Name: preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures
Uploaded: 2022-06-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

אנו מודים לקורין א. פיירצ'יילד וקייטי ל. ורמיליון, שהשתתפו בפיתוח הגרסה שלנו לפרוטוקול תרבית הקפל העצבי הגולגולתי של אפרוחים.

ניתן להשתמש בכל מגוון של גזעי גאלוס גאלוס , כולל לגהורן לבן, קישור מין זהוב או אדום רוד איילנד. ביצי התרנגולת ששימשו במחקר הנוכחי היו מגזעים שונים והתקבלו ממקורות רבים, כולל חוות מקומיות ומדגרות.
1. הכנת פתרונות וחומרים
<ol><li>הכן את הפתרון של רינגר על ידי ערבוב 123...

<ol>
	<li>Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+border:+Induction,+specification+and+maturation+of+the+territory+that+generates+neural+crest+cells.">The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells.</a> Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).</li><li>Tang, W., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+lineage+analysis:+From+past+to+future+trajectory.">Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory.</a> Development. 147 (20), (2021).</li><li>Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+different+migration+strategies+as+viewed+from+the+neural+crest.">Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+bulldoze+through+the+microenvironment+using+Aquaporin+1+to+stabilize+filopodia.">Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia.</a> Development. 147 (1), 185231 (2020).</li><li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+fragment+C3a+controls+mutual+cell+attraction+during+collective+cell+migration.">Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration.</a> Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).</li><li>Giovannone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slits+affect+the+timely+migration+of+neural+crest+cells+via+robo+receptor.">Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor.</a> Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).</li><li>Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+methylation+is+essential+for+neural+crest+migration.">Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration.</a> Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).</li><li>Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongator+Protein+3+(Elp3)+stabilizes+Snail1+and+regulates+neural+crest+migration+in+Xenopus.">Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Gonzalez Malagon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3+controls+migration+of+the+neural+crest+lineage+in+mouse+and+Xenopus.">Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).</li><li>Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+promotes+neural+crest+migration+via+yap/tead+signaling.">Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling.</a> Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).</li><li>Jacques-Fricke, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+NSD3-dependent+neural+crest+gene+expression+reveals+known+and+novel+candidate+regulatory+factors.">Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors.</a> Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).</li><li>Bronner-Fraser, M., Garc&#237;a-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+manipulations+of+neural+crest+cells+or+their+migratory+pathways.">Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways.</a> Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation.">Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).</li><li>Malagon, S. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+culture+and+analysis+of+primary+cranial+neural+crest+cells+from+mouse+for+the+study+of+neural+crest+cell+delamination+and+migration.">Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+delamination+and+migration:+From+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration.">Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).</li><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus.">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryological+and+genetic+manipulation+of+chick+development.">Embryological and genetic manipulation of chick development.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).</li><li>Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phalloidin+binding+site+of+F-actin.">The phalloidin binding site of F-actin.</a> The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).</li><li>Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+stages+of+trunk+neural+crest+migration+in+avian+embryos+using+monoclonal+antibody+HNK-1.">Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1.</a> Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations.">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations.</a> Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).</li><li>Haupt, A., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+their+own+shape+-+mechanisms+to+probe+cell+geometry+and+their+implications+in+cellular+organization+and+function.">How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li><li>Ezin, M., Fraser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+time-lapse+imaging+of+the+early+avian+embryo.">Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+live+imaging+of+avian+embryos.">In ovo live imaging of avian embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).</li><li>McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+neural+crest+cell+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+the+chick+embryo.">Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo.</a> Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).</li><li>Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+cranial+neural+crest+cells+release+extracellular+vesicles+that+are+critical+for+their+migration.">Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration.</a> Journal of Cell Science. , (2022).</li><li>Williams, R., Sauka-Spengler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+ovo+electroporation+of+early+chicken+embryos.">Ex ovo electroporation of early chicken embryos.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).</li><li>Moulton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+morpholinos+to+control+gene+expression.">Using morpholinos to control gene expression.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).</li><li>Gandhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-plasmid+approach+for+genome+editing+coupled+with+long-term+lineage+analysis+in+chick+embryos.">A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos.</a> Development. 148 (7), (2021).</li><li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+Global+Neural+Crest+Gene+Regulatory+Network+In+Vivo.">Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo.</a> Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).</li></ol>

הטכניקה המתוארת כאן מספקת שיטה ניתנת להתאמה של בידוד קפלים עצביים של אפרוחים וציפוי שלהם כדי ליצור תרבויות של NCCs גולגולתיים נודדים. תרביות אלה מספקות תנאים דו-ממדיים פשוטים לניתוח קל של נדידת NCC של אפרוחים ומורפולוגיה שיכולים להשלים מאתגרים יותר מבחינה טכנית בשיטות הדמיה של ovo <sup class=...

תאי פסגה עצביים (NCCs) הם אוכלוסיית תאים חולפת בעוברים בעלי חוליות. NCCs מוגדרים בגבולות הלוח העצבי ועוברים מעבר אפיתליאלי למזנכימלי (EMT) כדי לנדוד מהצינור העצבי הגבי1. לאחר EMT, NCCs מתפזרים באופן נרחב ברחבי העובר, ובסופו של דבר מבדילים ותורמים למבנים שונים, כולל השלד הקרניופציאלי, דרכי היציאה של הלב, ורוב מערכת העצבים ההיקפית2. שינויים בקוטביות התא, בשלד הציטוסקולרי ובתכונות ההידבקות עומדים בבסיס המעבר הזה מאוכלוסיית תאים נודדיםלאוכלוסיית תאים נודדים 3. חקר NCC EMT והגירה מספק תובנות על מנגנונים בסיסיים של תנועתיות תאים ומודיע על המאמצים למנוע ולטפל במומים מולדים וגרורות סרטניות.
בעוד שניתוח in vivo חיוני להבנת תהליכים התפתחותיים של NCC בהקשר עוברי, שיטות in vitro מציעות נגישות חזותית ופיזית המאפשרת אפיקים ניסיוניים נוספים. בסביבה דו-ממדית פשוטה, ניתן להעריך מורפולוגיה של NCC, מבנים ציטוסקטליים ומרחק שהועבר. יתר על כן, ניתן לנתח את ההשפעות של הפרעה גנטית או גורם מסיס על התנהגויות נודדות של NCCs תנועתיים 4,5,6,7,8,9,10. בנוסף, ניתן לאסוף, לאגד ולהשתמש ב-NCCs טרום-מבודדים או נודדים עבור מתודולוגיות בעלות תפוקה גבוהה כדי לחקור את הוויסות ההתפתחותי של NCCs באמצעות פרופילים פרוטאומיים, תעתיקיים ואפיגנומיים 7,11. בעוד שקיימות שיטות להכנת NCCs גולגולתיים מאורגניזמי מודל התפתחותיים שונים12,13,14, מאמר זה מדגים את המכניקה של הגישה עבור אלה שלומדים לראשונה לתרבית NCC גולגולתי מעוברי אפרוחים.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה רב-תכליתית להכנת תרביות NCC גולגולתיות של אפרוחים (איור 1). מאחר ש-NCCs נודדים בקלות מקפלים עצביים מושתלים אל מצע תרבית, NCCs של אפרוחים נפרדים באופן טבעי מרקמה עוברית, ותרביות ראשוניות נוצרות בקלות. כאשר NCCs של המוח האמצעי נודדים בהמוניהם מהקפלים העצביים הגולגולתיים (בניגוד לדלמינציה הממושכת, תא אחר תא, בתא המטען15), תרביות אלה מורכבות בעיקר מתאי צמרת עצבית גולגולתיים נודדים, כאשר כריתה ראשונית של קפל עצבי מספקת שיטת איסוף עבור NCCs קדם-מגרטוריים. מפורטת שיטה בסיסית לניתוח וגידול קפלים עצביים גולגולתיים של אפרוחים, ומוצעות הצעות ליישומים שונים ווריאציות על שיטה זו.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig01v2.jpg"> איור 1: סקירה סכמטית של פרוטוקול תרבית הקיפול העצבי הגולגולתי של אפרוחים. (A,B) קפלים עצביים גולגולתיים (מסומנים בכחול) נכרתים מעובר אפרוח עם חמישה סומיטים (מוצג במבט הגבי ב-A). פסים אפורים, סהר לבבי. (C) כאשר הם מצופים על פיברונקטין, תאי פסגה עצביים נודדים מגיחים מהקפלים העצביים ומתפזרים על המצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63799/63799fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber dishes (glass bottom, single or divided)</td>
			<td>MatTek; Cell Vis</td>
			<td>P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) 
			X000NOK1OJ (Cellvis)</td>
			<td>Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>633029, 633031, 633033, 633035, 633037</td>
			<td>circles, 0.13&#8211;0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Alternative for L15 media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Sportsman</td>
			<td>1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40008A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>grade 3MM chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (blunt)</td>
			<td>Fisher Scientific; Thomas Scientific</td>
			<td>08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td>Free image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold)</td>
			<td>Vector Laboratories; Thermofisher Scientific</td>
			<td>H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td>10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>VWR (or similar)</td>
			<td></td>
			<td>60 mm, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>multiple flurophores available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td>For tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (dissection)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td>35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>Variety of sources</td>
			<td></td>
			<td>0.01&#34; diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures

במהלך התפתחות בעלי חוליות, תאי פסגה עצביים (NCCs) נודדים באופן נרחב ומתמיינים לסוגי תאים שונים התורמים למבנים כמו השלד הקרניופציאלי ומערכת העצבים ההיקפית. בעוד שזה קריטי להבין את נדידת NCC בהקשר של עובר תלת-ממדי, בידוד תאים נודדים בתרבית דו-ממדית מקל על הדמיה ואפיון פונקציונלי, ומשלים מחקרים עובריים. הפרוטוקול הנוכחי מדגים שיטה לבידוד קפלים עצביים גולגולתיים של אפרוחים כדי ליצור תרביות NCC ראשוניות. NCCs נודדים מגיחים מתוך צמחי קפלים עצביים המצופים על מצע מצופה פיברונקטין. התוצאה היא אוכלוסיות NCC מפוזרות ודבקות שניתן להעריך על ידי כתמים וניתוחים מורפולוגיים כמותיים. גישה תרבותית פשוטה זו ניתנת להתאמה רבה וניתן לשלב אותה עם טכניקות אחרות. לדוגמה, הגירה של NCC והתנהגויות נדידה יכולות להיות מוערכות על ידי הדמיה בהילוך מהיר או על ידי שאילתה תפקודית על ידי הכללת מעכבים או מניפולציות ניסיוניות של ביטוי גנים (למשל, דנ"א, מורפולינו או אלקטרופורציה של קריספר). בגלל הרבגוניות שלה, שיטה זו מספקת מערכת רבת עוצמה לחקר התפתחות NCC גולגולתי.

סקירה כללית של הפרוטוקול הנוכחי מוצגת באיור 1. הביצים שהודגרו נפתחו, והחלמון, עם העובר על פני השטח, בודד על ידי מזיגה עדינה לתוך כף ידה של כפפות (איור 2A,B). לאחר פינוי האלבומין (איור 2C), מסגרות נייר סינון הוחלו על קרום החלמון המקיף את הע?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

פרוטוקול רב-תכליתי זה מתאר את הבידוד של תאי פסגה עצבית קדם-מיגרטיבית (NCCs) באמצעות כריתה של קפלים עצביים גולגולתיים מעוברי אפרוחים. עם הציפוי והדגירה, NCCs נודדים מגיחים מתוך קצוות עצביים, מה שמאפשר הערכה של מורפולוגיה של תאים ונדידה בסביבה דו-ממדית פשוטה.

הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי צמרת עצביים גולגולתיים של אפרוחים

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

תאי פסגה עצבית מהגרים מקפלים עצביים גולגולתיים בעוברים או כאשר הם ממוקמים בתרבית. זה מספק שיטה נוחה לבודד תאי עצב נודדים ראשוניים ללא דיסוציאציה של תאים. בעוד שנדידת פסגה עצבית מתרחשת בדרך כלל בתוך הסביבה העוברית התלת-ממדית, התרבות הדו-ממדית מאפשרת הדמיה וחקירה של תהליכים הקשורים להגירה.למרות שקיימים פרוטוקולים של תרבית קיפול עצבי גולגולתי, שיטה זו דורשת אימון וצעדים ספציפיים לאורגניזם. סרטון זה מדגים טכניקות כדי להקל על הכנה ניתנת לשחזור של תרביות קפל עצבי גולגולתי אפרוח. מתחילים מתקשים לעתים קרובות לנתח ולצפות קפלים עצביים ולהעריך את תוצאות התרבות.מעקב אחר הנחיות ההסרה ויישום הניתוח המורפומטרי המתואר כאן מאפשר קבלת תוצאות כמותיות עקביות. כדי להתחיל, מניחים את הביציות המופרות במצב זקוף בתוך אינקובטור לח ב 38 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הביצים מהאינקובטור, חטאו את הקליפות על ידי ריסוס יסודי של 70% אתנול ותנו להן להתייבש.לתיקון והכתמה של התרביות, השתמשו בתלושי כיסוי זכוכית שהוכנסו לצלחת תרבית רקמה מרובת בארות, ופיפטה מספקת תמיסת פיברונקטין כדי לכסות את תחתית הבאר. לאחר מכן, החלף את המכסה, ודגר את הצלחת בתמיסת פיברונקטין באינקובטור לח בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות תוך ניתוח קפלים עצביים. השתמשו במלקחיים קהים כדי לתקוע חור קטן בקליפה ב-1/4 עד 1/3 מאורך הביצה.מכניסים בזהירות את המלקחיים הקהים לתוך החור הקטן, ומבטיחים לא להפריע לחלמון. לאחר מכן, חותכים את קליפת הביצה סביב הביצה, מסירים את החלק העליון של קליפת הביצה, ומניחים את העובר לבידוד. הכינו את העובר על ידי שימוש עדין בקצה השטוח של מלקחיים קהים סגורים כדי לנגב כל עודף אלבומין על פני החלמון המכסה את העובר.השתמש במלקחיים כדי למקם מסגרת תמיכה בנייר סינון מעל העובר, כאשר העובר נמצא בחלון המסגרת. לחצו בעדינות על נייר הסינון כדי להיצמד לחלמון. גזור מסביב לחלק החיצוני של מסגרת נייר הסינון באמצעות מספריים לנתיחה.השתמשו במלקחיים או בקצות מספריים כדי לתפוס את קצה המסגרת, והרימו בעדינות את העובר הרחק מהחלמון. מניחים את העובר עם מסגרת הנייר כלפי מטה לתוך צלחת פטרי של 60 או 100 מיליליטר מלאה ברינגר עם עט-סטרפ. שמור את צלחת העוברים על קרח אם אתה אוסף אותם עבור RNA או יישום רגיש לחלבון במורד הזרם.העבירו את העובר לכלי נקי המכיל את תמיסת העט-סטרפ של רינגר. סובבו בעדינות את העובר קדימה ואחורה כדי לפנות כל חלמון שמטשטש את הנוף, והחליפו את תמיסת העט-סטרפ של הצלצול או העבירו אותו לצלחת טרייה אם הוא נעשה מעונן. מקמו את גב העובר ושלד את צד העובר כלפי מעלה תחת מיקרוסקופ גזירה.השאירו את העובר על מסגרת הנייר כדי לשמור עליו מתוח ומוחזק במקומו. לאחר מכן, להסיר את קרום vitelline, באמצעות מלקחיים כדי לחשוף את הקפלים העצביים. כוללים רקמת caudal לשלפוחית האופטית מתרחבת ו rostral למוח האחורי, שם התכווצויות rhombomere רק מתחילים להופיע.באמצעות מספריים קפיץ, בזהירות את הקפלים העצביים של המוח האמצעי. הקפידו לכרות את ההיבט הגבי ביותר של הקפל העצבי עם זיהום מינימלי של הצינור העצבי והאקטודרם הלא-עצבי, והעבירו את הקפלים העצביים לצלחת נקייה המכילה את תמיסת העט-סטרפ של רינגר באמצעות פיפטור P20 או פיפטה מזכוכית סטרילית של פסטר שטופה בתמיסת העט-סטרפ של יולקי רינגר. יש לאחסן קפלים שנאספו על קרח תוך ניתוח קפלים נוספים.לאחר הסרת צלחת התרבית מהאינקובטור, השתמש פיפטור או פיפטה פסטר כדי להסיר את תמיסת הפיברונקטין מכיסוי, צלחת או באר. לאחר שטיפת המצע המצופה פיברונקטין בתמיסת העט-סטרפ של רינגר, הוסיפו נפח מתאים של מדיה תרבותית שלמה למנה או באר. כדי לחסום את הפלסטיק ולמנוע את הידבקות הרקמה, השתמשו בפיפטטור P20 או P200, ושטפו את קצה הפיפטה בתמיסת העט-סטרפ של יולקי רינגר.לאחר מכן, העבירו את הקפלים העצביים המבודדים לכיוון מרכז הכיסוי המצופה בפיברונקטין, תוך הקפדה על העברת תמיסת העט-סטרפ הקטנה ככל האפשר של רינגר. לאחר שאפשרו לצמחים להסתפק במשך 10 עד 15 דקות, הכניסו אותם לתא לח בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס על ידי נשיאה איטית וזהירה של צלחת התרבית עם קפלים עצביים מצופים. הסר את מדיה התרבות עם פיפטה פסטר, ולשטוף את הבארות עם PBS מעוקר מסנן.יש להוסיף 4% פרפורמלדהיד ולשמור על שייקר פלטפורמה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, להסיר paraformaldehyde, לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם PBS, ולהוסיף PBST המכיל 5% סרום. כעת, פיפטה 30 מיקרוליטרים של 200-ננומולר אורגון גרין הצמידו פלואידין על משטח חלק לכל החלקה על הכיסוי.באמצעות זוג מלקחיים, הסר את החלקת הכיסוי מה- PBST המכיל 5% סרום, וודא את כיוון התאים הפונים כלפי מעלה. יש לפתות את עודפי הנוזלים על ידי נגיעה קצרה בקצה הכיסוי למגב משימה עדין. מניחים בעדינות כל מכסה את צד תא ההחלקה כלפי מטה על טיפת הפלואידין המדולל, ודוגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר תקופת הדגירה, הרימו את תמיסת הכיסוי מתמיסת הכתמים והחזירו אותה לצלחת התרבית, תוך הפיכתה כך שצד התא יהיה למעלה. הקפידו לכסות את הכיסוי ב-PBST, והניחו אותו על שייקר פלטפורמה למשך 10 דקות, תוך שמירה על כיסוי מכוסה ובחושך. יש להסיר PBST, ולחזור על שטיפת המכסה פעמיים למשך שלוש כביסות בנות 10 דקות בסך הכל.הנח טיפה אחת של מדיית הרכבה על שקופית מיקרוסקופ. הרכב את צד תא ההחלקה של הכיסוי כלפי מטה על-ידי הנמכה איטית של ההחלקה בזווית על מדיית ההרכבה כדי למנוע יצירת בועות, ואפשר למדיה לשקוע לפני ההדמיה. לבסוף, דמיין את התאים המוכתמים וייצא אותם כקבצי TIFF.תאי הצמרת העצבית החלו להגיח מתוך הקפל העצבי הדביק תוך שלוש עד ארבע שעות מהדגירה, והנדידה הושלמה לאחר כ-20 שעות. תאי הצמרת העצבית הנודדת סומנו באמצעות HNK-1, ונראה כי רוב התאים היו חיוביים ל-HNK-1. תאי הצמרת העצבית הנודדים הודגמו על ידי צביעת אקטין נימה בפלואידין.תמונות של התאים המוכתמים בפלואידין עובדו באמצעות ImageJ כדי לייצר תמונת סף שבה התאים נראו שחורים עם רקע לבן. תמונת הסף נותחה ומדידות שונות הוצגו בגרפים של עמודות מנוגדות או בעלילות כינור. לדוגמה, השטח הממוצע של 69 התאים שנותחו היה כ-802.11 מיקרומטרים רבועים, שנעו בין 60.27 ל-2, 664.53 מיקרומטרים רבועים.המעגליות משקפת את בליטות התא ונעה בין 0.101 ל-0.875. הערכים הנמוכים יותר מציינים צורה מוארכת, בעוד שערך של אחד מציין עיגול מושלם. רוב התאים הציגו צורה מוארכת, שנראית הכי בקלות בעלילת הכינור.לתאי הצמרת העצבית הנודדת בשדה זה היה יחס גובה-רוחב ממוצע של כ-2.13, ויחס גובה-רוחב של אחד מהם מציין צורה סימטרית. כריתה זהירה וציפוי צמחים הם חיוניים לתרבויות מוצלחות. אפשרו לקפלים העצביים לשקוע בצד למשך 10 עד 15 דקות, ולאחר מכן עברו באיטיות לאינקובטור כדי לעודד הידבקות.וריאציות על טכניקות אלה כוללות מניפולציה גנטית חולפת לפני ההתרבות והדמיית קיטועי זמן במהלך הדגירה. בנוסף, פרוטוקול זה מאפשר איסוף של אוכלוסיות תאי צמרת עצבית קדם-מיגרטורית ונודדת לצורך ניתוח ברמת אומיקה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

תיוג כפול של תאי ציצה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות שתל צינור עצביGFP אפרוח והזרקת צבע DiI Carbocyanine

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

משלוח<em&gt; In vivo</em&gt; חריפה לסירוגין היפוקסיה בילוד מכרסמים לתא תרבויות עצבית אב נגזרות אזור ראש Subventricular

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

גישה גנטית קדימה ללחשוף גני התנגדות מתח בעכברים - מסך תפוקה גבוהה בתאי גזע עובריים

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

זיהום בנגיף Zika של תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי בתרבית לניתוח Immunocytochemical

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...