ervoor dat u het dorsale aspect van de neurale vouw verwijdert met minimale verontreiniging van de neurale buis en niet-neuraal ectoderm, en breng de neurale plooien over naar een schone schaal met Ringer's pen-strep-oplossing met behulp van een P20-pipettor of een steriele glazen Pasteur-pipet gespoeld met dooierAchtige Ringer's pen-strep-oplossing. Bewaar verzamelde plooien op ijs terwijl extra plooien worden ontleed.Nadat u de kweekschaal uit de incubator hebt verwijderd, gebruikt u een pipettor of Pasteur-pipet om de fibronectine-oplossing uit de afdekslips, schotel of put te verwijderen. Nadat u het met fibronectine bedekte substraat hebt gespoeld met Ringer's pen-strep-oplossing, voegt u een geschikt volume complete kweekmedia toe aan de schaal of put. Om het plastic te blokkeren en te voorkomen dat het weefsel plakt, gebruikt u een P20- of P200-pipettor en spoelt u de pipetpunt af met de pen-strepoplossing van Yolky Ringer.Breng vervolgens de geïsoleerde neurale plooien over naar het midden van de met fibronectine gecoate afdekslip en zorg ervoor dat zo weinig mogelijk Ringer's pen-strep-oplossing wordt overgedragen. Nadat je de explantaten 10 tot 15 minuten hebt laten bezinken, plaats je ze in een bevochtigde kamer bij 38 graden Celsius door de kweekschaal langzaam en voorzichtig met vergulde neurale plooien te dragen. Verwijder de kweekmedia met een Pasteur-pipet en spoel de putjes af met filtergesteriliseerd PBS.Voeg 4% paraformaldehyde toe en bewaar het op een platform shaker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder aan het einde van de incubatie paraformaldehyde, spoel de putjes drie keer met PBS en voeg PBST toe dat 5% serum bevat. Nu pipetteer 30 microliter 200-nanomolar Oregon Green geconjugeerd falloidine op een glad oppervlak voor elke afdekslip.Verwijder met behulp van een tang de afdekslip van het PBST-serum met 5%, zodat de cellen naar boven gericht zijn. Voer overtollige vloeistof af door de rand van de afdekplaat kort aan te raken tegen een delicate taakwisser. Plaats voorzichtig elke afdekselcelzijde naar beneden op de druppel verdund falloïdine en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Til na de incubatietijd de afdeksel van de kleuringsoplossing op en plaats deze terug in de kweekschaal, draai deze om zodat de celzijde omhoog is. Zorg ervoor dat u de afdekslip bedekt met PBST en plaats deze gedurende 10 minuten op een platformschudder, waarbij u de afdekslips bedekt en in het donker houdt. Verwijder PBST en herhaal het tweemaal wassen van de afdekslips voor in totaal drie wasbeurten van 10 minuten.Plaats een druppel montagemedia op een microscoopglaasje. Monteer de cover slip cell met de zijkant naar beneden door de cover slip langzaam onder een hoek op de montagemedia te laten zakken om te voorkomen dat er bubbels ontstaan en laat de media instellen voordat ze in beeld worden gebracht. Maak ten slotte een afbeelding van de gekleurde cellen en exporteer ze als TIFF-bestanden.De neurale kuifcellen begonnen binnen drie tot vier uur na incubatie uit de aanhangende neurale vouwexplantaten te komen en de migratie werd na ongeveer 20 uur voltooid. De migrerende neurale crest-cellen werden gelabeld met behulp van HNK-1 en de meeste cellen bleken HNK-1-positief te zijn. De gemigreerde neurale topcellen werden gevisualiseerd door filamenteuze actine te kleuren met falloïdine.Afbeeldingen van de met falloidine bevlekte cellen werden verwerkt met Behulp van ImageJ om een drempelafbeelding te produceren waarin cellen zwart leken met een witte achtergrond. Het drempelbeeld werd geanalyseerd en verschillende metingen werden weergegeven in contrasterende staafdiagrammen of vioolplots. Het gemiddelde oppervlak van de 69 geanalyseerde cellen was bijvoorbeeld ongeveer 802,11 vierkante micrometer, variërend van 60,27 tot 2.664,53 vierkante micrometer.Circulariteit weerspiegelt de uitsteekpuitsteekbaarheid van de cel en varieert van 0,101 tot 0,875. De lagere waarden duiden op een langwerpige vorm, terwijl een waarde van één een perfecte cirkel aangeeft. De meeste cellen vertoonden een langwerpige vorm, die het gemakkelijkst te zien is in de vioolplot.Migrerende neurale kamcellen in dit veld hadden een gemiddelde beeldverhouding van ongeveer 2,13, en een beeldverhouding van één duidt op een symmetrische vorm. Zorgvuldige excisie en explantbeplating zijn cruciaal voor succesvolle culturen. Laat neurale plooien gedurende 10 tot 15 minuten met de gesneden kant naar beneden zakken en breng vervolgens langzaam over naar de couveuse om de hechting te bevorderen.Variaties op deze technieken omvatten voorbijgaande genetische manipulatie voorafgaand aan het kweken en time-lapse beeldvorming tijdens incubatie. Bovendien maakt dit protocol het mogelijk om premigratory en migrerende neurale crest celpopulaties te verzamelen voor analyse op omics-niveau.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling van neurale kuifcellen en bloedvaten in kippenembryo's met behulp van ChickGFP Neural Tube Enting en Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Levering van<em&gt; In Vivo</em&gt; Acute intermitterende hypoxie in Neonatale Knaagdieren Prime subventriculaire zone-afgeleide Neural Progenitor Cell Cultures

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetische Aanpak stress resistentiegenen in Muizen Ontdek - Een High-throughput scherm in ES-cellen

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generatie van genetisch gemodificeerde Organotypische Skin Culturen behulp gedevitaliseerde Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Het kweken van pluripotente menselijke en neurale stamcellen in een afgesloten cel Cultuur System for Basic en preklinisch onderzoek

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Oprichting van Proliferatieve Tetraploïde Cellen uit niet-getransformeerde humane fibroblasten

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika Virus infectie van gekweekte menselijke foetale hersenen neurale stamcellen immunocytochemische p.a.

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisatie van tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...