Name: preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures
Uploaded: 2022-06-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

Wir danken Corinne A. Fairchild und Katie L. Vermillion, die an der Entwicklung unserer Version des Chick Cranial Neural Fold Culture Protocol beteiligt waren.

Jede Vielzahl von Gallus gallus-Rassen kann verwendet werden, einschließlich White Leghorn, Golden Sex Link oder Rhode Island Red. Die in der vorliegenden Studie verwendeten Hühnereier stammten aus verschiedenen Rassen und stammten aus verschiedenen Quellen, einschließlich lokaler Bauernhöfe und Brütereien.
1. Herstellung von Lösungen und Materialien
<ol><li>Die Ringer-Lösung wird durch Mischen von 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl 2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na2...

<ol>
	<li>Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+border:+Induction,+specification+and+maturation+of+the+territory+that+generates+neural+crest+cells.">The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells.</a> Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).</li><li>Tang, W., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+lineage+analysis:+From+past+to+future+trajectory.">Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory.</a> Development. 147 (20), (2021).</li><li>Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+different+migration+strategies+as+viewed+from+the+neural+crest.">Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+bulldoze+through+the+microenvironment+using+Aquaporin+1+to+stabilize+filopodia.">Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia.</a> Development. 147 (1), 185231 (2020).</li><li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+fragment+C3a+controls+mutual+cell+attraction+during+collective+cell+migration.">Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration.</a> Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).</li><li>Giovannone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slits+affect+the+timely+migration+of+neural+crest+cells+via+robo+receptor.">Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor.</a> Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).</li><li>Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+methylation+is+essential+for+neural+crest+migration.">Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration.</a> Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).</li><li>Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongator+Protein+3+(Elp3)+stabilizes+Snail1+and+regulates+neural+crest+migration+in+Xenopus.">Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Gonzalez Malagon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3+controls+migration+of+the+neural+crest+lineage+in+mouse+and+Xenopus.">Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).</li><li>Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+promotes+neural+crest+migration+via+yap/tead+signaling.">Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling.</a> Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).</li><li>Jacques-Fricke, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+NSD3-dependent+neural+crest+gene+expression+reveals+known+and+novel+candidate+regulatory+factors.">Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors.</a> Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).</li><li>Bronner-Fraser, M., Garc&#237;a-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+manipulations+of+neural+crest+cells+or+their+migratory+pathways.">Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways.</a> Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation.">Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).</li><li>Malagon, S. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+culture+and+analysis+of+primary+cranial+neural+crest+cells+from+mouse+for+the+study+of+neural+crest+cell+delamination+and+migration.">Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+delamination+and+migration:+From+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration.">Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).</li><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus.">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryological+and+genetic+manipulation+of+chick+development.">Embryological and genetic manipulation of chick development.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).</li><li>Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phalloidin+binding+site+of+F-actin.">The phalloidin binding site of F-actin.</a> The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).</li><li>Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+stages+of+trunk+neural+crest+migration+in+avian+embryos+using+monoclonal+antibody+HNK-1.">Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1.</a> Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations.">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations.</a> Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).</li><li>Haupt, A., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+their+own+shape+-+mechanisms+to+probe+cell+geometry+and+their+implications+in+cellular+organization+and+function.">How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li><li>Ezin, M., Fraser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+time-lapse+imaging+of+the+early+avian+embryo.">Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+live+imaging+of+avian+embryos.">In ovo live imaging of avian embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).</li><li>McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+neural+crest+cell+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+the+chick+embryo.">Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo.</a> Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).</li><li>Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+cranial+neural+crest+cells+release+extracellular+vesicles+that+are+critical+for+their+migration.">Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration.</a> Journal of Cell Science. , (2022).</li><li>Williams, R., Sauka-Spengler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+ovo+electroporation+of+early+chicken+embryos.">Ex ovo electroporation of early chicken embryos.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).</li><li>Moulton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+morpholinos+to+control+gene+expression.">Using morpholinos to control gene expression.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).</li><li>Gandhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-plasmid+approach+for+genome+editing+coupled+with+long-term+lineage+analysis+in+chick+embryos.">A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos.</a> Development. 148 (7), (2021).</li><li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+Global+Neural+Crest+Gene+Regulatory+Network+In+Vivo.">Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo.</a> Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).</li></ol>

Die hier beschriebene Technik bietet eine anpassungsfähige Methode, um neuronale Kükenfalten zu isolieren und zu plattieren, um Kulturen von wandernden kranialen NCCs zu erzeugen. Diese Kulturen bieten vereinfachte 2D-Bedingungen für eine einfache Analyse der NCC-Migration und -Morphologie von Küken, die technisch anspruchsvollere Ovo-Bildgebungsverfahren ergänzen können24,25,26. Während diese In-vitro-Method...

Neuralleistenzellen (NCCs) sind eine vorübergehende Zellpopulation in Wirbeltierembryonen. NCCs werden an den Grenzen der Neuralplatte spezifiziert und durchlaufen einen epithelialen zu mesenchymalen Übergang (EMT), um aus dem dorsalen Neuralrohr1 zu wandern. Nach EMT verteilen sich NCCs weitgehend im gesamten Embryo und differenzieren und tragen letztendlich zu verschiedenen Strukturen bei, einschließlich des kraniofazialen Skeletts, des Ausflusstrakts des Herzens und des größten Teils des peripheren Nervensystems2. Veränderungen der Zellpolarität, des Zytoskeletts und der Adhäsionseigenschaften liegen dieser Verschiebung von einer primären zu einer wandernden Zellpopulation zugrunde3. Die Untersuchung von NCC EMT und Migration liefert Einblicke in grundlegende Mechanismen der Zellmotilität und informiert über die Bemühungen zur Vorbeugung und Behandlung von Geburtsfehlern und Krebsmetastasen.
Während die In-vivo-Analyse für das Verständnis von NCC-Entwicklungsprozessen in einem embryonalen Kontext von entscheidender Bedeutung ist, bieten In-vitro-Methoden visuelle und physische Zugänglichkeit, die zusätzliche experimentelle Wege ermöglichen. In einer vereinfachten 2D-Umgebung können NCC-Morphologie, Zytoskelettstrukturen und Distanz migriert ausgewertet werden. Darüber hinaus können die Auswirkungen der genetischen oder löslichen Faktorstörung auf das Migrationsverhalten beweglicher NCCs analysiert werden 4,5,6,7,8,9,10. Darüber hinaus können isolierte präpagratorische oder migrierende NCCs gesammelt, gepoolt und für Hochdurchsatzmethoden verwendet werden, um die Entwicklungsregulation von NCCs durch proteomische, transkriptomische und epigenomische Profilierung zu untersuchen 7,11. Während Methoden zur Herstellung von kranialen NCCs aus verschiedenen Entwicklungsmodellorganismen zur Verfügung stehen12,13,14, zeigt dieser Artikel die Mechanik des Ansatzes für diejenigen, die zuerst lernen, kraniale NCC aus Hühnerembryonen zu kultivieren.
Das aktuelle Protokoll beschreibt eine vielseitige Technik zur Herstellung von NCC-Kulturen des Kükenkrans (Abbildung 1). Da NCCs leicht aus explantierten Neuralfalten auf ein Kultursubstrat migrieren, trennen sich Hühner-NCCs auf natürliche Weise von embryonalem Gewebe, und Primärkulturen können leicht erzeugt werden. Da Mittelhirn-NCCs massenhaft aus den kranialen Neuralfalten wandern (im Gegensatz zur langwierigen Zell-für-Zell-Delaminierung im Stamm15), bestehen diese Kulturen hauptsächlich aus wandernden kranialen Neuralleistenzellen, wobei die anfängliche Neuralfaltenexzision eine Sammelmethode für premigratorische NCCs darstellt. Eine grundlegende Methode zur Sezierung und Kultivierung von Küken-Schädel-Neuralfalten wird detailliert beschrieben, und es werden Vorschläge für verschiedene Anwendungen und Variationen dieser Methode angeboten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Schematische Übersicht des Kükenkranial-Neuralfaltenkulturprotokolls. (A,B) Schädelneuralfalten (blau umrandet) werden aus einem Hühnerembryo mit fünf Somiten herausgeschnitten (in dorsaler Ansicht in A). Graue Bänder, Herzsichel. (C) Wenn sie auf Fibronektin plattiert werden, treten wandernde Neuralleistenzellen aus den Neuralfalten aus und verteilen sich auf dem Substrat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63799/63799fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber dishes (glass bottom, single or divided)</td>
			<td>MatTek; Cell Vis</td>
			<td>P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) 
			X000NOK1OJ (Cellvis)</td>
			<td>Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>633029, 633031, 633033, 633035, 633037</td>
			<td>circles, 0.13&#8211;0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Alternative for L15 media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Sportsman</td>
			<td>1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40008A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>grade 3MM chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (blunt)</td>
			<td>Fisher Scientific; Thomas Scientific</td>
			<td>08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td>Free image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold)</td>
			<td>Vector Laboratories; Thermofisher Scientific</td>
			<td>H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td>10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>VWR (or similar)</td>
			<td></td>
			<td>60 mm, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>multiple flurophores available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td>For tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (dissection)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td>35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>Variety of sources</td>
			<td></td>
			<td>0.01&#34; diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures

Während der Entwicklung von Wirbeltieren wandern Neuralleistenzellen (NCCs) ausgiebig und differenzieren sich in verschiedene Zelltypen, die zu Strukturen wie dem kraniofazialen Skelett und dem peripheren Nervensystem beitragen. Während es wichtig ist, die NCC-Migration im Kontext eines 3D-Embryos zu verstehen, erleichtert die Isolierung wandernder Zellen in 2D-Kultur die Visualisierung und funktionelle Charakterisierung und ergänzt embryonale Studien. Das vorliegende Protokoll demonstriert eine Methode zur Isolierung von Schädelfalten von Küken, um primäre NCC-Kulturen zu erzeugen. Wandernde NCCs entstehen aus neuronalen Faltenexplantaten, die auf einem fibronektinbeschichteten Substrat plattiert sind. Dies führt zu verstreuten, adhärenten NCC-Populationen, die durch Färbung und quantitative morphologische Analysen beurteilt werden können. Dieser vereinfachte Kulturansatz ist sehr anpassungsfähig und kann mit anderen Techniken kombiniert werden. Zum Beispiel können NCC-Auswanderung und Migrationsverhalten durch Zeitraffer-Bildgebung ausgewertet oder funktionell abgefragt werden, indem Inhibitoren oder experimentelle Manipulationen der Genexpression (z. B. DNA-, Morpholino- oder CRISPR-Elektroporation) einbezogen werden. Aufgrund ihrer Vielseitigkeit bietet diese Methode ein leistungsfähiges System zur Untersuchung der kranialen NCC-Entwicklung.

Eine Übersicht über das aktuelle Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Die bebrüteten Eier wurden geöffnet, und das Eigelb mit dem Embryo auf der Oberfläche wurde isoliert, indem es vorsichtig in die Handfläche einer behandschuhten Hand gegossen wurde (Abbildung 2A, B). Nach dem Entfernen des Albumins (Abbildung 2C) wurden Filterpapierrahmen auf die Dottermembran aufgebracht, die den Embryo umgibt, um das Schneiden und Anheben des Embr...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Dieses vielseitige Protokoll beschreibt die Isolierung von primären Neuralleistenzellen (NCCs) durch die Exzision von kranialen Neuralfalten aus Hühnerembryonen. Nach der Beschichtung und Inkubation entstehen wandernde NCCs aus neuronalen Faltenexplantaten, was eine Beurteilung der Zellmorphologie und -migration in einer vereinfachten 2D-Umgebung ermöglicht.

Präparation und morphologische Analyse von Küken-Schädel-Neuralleistenzellkulturen

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Neuralleistenzellen wandern aus kranialen Neuralfalten in Embryonen oder wenn sie in Kultur gebracht werden. Dies bietet eine bequeme Methode, um primäre wandernde Neuralleistenzellen ohne Zelldissoziation zu isolieren. Während die Neuralleistenmigration typischerweise innerhalb der dreidimensionalen embryonalen Umgebung stattfindet, ermöglicht die zweidimensionale Kultur die Visualisierung und Untersuchung migrationsbezogener Prozesse.Obwohl kraniale neuronale Faltenkulturprotokolle existieren, erfordert diese Methode Training und organismusspezifische Schritte. Dieses Video zeigt Techniken, die die reproduzierbare Vorbereitung von kükenkranialen Neuralfaltenkulturen erleichtern. Anfänger haben oft Schwierigkeiten, neuronale Falten zu sezieren und zu plattieren und Kulturergebnisse zu bewerten.Die Einhaltung der Dissektionsrichtlinien und die Anwendung der hier beschriebenen morphometrischen Analyse ermöglicht konsistente, quantitative Ergebnisse. Legen Sie zunächst die befruchteten Eier in eine aufrechte Position in einen befeuchteten Inkubator bei 38 Grad Celsius. Nachdem Sie die Eier aus dem Inkubator genommen haben, desinfizieren Sie die Schalen, indem Sie 70% Ethanol gründlich besprühen und trocknen lassen.Verwenden Sie zum Fixieren und Färben der Kulturen Glasabdeckungsgläser, die in eine Multi-Well-Gewebekulturschale gelegt werden, und pipetten Sie genügend Fibronektinlösung, um den Boden der Vertiefung zu bedecken. Als nächstes ersetzen Sie den Deckel und inkubieren Sie die Platte mit Fibronektinlösung in einem befeuchteten Inkubator bei 38 Grad Celsius für mindestens eine Stunde, während Sie Neuralfalten sezieren. Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um ein kleines Loch in die Schale bei 1/4 bis 1/3 der Eilänge zu stechen.Führen Sie die stumpfe Pinzette vorsichtig in das kleine Loch ein, um das Eigelb nicht zu stören. Dann schneiden Sie durch die Eierschale um das Ei, entfernen Sie die Oberseite der Eierschale und positionieren Sie den Embryo zur Isolierung. Bereiten Sie den Embryo vor, indem Sie vorsichtig den flachen Rand der geschlossenen stumpfen Pinzette verwenden, um überschüssiges Albumin auf der Oberfläche des Eigelbs, die den Embryo bedeckt, abzuwischen.Verwenden Sie eine Pinzette, um einen Filterpapierträgerrahmen über den Embryo zu legen, wobei sich der Embryo im Fenster des Rahmens befindet. Drücken Sie vorsichtig auf das Filterpapier, um am Eigelb zu haften. Mit einer Sezierschere um die Außenseite des Filterpapierrahmens schneiden.Verwenden Sie eine Pinzette oder Scherenspitzen, um den Rand des Rahmens zu greifen, und heben Sie den Embryo vorsichtig vom Eigelb weg. Legen Sie den Embryo mit dem Papierrahmen mit der Seite nach unten in eine 60- oder 100-Milliliter-Petrischale, die mit Ringers mit Pen-Streptokokken gefüllt ist. Halten Sie die Schale der Embryonen auf Eis, wenn Sie sie für eine RNA- oder proteinempfindliche nachgeschaltete Anwendung sammeln.Einen Embryo in eine saubere Schale geben, die Ringers Streptokokkenlösung enthält. Schwenken Sie den Embryo vorsichtig hin und her, um das Eigelb zu entfernen, das die Sicht verdeckt, und tauschen Sie die Streptokokkenlösung des Ringers aus oder übertragen Sie sie in eine frische Schale, wenn sie trüb wird. Positionieren Sie den Embryo dorsal und die Rahmenseite nach oben unter einem Seziermikroskop.Lassen Sie den Embryo auf dem Papierrahmen, um ihn gedehnt und an Ort und Stelle zu halten. Entfernen Sie dann die Vitellinmembran mit einer Pinzette, um die Neuralfalten freizulegen. Schließen Sie kaudales Gewebe zu den expandierenden optischen Vesikeln und rostral zum Hinterhirn ein, wo Rhombomer-Verengungen gerade erst auftreten.Schneiden Sie mit einer Federschere vorsichtig die Neuralfalten des Mittelhirns aus. Achten Sie darauf, den dorsalsten Aspekt der Neuralfalte mit minimaler Kontamination des Neuralrohrs und des nicht-neuralen Ektoderms zu entfernen, und übertragen Sie die Neuralfalten in eine saubere Schale, die Ringers Pen-Streptokokkenlösung enthält, mit einem P20-Pipettor oder einer sterilen Glaspasteur-Pipette, die mit Eigelb Ringers Pen-Streptokokken-Lösung gespült wurde. Sammeln Sie gesammelte Falten auf Eis und sezieren Sie zusätzliche Falten.Nachdem Sie die Kulturschale aus dem Inkubator entfernt haben, verwenden Sie einen Pipettierer oder eine Pasteur-Pipette, um die Fibronektinlösung aus den Deckblättern, der Schale oder dem Brunnen zu entfernen. Nach dem Spülen des mit Fibronektin beschichteten Substrats mit Ringers Pen-Streptokokken-Lösung ein entsprechendes Volumen kompletter Nährmedien in die Schale oder Vertiefung geben. Um den Kunststoff zu blockieren und ein Anhaften des Gewebes zu verhindern, verwenden Sie einen P20- oder P200-Pipettor und spülen Sie die Pipettenspitze mit der Pen-Streptokokkenlösung von Yolky Ringer ab.Übertragen Sie dann die isolierten Neuralfalten in Richtung der Mitte des mit Fibronektin beschichteten Deckstreifens und achten Sie darauf, so wenig Ringers Pen-Streptokokken-Lösung wie möglich zu übertragen. Nachdem Sie die Explantate 10 bis 15 Minuten ruhen lassen, legen Sie sie in eine befeuchtete Kammer bei 38 Grad Celsius, indem Sie die Kulturschale langsam und vorsichtig mit plattierten Neuralfalten tragen. Entfernen Sie die Nährmedien mit einer Pasteur-Pipette und spülen Sie die Vertiefungen mit filtersterilisiertem PBS ab.Fügen Sie 4% Paraformaldehyd hinzu und halten Sie es 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattformschüttler. Am Ende der Inkubation Paraformaldehyd entfernen, die Vertiefungen dreimal mit PBS spülen und PBST mit 5% Serum hinzufügen. Pipettieren Sie nun 30 Mikroliter 200-Nanomolar Oregon Green konjugiertes Phalloidin auf eine glatte Oberfläche für jeden Deckschlicker.Entfernen Sie mit einer Pinzette den Deckschleim aus dem PBST, der 5% Serum enthält, und stellen Sie sicher, dass die Zellen nach oben ausgerichtet sind. Überschüssige Flüssigkeit ableiten, indem Sie kurz den Rand des Deckblatts zu einem empfindlichen Arbeitswischer berühren. Legen Sie jede Deckzelle vorsichtig mit der Seite nach unten auf den Tropfen verdünntes Phalloidin und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.Heben Sie nach der Inkubationszeit den Deckstreifen von der Färbelösung an und legen Sie ihn wieder in die Kulturschale, wobei Sie ihn umdrehen, so dass die Zellseite oben ist. Stellen Sie sicher, dass Sie den Deckschein mit PBST abdecken, und legen Sie ihn 10 Minuten lang auf einen Plattformschüttler, wobei die Deckblätter abgedeckt und im Dunkeln gehalten werden. Entfernen Sie PBST und waschen Sie die Bezugsscheine zweimal für insgesamt drei 10-minütige Waschgänge.Legen Sie einen Tropfen Montagemedien auf einen Objektträger. Montieren Sie die Abdeckungszelle mit der Seite nach unten, indem Sie den Abdeckungsschlicker langsam schräg auf das Montagemedium absenken, um Blasen zu vermeiden, und lassen Sie das Medium vor der Aufnahme absetzen. Bilden Sie schließlich die gefärbten Zellen ab und exportieren Sie sie als TIFF-Dateien.Die Neuralleistenzellen begannen innerhalb von drei bis vier Stunden nach der Inkubation aus adhärenten Neuralfaltenexplantaten zu schlüpfen, und die Migration war nach etwa 20 Stunden abgeschlossen. Die wandernden Neuralleistenzellen wurden mit HNK-1 markiert, und die meisten Zellen schienen HNK-1-positiv zu sein. Die migrierten Neuralleistenzellen wurden durch Färbung von filamentösem Aktin mit Phalloidin sichtbar gemacht.Bilder der Phalloidin-gefärbten Zellen wurden mit ImageJ verarbeitet, um ein Schwellenbild zu erzeugen, in dem Zellen schwarz mit weißem Hintergrund erschienen. Das Schwellenbild wurde analysiert und verschiedene Messungen in kontrastierenden Balkendiagrammen oder Geigendiagrammen dargestellt. Zum Beispiel betrug die durchschnittliche Fläche der 69 analysierten Zellen ungefähr 802,11 Quadratmikrometer, die von 60,27 bis 2.664,53 Quadratmikrometer reichten.Die Zirkularität spiegelt die Protrusivität der Zelle wider und reicht von 0,101 bis 0,875. Die niedrigeren Werte zeigen eine längliche Form an, während ein Wert von eins einen perfekten Kreis anzeigt. Die meisten Zellen zeigten eine längliche Form, die am leichtesten in der Geigenhandlung zu sehen ist.Wandernde Neuralleistenzellen in diesem Feld hatten ein durchschnittliches Seitenverhältnis von etwa 2,13, und ein Seitenverhältnis von eins zeigt eine symmetrische Form an. Sorgfältige Exzision und Explantierung sind entscheidend für erfolgreiche Kulturen. Lassen Sie die Neuralfalten 10 bis 15 Minuten lang mit der Seite nach unten abschneiden und übertragen Sie sie dann langsam in den Inkubator, um die Adhäsion zu fördern.Variationen dieser Techniken umfassen vorübergehende genetische Manipulation vor der Kultivierung und Zeitraffer-Bildgebung während der Inkubation. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll die Sammlung von primären und wandernden Neuralleistenzellpopulationen für die Analyse auf Omics-Ebene.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual-Kennzeichnung von neuralen Kammzellen und Blutgefäßen innerhalb von Hühnerembryonen mit ChickGFP Neural Tube Grafting und Carbocyanin Dye DiI Injektion

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Lieferung von<em&gt; In-vivo-</em&gt; Akuter intermittierender Hypoxie in Neonatal Nagetiere in den Prime Subventrikularzone abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellkulturen

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Vorwärts genetische Ansatz zur Stressresistenz-Gene in Mäuse Entdecken - Hochdurchsatz-Bildschirm in ES-Zellen

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Die Kultivierung humanen pluripotenten und Neurale Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für Grund- und Präklinische Forschung

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Gründung der proliferativen Tetraploid Zellen aus nicht-transformierten menschlichen Fibroblasten

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika-Virus-Infektion der kultivierten menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen für Immunocytochemical Analyse

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisierung der tangentialen Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...