Name: preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures
Uploaded: 2022-06-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

Vi takker Corinne A. Fairchild og Katie L. Vermillion, som deltok i utviklingen av vår versjon av chick cranial neural fold culture protocol.

Ethvert utvalg av Gallus gallus raser kan brukes, inkludert White Leghorn, Golden Sex Link eller Rhode Island Red. Kyllingeggene som ble brukt i denne studien var av forskjellige raser og hentet fra flere kilder, inkludert lokale gårder og klekkerier.
1. Fremstilling av løsninger og materialer
<ol><li>Forbered Ringers løsning ved å blande 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl 2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na 2 HPO 4 og 0,147mM KH2 PO4</sub...

<ol>
	<li>Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+border:+Induction,+specification+and+maturation+of+the+territory+that+generates+neural+crest+cells.">The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells.</a> Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).</li><li>Tang, W., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+lineage+analysis:+From+past+to+future+trajectory.">Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory.</a> Development. 147 (20), (2021).</li><li>Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+different+migration+strategies+as+viewed+from+the+neural+crest.">Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+bulldoze+through+the+microenvironment+using+Aquaporin+1+to+stabilize+filopodia.">Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia.</a> Development. 147 (1), 185231 (2020).</li><li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+fragment+C3a+controls+mutual+cell+attraction+during+collective+cell+migration.">Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration.</a> Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).</li><li>Giovannone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slits+affect+the+timely+migration+of+neural+crest+cells+via+robo+receptor.">Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor.</a> Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).</li><li>Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+methylation+is+essential+for+neural+crest+migration.">Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration.</a> Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).</li><li>Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongator+Protein+3+(Elp3)+stabilizes+Snail1+and+regulates+neural+crest+migration+in+Xenopus.">Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Gonzalez Malagon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3+controls+migration+of+the+neural+crest+lineage+in+mouse+and+Xenopus.">Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).</li><li>Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+promotes+neural+crest+migration+via+yap/tead+signaling.">Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling.</a> Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).</li><li>Jacques-Fricke, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+NSD3-dependent+neural+crest+gene+expression+reveals+known+and+novel+candidate+regulatory+factors.">Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors.</a> Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).</li><li>Bronner-Fraser, M., Garc&#237;a-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+manipulations+of+neural+crest+cells+or+their+migratory+pathways.">Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways.</a> Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation.">Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).</li><li>Malagon, S. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+culture+and+analysis+of+primary+cranial+neural+crest+cells+from+mouse+for+the+study+of+neural+crest+cell+delamination+and+migration.">Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+delamination+and+migration:+From+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration.">Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).</li><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus.">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryological+and+genetic+manipulation+of+chick+development.">Embryological and genetic manipulation of chick development.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).</li><li>Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phalloidin+binding+site+of+F-actin.">The phalloidin binding site of F-actin.</a> The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).</li><li>Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+stages+of+trunk+neural+crest+migration+in+avian+embryos+using+monoclonal+antibody+HNK-1.">Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1.</a> Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations.">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations.</a> Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).</li><li>Haupt, A., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+their+own+shape+-+mechanisms+to+probe+cell+geometry+and+their+implications+in+cellular+organization+and+function.">How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li><li>Ezin, M., Fraser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+time-lapse+imaging+of+the+early+avian+embryo.">Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+live+imaging+of+avian+embryos.">In ovo live imaging of avian embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).</li><li>McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+neural+crest+cell+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+the+chick+embryo.">Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo.</a> Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).</li><li>Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+cranial+neural+crest+cells+release+extracellular+vesicles+that+are+critical+for+their+migration.">Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration.</a> Journal of Cell Science. , (2022).</li><li>Williams, R., Sauka-Spengler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+ovo+electroporation+of+early+chicken+embryos.">Ex ovo electroporation of early chicken embryos.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).</li><li>Moulton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+morpholinos+to+control+gene+expression.">Using morpholinos to control gene expression.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).</li><li>Gandhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-plasmid+approach+for+genome+editing+coupled+with+long-term+lineage+analysis+in+chick+embryos.">A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos.</a> Development. 148 (7), (2021).</li><li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+Global+Neural+Crest+Gene+Regulatory+Network+In+Vivo.">Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo.</a> Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).</li></ol>

Teknikken beskrevet her gir en tilpasningsdyktig metode for å isolere kyllingnevrale folder og plating dem for å skape kulturer av migrerende kraniale NCCer. Disse kulturene gir forenklede 2D-forhold for enkel analyse av kylling NCC-migrasjon og morfologi som kan supplere mer teknisk utfordrende i ovo-bildebehandlingsmetoder24,25,26. Selv om denne in vitro-metoden er relativt enkel, er konsistente resultater ...

Nevrale kamceller (NCC) er en forbigående cellepopulasjon i virveldyrembryoer. NCC er spesifisert ved grensen til nevrale platen og gjennomgår en epithelial-til-mesenkymal overgang (EMT) for å migrere fra dorsal nevralerøret 1. Etter EMT sprer NCC seg mye gjennom hele embryoet, og differensierer og bidrar til ulike strukturer, inkludert kraniofacialskjelettet, utstrømningskanalen i hjertet og flertallet av det perifere nervesystemet2. Endringer i cellepolaritet, cytoskjelettet og adhesjonsegenskaper ligger under dette skiftet fra en premigratorisk til en migrerende cellepopulasjon3. Studier av NCC EMT og migrasjon gir innsikt i grunnleggende mekanismer for cellemotilitet og informerer innsats for å forebygge og behandle fødselsskader og kreftmetastase.
Mens in vivo-analyse er avgjørende for å forstå NCCs utviklingsprosesser i en embryonal kontekst, tilbyr in vitro-metoder visuell og fysisk tilgjengelighet som letter ytterligere eksperimentelle veier. I et forenklet 2D-miljø kan NCC-morfologi, cytoskeletale strukturer og avstand migreres evalueres. Videre kan effekten av genetisk eller løselig faktorforstyrrelse på migrerende oppførsel av motile NCC analyseres 4,5,6,7,8,9,10. I tillegg kan isolerte premigratoriske eller migrerende NCC-er samles inn, samles sammen og brukes til metoder med høy gjennomstrømning for å studere utviklingsreguleringen av NCC gjennom proteomisk, transkriptomisk og epigenomisk profilering 7,11. Mens metoder er tilgjengelige for å forberede kraniale NCCer fra ulike utviklingsmodellorganismer12,13,14, demonstrerer denne artikkelen mekanikken i tilnærmingen for de som først lærer å dyrke kranial NCC fra kyllingembryoer.
Den nåværende protokollen beskriver en allsidig teknikk for fremstilling av NCC-kulturer hos kyllinger (figur 1). Fordi NCC migrerer lett fra eksplanterte nevrale folder på et kultursubstrat, segregerer kylling-NCC-er naturlig fra embryonalt vev, og primære kulturer genereres lett. Ettersom midthjerne-NCC-er migrerer en masse fra kraniale nevrale folder (i motsetning til den langvarige, celle-for-celle-delamineringen i stammen15), består disse kulturene hovedsakelig av migrerende kraniale nevrale kamceller, med innledende nevralfoldeksisjon som gir en innsamlingsmetode for premigratoriske NCC-er. En grunnleggende metode for dissekering og dyrking av kyllingkraniale nevrale folder er detaljert, og forslag til forskjellige applikasjoner og variasjoner på denne metoden tilbys.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig01v2.jpg"> Figur 1: Skjematisk oversikt over kyllingkranial nevral foldekulturprotokoll. (A,B) Kraniale nevrale folder (skissert i blått) blir skåret ut fra et kyllingembryo med fem somitter (vist i dorsalvisning i A). Grå bånd, hjerte halvmåne. (C) Når de er belagt på fibronektin, kommer migrerende nevrale kamceller ut av nevrale folder og sprer seg på substratet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63799/63799fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber dishes (glass bottom, single or divided)</td>
			<td>MatTek; Cell Vis</td>
			<td>P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) 
			X000NOK1OJ (Cellvis)</td>
			<td>Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>633029, 633031, 633033, 633035, 633037</td>
			<td>circles, 0.13&#8211;0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Alternative for L15 media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Sportsman</td>
			<td>1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40008A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>grade 3MM chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (blunt)</td>
			<td>Fisher Scientific; Thomas Scientific</td>
			<td>08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td>Free image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold)</td>
			<td>Vector Laboratories; Thermofisher Scientific</td>
			<td>H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td>10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>VWR (or similar)</td>
			<td></td>
			<td>60 mm, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>multiple flurophores available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td>For tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (dissection)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td>35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>Variety of sources</td>
			<td></td>
			<td>0.01&#34; diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures

Under vertebratutvikling migrerer nevrale kamceller (NCC) mye og differensierer til forskjellige celletyper som bidrar til strukturer som kraniofacialskjelettet og det perifere nervesystemet. Selv om det er avgjørende å forstå NCC-migrasjon i sammenheng med et 3D-embryo, letter isolering av migrerende celler i 2D-kultur visualisering og funksjonell karakterisering, som utfyller embryonale studier. Denne protokollen demonstrerer en metode for å isolere kyllingkraniale nevrale folder for å generere primære NCC-kulturer. Migrerende NCC kommer fra nevrale foldeplanter belagt på et fibronektinbelagt substrat. Dette resulterer i spredte, tilhørende NCC-populasjoner som kan vurderes ved farging og kvantitative morfologiske analyser. Denne forenklede kulturtilnærmingen er svært tilpasningsdyktig og kan kombineres med andre teknikker. For eksempel kan NCC-emigrasjon og migrasjonsadferd evalueres ved time-lapse-avbildning eller funksjonelt spørres ved å inkludere inhibitorer eller eksperimentelle manipulasjoner av genuttrykk (f.eks. DNA, morfolino eller CRISPR-elektroporering). På grunn av sin allsidighet gir denne metoden et kraftig system for å undersøke kranial NCC-utvikling.

En oversikt over denne protokollen er vist i figur 1. De rugede eggene ble åpnet, og eggeplommen, med embryoet på overflaten, ble isolert ved forsiktig å helle i håndflaten på en hansket hånd (figur 2A, B). Etter å ha ryddet bort albuminet (figur 2C), ble filterpapirrammer påført eggeplommemembranen som omgir embryoet for å lette kutting og løfting av embryoet fra eggeplommen, som begynner å søle bort n...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Denne allsidige protokollen beskriver isoleringen av premigratoriske nevrale kamceller (NCC) gjennom eksisjon av kraniale nevrale folder fra kyllingembryoer. Ved plating og inkubasjon kommer migrerende NCCer fra nevrale foldeksplanter, noe som muliggjør vurdering av cellemorfologi og migrasjon i et forenklet 2D-miljø.

Forberedelse og morfologisk analyse av kyllingkraniale nevrale kamcellekulturer

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Nevrale kamceller emigrerer fra kraniale nevrale folder i embryoer eller når de plasseres i kultur. Dette gir en praktisk metode for å isolere primære migrerende nevrale kamceller uten celledissosiasjon. Mens nevral kammigrasjon vanligvis skjer innenfor det tredimensjonale embryonale miljøet, muliggjør todimensjonal kultur visualisering og undersøkelse av migrasjonsrelaterte prosesser.Selv om kraniale nevrale foldkulturprotokoller eksisterer, krever denne metoden trening og organismespesifikke trinn. Denne videoen demonstrerer teknikker for å lette reproduserbar forberedelse av kyllingkraniale nevrale foldkulturer. Nybegynnere sliter ofte med å dissekere og plating nevrale folder og vurdere kulturutfall.Ved å følge retningslinjene for disseksjon og anvende den morfometriske analysen som er beskrevet her, kan man oppnå konsistente, kvantitative resultater. For å begynne, legg de befruktede eggene i oppreist stilling inne i en fuktet inkubator ved 38 grader Celsius. Etter å ha fjernet eggene fra inkubatoren, desinfiser skallene ved å sprøyte 70% etanol grundig og la dem tørke.For festing og farging av kulturene, bruk glassdekselsklier plassert i en flerbrønnskulturskål, og pipette nok fibronektinløsning for å dekke bunnen av brønnen. Deretter bytter du lokket og inkuberer platen med fibronektinoppløsning i en fuktet inkubator ved 38 grader Celsius i minst en time mens du dissekerer nevrale folder. Bruk stumpe tang til å stikke et lite hull i skallet på 1/4 til 1/3 av eggets lengde.Sett forsiktig de stumpe tangene inn i det lille hullet, og sørg for ikke å forstyrre eggeplommen. Skjær deretter gjennom eggeskallet rundt egget, fjern toppen av eggeskallet og plasser embryoet for isolasjon. Forbered embryoet ved forsiktig å bruke den flate kanten av lukkede stumpe tang for å tørke bort overflødig albumin på eggeplommens overflate som dekker embryoet.Bruk tang til å plassere en filterpapirstøtteramme over embryoet, med embryoet i rammens vindu. Trykk forsiktig ned på filterpapiret for å feste seg til eggeplommen. Klipp rundt utsiden av filterpapirrammen med disseksjonssaks.Bruk tang eller saksespisser for å ta tak i kanten av rammen, og løft embryoet forsiktig bort fra eggeplommen. Plasser embryoet med papirrammen med forsiden ned i en 60 eller 100 milliliter petriskål fylt med Ringer's med penne-streptokokker. Hold parabolen av embryoer på is hvis du samler dem for en RNA eller proteinfølsom nedstrøms applikasjon.Overfør et embryo til en ren skål som inneholder Ringers pennestrekløsning. Sveip embryoet forsiktig frem og tilbake for å fjerne eggeplomme som skjuler utsikten, og bytt ut Ringers penne-streptokokkeløsning eller overfør det til en fersk tallerken hvis det blir overskyet. Plasser embryoets dorsale og rammeside opp under et dissekeringsmikroskop.La embryoet ligge på papirrammen for å holde det strukket og holdt på plass. Fjern deretter vitellinemembranen, ved hjelp av tang for å eksponere nevrale folder. Inkluder vev caudal til de ekspanderende optiske vesiklene og rostral til bakhjernen, hvor rhombomere innsnevringer bare begynner å vises.Bruk vårsaks, fjern forsiktig midthjernens nevrale folder. Pass på å fjerne det dorsale aspektet av nevralfolden med minimal forurensning av nevrale røret og ikke-nevrale ektoderm, og overfør nevrale folder til en ren tallerken som inneholder Ringers penne-strepløsning ved hjelp av en P20-pipettor eller et sterilt glass Pasteur-pipette skyllet med yolky Ringers penne-strepløsning. Oppbevar oppsamlede folder på is mens du dissekerer ytterligere bretter.Etter å ha fjernet kulturskålen fra inkubatoren, bruk en pipettor eller Pasteur-pipette for å fjerne fibronektinoppløsningen fra dekselslipp, tallerken eller brønn. Etter å ha skyllet det fibronektinbelagte substratet med Ringers penne-strepløsning, tilsett et passende volum av komplette kulturmedier til parabolen eller brønnen. For å blokkere plasten og forhindre at vevet fester seg, bruk en P20- eller P200-pipetor og skyll pipettespissen med yolky Ringers penne-strepløsning.Deretter overfører du de isolerte nevrale foldene mot midten av den fibronektinbelagte dekselet, og pass på å overføre så lite Ringers penne-strepløsning som mulig. Etter å ha latt plantene slå seg ned i 10 til 15 minutter, plasser dem i et fuktet kammer ved 38 grader Celsius ved sakte og forsiktig å bære kulturskålen med belagte nevrale folder. Fjern kulturmediet med en Pasteur-pipette, og skyll brønnene med filtersterilisert PBS.Tilsett 4% paraformaldehyd, og hold det på en plattformrister i 15 minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, fjern paraformaldehyd, skyll brønnene tre ganger med PBS, og tilsett PBST som inneholder 5% serum. Nå, pipette 30 mikroliter 200-nanomolar Oregon Green konjugert phalloidin på en jevn overflate for hver dekselslipp.Bruk et par tang, fjern dekselet fra PBST som inneholder 5% serum, og sørg for orienteringen av cellene som vender oppover. Fukt overflødig væske ved å berøre kanten på dekselet til en delikat oppgavevisker. Plasser forsiktig hvert deksel med cellesiden ned på dråpen fortynnet phalloidin, og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.Etter inkubasjonsperioden, løft dekselet fra fargeløsningen og legg det tilbake i kulturskålen, snu det slik at cellesiden er oppe. Sørg for å dekke dekselet med PBST, og legg det på en plattform shaker i 10 minutter, holde dekselet slips dekket og i mørket. Fjern PBST, og gjenta vaskingen av dekselslippene to ganger i totalt tre 10-minutters vasker.Plasser en dråpe monteringsmedier på et mikroskoplysbilde. Monter dekselets glidecelleside ned ved å senke dekselet sakte i vinkel på monteringsmediet for å unngå å skape bobler, og la mediet stille seg før avbildning. Til slutt avbilder du de fargede cellene, og eksporterer dem som TIFF-filer.Nevrale kamceller begynte å dukke opp fra adherente nevrale foldeksplanter innen tre til fire timer etter inkubasjon, og migrasjonen ble fullført etter ca. 20 timer. De migrerende nevrale kamcellene ble merket med HNK-1, og de fleste cellene så ut til å være HNK-1-positive. De migrerte nevrale kamcellene ble visualisert ved å fargelegge filamentøst aktin med phalloidin.Bilder av phalloidin-fargede celler ble behandlet ved hjelp av ImageJ for å produsere et terskelbilde der cellene virket svarte med hvit bakgrunn. Terskelbildet ble analysert og ulike målinger vist i kontrasterende søylediagrammer eller fiolinplott. For eksempel var gjennomsnittlig areal av de 69 analyserte cellene ca. 802, 11 kvadratmeter, alt fra 60, 27 til 2, 664, 53 kvadratmeter.Sirkularitet reflekterer cellens fremspring og varierer fra 0, 101 til 0, 875. De lavere verdiene indikerer en langstrakt form, mens en verdi på en indikerer en perfekt sirkel. De fleste celler viste en langstrakt form, som lettest ses i fiolinplottet.Migrerende nevrale kamceller i dette feltet hadde et gjennomsnittlig sideforhold på ca. 2, 13, og et sideforhold på en indikerer en symmetrisk form. Forsiktig excision og explant plating er avgjørende for vellykkede kulturer. Tillat nevrale folder å slå seg ned med kuttsiden ned i 10 til 15 minutter, og overfør deretter sakte til inkubatoren for å oppmuntre til vedheft.Variasjoner på disse teknikkene inkluderer forbigående genetisk manipulasjon før dyrking og time-lapse imaging under inkubasjon. I tillegg tillater denne protokollen innsamling av premigratoriske og migrerende nevrale kamcellepopulasjoner for analyse på omics-nivå.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differensiering av Human Neural Stem Cell Line on tredimensjonal kulturer, Analyse av mikroRNA og Antatte målgener

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dobbel merking av nevrale kamceller og blodårer i kyllingembryoer ved hjelp av ChickGFP Neural Tube Grafting og Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Levering av<em&gt; I Vivo</em&gt; Akutt Intermittent Hypoksi i Neonatal Gnagere til Prime subventricular Zone-avledet Neural stamcelle kulturer

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetisk tilnærming til Avdekke Stress resistensgener i Mus - En High-throughput Screen i ES-celler

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generering av genmodifiserte organotypiske Skin kulturer Bruke devitalized Menneskelig Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dyrking Menneskelig Pluripotent og Neural stamceller i et lukket cellekultur System for Basic og Preklinisk Forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Etablering av Proliferativ Tetraploid Celler fra transformerte humane fibroblaster

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Flere Foton tid forfalle Imaging se utvikling i sanntid: visualisering av migrere Neural Crest celler i sebrafisk embryo

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika smitte av kultivert menneskelig fosterets hjerne nevrale stamceller for Immunocytochemical analyse

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering av tangentiell celle migrasjon i utviklingsland Chick fiberoptisk Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...