Name: preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures
Uploaded: 2022-06-27T13:30:00
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Ringraziamo Corinne A. Fairchild e Katie L. Vermillion, che hanno partecipato allo sviluppo della nostra versione del protocollo di coltura della piega neurale cranica del pulcino.

È possibile utilizzare qualsiasi varietà di razze Gallus gallus , tra cui White Leghorn, Golden Sex Link o Rhode Island Red. Le uova di gallina utilizzate nel presente studio erano di varie razze e ottenute da molteplici fonti, tra cui allevamenti e vivai locali.
1. Preparazione di soluzioni e materiali
<ol><li>Preparare la soluzione di Ringer miscelando 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl 2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na 2 HPO 4 e 0,147 mM KH2PO4</s...

<ol>
	<li>Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+border:+Induction,+specification+and+maturation+of+the+territory+that+generates+neural+crest+cells.">The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells.</a> Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).</li><li>Tang, W., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+lineage+analysis:+From+past+to+future+trajectory.">Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory.</a> Development. 147 (20), (2021).</li><li>Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+different+migration+strategies+as+viewed+from+the+neural+crest.">Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+bulldoze+through+the+microenvironment+using+Aquaporin+1+to+stabilize+filopodia.">Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia.</a> Development. 147 (1), 185231 (2020).</li><li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+fragment+C3a+controls+mutual+cell+attraction+during+collective+cell+migration.">Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration.</a> Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).</li><li>Giovannone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slits+affect+the+timely+migration+of+neural+crest+cells+via+robo+receptor.">Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor.</a> Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).</li><li>Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+methylation+is+essential+for+neural+crest+migration.">Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration.</a> Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).</li><li>Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongator+Protein+3+(Elp3)+stabilizes+Snail1+and+regulates+neural+crest+migration+in+Xenopus.">Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Gonzalez Malagon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3+controls+migration+of+the+neural+crest+lineage+in+mouse+and+Xenopus.">Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).</li><li>Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+promotes+neural+crest+migration+via+yap/tead+signaling.">Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling.</a> Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).</li><li>Jacques-Fricke, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+NSD3-dependent+neural+crest+gene+expression+reveals+known+and+novel+candidate+regulatory+factors.">Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors.</a> Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).</li><li>Bronner-Fraser, M., Garc&#237;a-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+manipulations+of+neural+crest+cells+or+their+migratory+pathways.">Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways.</a> Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation.">Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).</li><li>Malagon, S. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+culture+and+analysis+of+primary+cranial+neural+crest+cells+from+mouse+for+the+study+of+neural+crest+cell+delamination+and+migration.">Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+delamination+and+migration:+From+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration.">Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).</li><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus.">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryological+and+genetic+manipulation+of+chick+development.">Embryological and genetic manipulation of chick development.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).</li><li>Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phalloidin+binding+site+of+F-actin.">The phalloidin binding site of F-actin.</a> The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).</li><li>Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+stages+of+trunk+neural+crest+migration+in+avian+embryos+using+monoclonal+antibody+HNK-1.">Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1.</a> Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations.">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations.</a> Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).</li><li>Haupt, A., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+their+own+shape+-+mechanisms+to+probe+cell+geometry+and+their+implications+in+cellular+organization+and+function.">How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li><li>Ezin, M., Fraser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+time-lapse+imaging+of+the+early+avian+embryo.">Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+live+imaging+of+avian+embryos.">In ovo live imaging of avian embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).</li><li>McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+neural+crest+cell+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+the+chick+embryo.">Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo.</a> Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).</li><li>Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+cranial+neural+crest+cells+release+extracellular+vesicles+that+are+critical+for+their+migration.">Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration.</a> Journal of Cell Science. , (2022).</li><li>Williams, R., Sauka-Spengler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+ovo+electroporation+of+early+chicken+embryos.">Ex ovo electroporation of early chicken embryos.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).</li><li>Moulton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+morpholinos+to+control+gene+expression.">Using morpholinos to control gene expression.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).</li><li>Gandhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-plasmid+approach+for+genome+editing+coupled+with+long-term+lineage+analysis+in+chick+embryos.">A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos.</a> Development. 148 (7), (2021).</li><li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+Global+Neural+Crest+Gene+Regulatory+Network+In+Vivo.">Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo.</a> Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).</li></ol>

La tecnica qui descritta fornisce un metodo adattabile per isolare le pieghe neurali dei pulcini e placcarle per creare colture di NCC cranici migratori. Queste colture forniscono condizioni 2D semplificate per una facile analisi della migrazione e della morfologia NCC del pulcino che possono integrare metodi di imaging più tecnicamente impegnativi in ovo 24,25,26. Mentre questo metodo in vitro è relativament...

Le cellule della cresta neurale (NCC) sono una popolazione di cellule transitorie negli embrioni vertebrati. Le NCC sono specificate ai bordi della piastra neurale e subiscono una transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) per migrare dal tubo neurale dorsale1. Dopo l'EMT, le NCC si disperdono ampiamente in tutto l'embrione, differenziandosi e contribuendo a varie strutture, tra cui lo scheletro craniofacciale, il tratto di deflusso del cuore e la maggior parte del sistema nervoso periferico2. I cambiamenti nella polarità cellulare, nel citoscheletro e nelle proprietà di adesione sono alla base di questo passaggio da una popolazione cellulare preliminaria a una popolazione di cellule migratorie3. Lo studio dell'EMT e della migrazione NCC fornisce approfondimenti sui meccanismi fondamentali della motilità cellulare e informa gli sforzi per prevenire e curare i difetti alla nascita e le metastasi del cancro.
Mentre l'analisi in vivo è vitale per comprendere i processi di sviluppo NCC in un contesto embrionale, i metodi in vitro offrono accessibilità visiva e fisica che facilitano ulteriori vie sperimentali. In un ambiente 2D semplificato, è possibile valutare la morfologia NCC, le strutture citoscheletriche e la distanza migrata. Inoltre, gli effetti della perturbazione genetica o solubile dei fattori sui comportamenti migratori delle NCC mobili possono essere analizzati 4,5,6,7,8,9,10. Inoltre, NCC premigratory o migratorie isolate possono essere raccolte, raggruppate e utilizzate per metodologie ad alto rendimento per studiare la regolazione dello sviluppo delle NCC attraverso profili proteomici, trascrittomici ed epigenomici 7,11. Mentre sono disponibili metodi per la preparazione di NCC cranici da vari organismi modello di sviluppo12,13,14, questo articolo dimostra la meccanica dell'approccio per coloro che imparano per la prima volta a coltivare NCC cranici da embrioni di pulcino.
L'attuale protocollo descrive una tecnica versatile per la preparazione di colture di NCC craniche di pulcino (Figura 1). Poiché gli NCC migrano facilmente dalle pieghe neurali espiantate su un substrato di coltura, gli NCC di pulcino si separano naturalmente dal tessuto embrionale e le colture primarie sono facilmente generate. Poiché le NCC del mesencefalo migrano in massa dalle pieghe neurali craniche (in contrasto con la delaminazione prolungata, cellula per cellula nel tronco15), queste colture consistono principalmente di cellule migratorie della cresta neurale cranica, con l'escissione iniziale della piega neurale che fornisce un metodo di raccolta per le NCC premigatorie. Viene dettagliato un metodo di base per sezionare e coltivare le pieghe neurali craniche dei pulcini e vengono offerti suggerimenti per diverse applicazioni e variazioni di questo metodo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig01v2.jpg"> Figura 1: Panoramica schematica del protocollo di coltura neurale cranica del pulcino. (A,B) Le pieghe neurali craniche (delineate in blu) sono asportate da un embrione di pulcino con cinque somiti (mostrati in vista dorsale in A). Bande grigie, mezzaluna cardiaca. (C) Quando placcate sulla fibronectina, le cellule della cresta neurale migratoria emergono dalle pieghe neurali e si disperdono sul substrato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63799/63799fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber dishes (glass bottom, single or divided)</td>
			<td>MatTek; Cell Vis</td>
			<td>P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) 
			X000NOK1OJ (Cellvis)</td>
			<td>Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>633029, 633031, 633033, 633035, 633037</td>
			<td>circles, 0.13&#8211;0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Alternative for L15 media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Sportsman</td>
			<td>1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40008A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>grade 3MM chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (blunt)</td>
			<td>Fisher Scientific; Thomas Scientific</td>
			<td>08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td>Free image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold)</td>
			<td>Vector Laboratories; Thermofisher Scientific</td>
			<td>H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td>10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>VWR (or similar)</td>
			<td></td>
			<td>60 mm, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>multiple flurophores available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td>For tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (dissection)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td>35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>Variety of sources</td>
			<td></td>
			<td>0.01&#34; diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures

Durante lo sviluppo dei vertebrati, le cellule della cresta neurale (NCC) migrano ampiamente e si differenziano in vari tipi di cellule che contribuiscono a strutture come lo scheletro craniofacciale e il sistema nervoso periferico. Mentre è fondamentale comprendere la migrazione NCC nel contesto di un embrione 3D, l'isolamento delle cellule migratorie in coltura 2D facilita la visualizzazione e la caratterizzazione funzionale, integrando gli studi embrionali. Il presente protocollo dimostra un metodo per isolare le pieghe neurali craniche dei pulcini per generare colture NCC primarie. Gli NCC migratori emergono da espianti di piega neurale placcati su un substrato rivestito di fibronectina. Ciò si traduce in popolazioni NCC disperse e aderenti che possono essere valutate mediante colorazione e analisi morfologiche quantitative. Questo approccio culturale semplificato è altamente adattabile e può essere combinato con altre tecniche. Ad esempio, l'emigrazione NCC e i comportamenti migratori possono essere valutati mediante imaging time-lapse o interrogati funzionalmente includendo inibitori o manipolazioni sperimentali dell'espressione genica (ad esempio, DNA, morfolino o elettroporazione CRISPR). Grazie alla sua versatilità, questo metodo fornisce un potente sistema per studiare lo sviluppo di NCC cranici.

Una panoramica del presente protocollo è mostrata nella Figura 1. Le uova incubate sono state aperte e il tuorlo, con l'embrione in superficie, è stato isolato versando delicatamente nel palmo di una mano guantata (Figura 2A,B). Dopo aver eliminato l'albumina (Figura 2C), sono stati applicati telai di carta da filtro sulla membrana del tuorlo che circonda l'embrione per facilitare il taglio e il sollevamento dell'...

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Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Questo protocollo versatile descrive l'isolamento delle cellule della cresta neurale premigratoria (NCC) attraverso l'escissione di pieghe neurali craniche da embrioni di pulcino. Dopo la placcatura e l'incubazione, gli NCC migratori emergono dagli espianti di piega neurale, consentendo la valutazione della morfologia cellulare e della migrazione in un ambiente 2D semplificato.

Preparazione e analisi morfologica di colture cellulari di cresta neurale cranica di pulcino

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Le cellule della cresta neurale emigrano dalle pieghe neurali craniche negli embrioni o quando vengono poste in coltura. Ciò fornisce un metodo conveniente per isolare le cellule primarie della cresta neurale migratoria senza dissociazione cellulare. Mentre la migrazione della cresta neurale avviene tipicamente all'interno dell'ambiente embrionale tridimensionale, la cultura bidimensionale consente la visualizzazione e l'indagine dei processi correlati alla migrazione.Sebbene esistano protocolli di coltura della piega neurale cranica, questo metodo richiede un allenamento e passaggi specifici dell'organismo. Questo video dimostra le tecniche per facilitare la preparazione riproducibile delle colture di pieghe neurali craniche di pulcino. I principianti spesso lottano con la dissezione e la placcatura delle pieghe neurali e la valutazione dei risultati della cultura.Seguire le linee guida di dissezione e applicare l'analisi morfometrica qui descritta consente di ottenere risultati quantitativi coerenti. Per iniziare, posizionare le uova fecondate in posizione verticale all'interno di un'incubatrice umidificata a 38 gradi Celsius. Dopo aver rimosso le uova dall'incubatrice, disinfettare i gusci spruzzando accuratamente il 70% di etanolo e lasciandoli asciugare.Per fissare e colorare le colture, utilizzare vetrini di copertura collocati in un piatto di coltura di tessuto multi-pozzetto e pipettare una soluzione sufficiente di fibronectina per coprire il fondo del pozzetto. Quindi, sostituire il coperchio e incubare la piastra con una soluzione di fibronectina in un incubatore umidificato a 38 gradi Celsius per almeno un'ora mentre si sezionano le pieghe neurali. Usa una pinza smussata per praticare un piccolo foro nel guscio da 1/4 a 1/3 della lunghezza dell'uovo.Inserire con attenzione le pinze smussate nel piccolo foro, assicurandosi di non interrompere il tuorlo. Quindi, tagliare il guscio d'uovo intorno all'uovo, rimuovere la parte superiore del guscio d'uovo e posizionare l'embrione per l'isolamento. Preparare l'embrione usando delicatamente il bordo piatto di una pinza smussata chiusa per rimuovere l'albumina in eccesso sulla superficie del tuorlo che copre l'embrione.Utilizzare una pinza per posizionare una cornice di supporto in carta da filtro sopra l'embrione, con l'embrione nella finestra del telaio. Premere delicatamente sulla carta da filtro per aderire al tuorlo. Tagliare intorno all'esterno del telaio della carta da filtro con le forbici da dissezione.Usa una pinza o punte a forbice per afferrare il bordo del telaio e sollevare delicatamente l'embrione dal tuorlo. Posizionare l'embrione con il telaio di carta rivolto verso il basso in una capsula di Petri da 60 o 100 millilitri riempita con Ringer con streptococco a penna. Tenere il piatto di embrioni sul ghiaccio se li si raccoglie per un'applicazione a valle sensibile all'RNA o alle proteine.Trasferire un embrione in un piatto pulito contenente la soluzione di streptococco di Ringer. Versare delicatamente l'embrione avanti e indietro per eliminare qualsiasi tuorlo che oscura la vista e scambiare la soluzione di streptococco di penna del Ringer o trasferirlo in un piatto fresco se diventa torbido. Posizionare l'embrione dorsale e inquadrare il lato verso l'alto sotto un microscopio da dissezione.Lasciare l'embrione sul telaio di carta per tenerlo allungato e tenuto in posizione. Quindi, rimuovere la membrana vitellina, usando una pinza per esporre le pieghe neurali. Includere il tessuto caudale alle vescicole ottiche in espansione e rostrale al cervello posteriore, dove le costrizioni rombomeriche stanno appena iniziando a comparire.Usando le forbici a molla, asportare accuratamente le pieghe neurali del mesencefalo. Fare attenzione ad asportare l'aspetto più dorsale della piega neurale con una contaminazione minima del tubo neurale e dell'ectoderma non neurale e trasferire le pieghe neurali in un piatto pulito contenente la soluzione di streptococco a penna di Ringer usando un pipettor P20 o una pipetta Pasteur di vetro sterile risciacquata con la soluzione di penna streptococco di Ringer tuorla. Conservare le pieghe raccolte sul ghiaccio mentre si sezionano ulteriori pieghe.Dopo aver rimosso il piatto di coltura dall'incubatore, utilizzare un pipettor o una pipetta Pasteur per rimuovere la soluzione di fibronectina dai vetrini di copertura, dal piatto o dal pozzetto. Dopo aver risciacquato il substrato rivestito di fibronectina con la soluzione di streptococco a penna di Ringer, aggiungere un volume appropriato di terreno di coltura completo al piatto o al pozzetto. Per bloccare la plastica e impedire che il tessuto si attacchi, utilizzare un pipettatore P20 o P200 e sciacquare la punta della pipetta con la soluzione di streptococco a penna di Yolky Ringer.Quindi, trasferire le pieghe neurali isolate verso il centro del vetrino di copertura rivestito di fibronectina, avendo cura di trasferire il meno possibile la soluzione di streptococco di Ringer. Dopo aver lasciato che gli espianti si depositino per 10-15 minuti, metterli in una camera umidificata a 38 gradi Celsius trasportando lentamente e con attenzione il piatto di coltura con pieghe neurali placcate. Rimuovere i terreni di coltura con una pipetta Pasteur e sciacquare i pozzetti con PBS sterilizzato con filtro.Aggiungere il 4% di paraformaldeide e tenerlo su uno shaker a piattaforma per 15 minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, rimuovere la paraformaldeide, sciacquare i pozzetti tre volte con PBS e aggiungere PBST contenente il 5% di siero. Ora, pipettare 30 microlitri di falloidina coniugata Oregon Green da 200 nanomolari su una superficie liscia per ogni vetrino di copertura.Utilizzando un paio di pinze, rimuovere il vetrino di copertura dal PBST contenente il 5% di siero, assicurando l'orientamento delle cellule rivolte verso l'alto. Elimina il liquido in eccesso toccando brevemente il bordo del coperchio su un delicato tergicristallo. Posizionare delicatamente ogni lato della cellula di copertura verso il basso sulla goccia di falloidina diluita e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.Dopo il periodo di incubazione, sollevare il vetrino di copertura dalla soluzione colorante e rimetterlo nel piatto di coltura, capovolgendolo in modo che il lato cellulare sia verso l'alto. Assicurarsi di coprire il vetrino di copertura con PBST e posizionarlo su uno shaker a piattaforma per 10 minuti, mantenendo i vetrini di copertura coperti e al buio. Rimuovere il PBST e ripetere il lavaggio del coperchio due volte per un totale di tre lavaggi di 10 minuti.Posizionare una goccia di supporto di montaggio su un vetrino da microscopio. Montare la cella di slittamento del coperchio con il lato rivolto verso il basso abbassando lentamente la linguetta del coperchio ad angolo sul supporto di montaggio per evitare di creare bolle e consentire al supporto di impostare prima dell'imaging. Infine, immaginate le celle colorate ed esportatele come file TIFF.Le cellule della cresta neurale hanno iniziato ad emergere dagli espianti di piega neurale aderente entro tre o quattro ore dall'incubazione e la migrazione è stata completata dopo circa 20 ore. Le cellule della cresta neurale migratoria sono state etichettate utilizzando HNK-1 e la maggior parte delle cellule sembrava essere HNK-1 positiva. Le cellule della cresta neurale migrate sono state visualizzate colorando l'actina filamentosa con la falloidina.Le immagini delle cellule colorate con falloidina sono state elaborate utilizzando ImageJ per produrre un'immagine di soglia in cui le cellule apparivano nere con uno sfondo bianco. L'immagine della soglia è stata analizzata e varie misurazioni visualizzate in grafici a barre contrastanti o grafici di violino. Ad esempio, l'area media delle 69 cellule analizzate era di circa 802,11 micrometri quadrati, che vanno da 60,27 a 2.664,53 micrometri quadrati.La circolarità riflette la protrusività della cellula e varia da 0,101 a 0,875. I valori più bassi indicano una forma allungata, mentre un valore di uno indica un cerchio perfetto. La maggior parte delle celle mostrava una forma allungata, che è più facilmente visibile nella trama del violino.Le cellule della cresta neurale migratoria in questo campo avevano un rapporto di aspetto medio di circa 2,13 e un rapporto di aspetto di uno indica una forma simmetrica. Un'attenta escissione e placcatura espiantata sono fondamentali per colture di successo. Lasciare che le pieghe neurali si depositino con il lato tagliato verso il basso per 10-15 minuti, quindi trasferirsi lentamente nell'incubatore per incoraggiare l'adesione.Le variazioni di queste tecniche includono la manipolazione genetica transitoria prima della coltura e l'imaging time-lapse durante l'incubazione. Inoltre, questo protocollo consente la raccolta di popolazioni di cellule della cresta neurale premigratory e migratorie per l'analisi a livello omico.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

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