Name: preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures
Uploaded: 2022-06-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

Мы благодарим Коринн А. Фэйрчайлд и Кэти Л. Вермиллион, которые участвовали в разработке нашей версии протокола культивирования черепно-мозговой нейронной складки цыпленка.

Можно использовать любую разновидность пород Gallus gallus , включая White Leghorn, Golden Sex Link или Rhode Island Red. Куриные яйца, использованные в настоящем исследовании, были различных пород и получены из нескольких источников, включая местные фермы и инкубатории.
1. Подготовка раств...

<ol>
	<li>Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+border:+Induction,+specification+and+maturation+of+the+territory+that+generates+neural+crest+cells.">The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells.</a> Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).</li><li>Tang, W., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+lineage+analysis:+From+past+to+future+trajectory.">Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory.</a> Development. 147 (20), (2021).</li><li>Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+different+migration+strategies+as+viewed+from+the+neural+crest.">Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+bulldoze+through+the+microenvironment+using+Aquaporin+1+to+stabilize+filopodia.">Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia.</a> Development. 147 (1), 185231 (2020).</li><li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+fragment+C3a+controls+mutual+cell+attraction+during+collective+cell+migration.">Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration.</a> Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).</li><li>Giovannone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slits+affect+the+timely+migration+of+neural+crest+cells+via+robo+receptor.">Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor.</a> Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).</li><li>Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+methylation+is+essential+for+neural+crest+migration.">Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration.</a> Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).</li><li>Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongator+Protein+3+(Elp3)+stabilizes+Snail1+and+regulates+neural+crest+migration+in+Xenopus.">Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Gonzalez Malagon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3+controls+migration+of+the+neural+crest+lineage+in+mouse+and+Xenopus.">Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).</li><li>Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+promotes+neural+crest+migration+via+yap/tead+signaling.">Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling.</a> Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).</li><li>Jacques-Fricke, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+NSD3-dependent+neural+crest+gene+expression+reveals+known+and+novel+candidate+regulatory+factors.">Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors.</a> Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).</li><li>Bronner-Fraser, M., Garc&#237;a-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+manipulations+of+neural+crest+cells+or+their+migratory+pathways.">Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways.</a> Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation.">Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).</li><li>Malagon, S. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+culture+and+analysis+of+primary+cranial+neural+crest+cells+from+mouse+for+the+study+of+neural+crest+cell+delamination+and+migration.">Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+delamination+and+migration:+From+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration.">Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).</li><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus.">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryological+and+genetic+manipulation+of+chick+development.">Embryological and genetic manipulation of chick development.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).</li><li>Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phalloidin+binding+site+of+F-actin.">The phalloidin binding site of F-actin.</a> The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).</li><li>Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+stages+of+trunk+neural+crest+migration+in+avian+embryos+using+monoclonal+antibody+HNK-1.">Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1.</a> Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations.">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations.</a> Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).</li><li>Haupt, A., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+their+own+shape+-+mechanisms+to+probe+cell+geometry+and+their+implications+in+cellular+organization+and+function.">How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li><li>Ezin, M., Fraser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+time-lapse+imaging+of+the+early+avian+embryo.">Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+live+imaging+of+avian+embryos.">In ovo live imaging of avian embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).</li><li>McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+neural+crest+cell+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+the+chick+embryo.">Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo.</a> Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).</li><li>Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+cranial+neural+crest+cells+release+extracellular+vesicles+that+are+critical+for+their+migration.">Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration.</a> Journal of Cell Science. , (2022).</li><li>Williams, R., Sauka-Spengler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+ovo+electroporation+of+early+chicken+embryos.">Ex ovo electroporation of early chicken embryos.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).</li><li>Moulton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+morpholinos+to+control+gene+expression.">Using morpholinos to control gene expression.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).</li><li>Gandhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-plasmid+approach+for+genome+editing+coupled+with+long-term+lineage+analysis+in+chick+embryos.">A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos.</a> Development. 148 (7), (2021).</li><li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+Global+Neural+Crest+Gene+Regulatory+Network+In+Vivo.">Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo.</a> Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).</li></ol>

Метод, описанный здесь, обеспечивает адаптируемый метод выделения нервных складок цыплят и их покрытия для создания культур мигрирующих черепных NCC. Эти культуры обеспечивают упрощенные 2D-условия для легкого анализа миграции и морфологии цыплят NCC, которые могут дополнять более техни?...

Клетки нервного гребня (NCC) представляют собой переходную клеточную популяцию в эмбрионах позвоночных. НКЦ указываются на границах нервной пластинки и претерпевают эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМТ) для миграции из дорсальной нервной трубки1. После ЭМТ NCC широко рассеиваются по всему эмбриону, в конечном итоге дифференцируя и способствуя различным структурам, включая черепно-лицевой скелет, отток сердца и большую часть периферической нервной системы2. Изменения в полярности клеток, цитоскелете и адгезионных свойствах объясняют этот переход от премиграционной к мигрирующей клеточной популяции3. Изучение NCC EMT и миграции дает представление о фундаментальных механизмах подвижности клеток и информирует об усилиях по профилактике и лечению врожденных дефектов и метастазирования рака.
В то время как анализ in vivo имеет жизненно важное значение для понимания процессов развития NCC в эмбриональном контексте, методы in vitro предлагают визуальную и физическую доступность, которая облегчает дополнительные экспериментальные возможности. В упрощенной 2D-среде можно оценить морфологию NCC, цитоскелетные структуры и расстояние миграции. Кроме того, влияние возмущения генетического или растворимого фактора на миграционное поведение подвижных ННК может быть проанализировано 4,5,6,7,8,9,10. Кроме того, изолированные премиграторные или мигрирующие НКЦ могут быть собраны, объединены и использованы для высокопроизводительных методологий для изучения регуляции развития NCC посредством протеомного, транскриптомного и эпигеномного профилирования 7,11. В то время как доступны методы получения черепных NCC из различных модельных организмов развития 12,13,14, в этой статье демонстрируется механика подхода для тех, кто впервые научился культивировать черепные NCC из эмбрионов цыплят.
Текущий протокол описывает универсальную технику приготовления черепно-черепных культур NCC цыплят (рисунок 1). Поскольку NCC легко мигрируют из эксплантированных нервных складок на субстрат культуры, цыплята NCC естественным образом отделяются от эмбриональной ткани, и первичные культуры легко генерируются. Поскольку НКЦ среднего мозга массово мигрируют из черепных нервных складок (в отличие от затяжного расслоения клетки за клеткой в стволе15), эти культуры состоят в основном из мигрирующих клеток черепно-мозгового нервного гребня, причем начальное иссечение нервной складки обеспечивает метод сбора для премиграторных NCC. Подробно описан базовый метод вскрытия и культивирования черепно-мозговых складок цыплят, предложены предложения по различным применениям и вариациям этого метода.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig01v2.jpg"> Рисунок 1: Схематический обзор протокола культивирования черепно-мозговой складки цыпленка. (A,B) Черепные нервные складки (очерченные синим цветом) иссекаются из эмбриона цыпленка с пятью сомитами (показаны в дорсальном виде в А). Серые полосы, сердечный полумесяц. (C) При нанесении фибронектина мигрирующие клетки нервного гребня выходят из нервных складок и рассеиваются на субстрате. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63799/63799fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber dishes (glass bottom, single or divided)</td>
			<td>MatTek; Cell Vis</td>
			<td>P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) 
			X000NOK1OJ (Cellvis)</td>
			<td>Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>633029, 633031, 633033, 633035, 633037</td>
			<td>circles, 0.13&#8211;0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Alternative for L15 media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Sportsman</td>
			<td>1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40008A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>grade 3MM chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (blunt)</td>
			<td>Fisher Scientific; Thomas Scientific</td>
			<td>08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td>Free image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold)</td>
			<td>Vector Laboratories; Thermofisher Scientific</td>
			<td>H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td>10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>VWR (or similar)</td>
			<td></td>
			<td>60 mm, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>multiple flurophores available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td>For tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (dissection)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td>35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>Variety of sources</td>
			<td></td>
			<td>0.01&#34; diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures

Во время развития позвоночных клетки нервных гребней (NCC) широко мигрируют и дифференцируются в различные типы клеток, которые способствуют таким структурам, как черепно-лицевой скелет и периферическая нервная система. Хотя важно понимать миграцию NCC в контексте 3D-эмбриона, выделение мигрирующих клеток в 2D-культуре облегчает визуализацию и функциональную характеристику, дополняя эмбриональные исследования. Настоящий протокол демонстрирует метод выделения черепно-мозговых складок цыплят для генерации первичных культур NCC. Мигрирующие NCC возникают из эксплантов нервной складки, покрытых фибронектиновым субстратом. Это приводит к дисперсным, адгезивным популяциям NCC, которые могут быть оценены с помощью окрашивания и количественного морфологического анализа. Этот упрощенный культурный подход обладает высокой адаптивностью и может сочетаться с другими методами. Например, эмиграция NCC и миграционное поведение могут быть оценены с помощью покадровой визуализации или функционально запрошены путем включения ингибиторов или экспериментальных манипуляций экспрессии генов (например, ДНК, морфолино или электропорации CRISPR). Благодаря своей универсальности этот метод обеспечивает мощную систему для исследования развития черепных NCC.

Обзор данного протокола показан на рисунке 1. Инкубированные яйца открывали, а желток с эмбрионом на поверхности изолировали, осторожно наливая в ладонь перчаточной руки (рисунок 2A,B). После очистки альбумина (рисунок 2C) на желтко?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Этот универсальный протокол описывает выделение премигрирующих клеток нервного гребня (NCC) путем иссечения черепных нервных складок из эмбрионов цыплят. После покрытия и инкубации мигрирующие NCC возникают из эксплантов нервной складки, что позволяет оценить морфологию клеток и миграцию в упрощенной 2D-среде.

Подготовка и морфологический анализ клеточных культур черепно-мозгового черепа цыплят

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Клетки нервного гребня эмигрируют из черепных нервных складок в эмбрионах или при помещении в культуру. Это обеспечивает удобный метод выделения первичных мигрирующих клеток нервного гребня без диссоциации клеток. В то время как миграция нейронного гребня обычно происходит в трехмерной эмбриональной среде, двумерная культура позволяет визуализировать и исследовать процессы, связанные с миграцией.Хотя существуют протоколы культивирования черепных нервных складок, этот метод требует обучения и специфических для организма шагов. Это видео демонстрирует методы, облегчающие воспроизводимую подготовку культур черепно-мозговых складок цыплят. Новички часто борются с препарированием и покрытием нейронных складок и оценкой результатов культуры.Следование рекомендациям по вскрытию и применение морфометрического анализа, описанного здесь, позволяет получить последовательные, количественные результаты. Для начала поместите оплодотворенные яйцеклетки в вертикальное положение внутри увлажненного инкубатора при температуре 38 градусов по Цельсию. После извлечения яиц из инкубатора дезинфицируйте скорлупу, тщательно распыляя 70% этанола и давая им высохнуть.Для фиксации и окрашивания культур используют стеклянные крышки, помещенные в многоскважинную посуду для культивирования тканей, и пипетку достаточно раствора фибронектина, чтобы покрыть дно колодца. Затем замените крышку и инкубируйте пластину раствором фибронектина в увлажненном инкубаторе при температуре 38 градусов Цельсия в течение не менее одного часа, рассекая нервные складки. Используйте тупые щипцы, чтобы проткнуть небольшое отверстие в скорлупе на 1/4-1/3 длины яйца.Осторожно вставьте тупые щипцы в небольшое отверстие, чтобы не нарушить работу желтка. Затем разрежьте яичную скорлупу вокруг яйца, удалите верхнюю часть яичной скорлупы и поместите эмбрион для выделения. Подготовьте эмбрион, осторожно используя плоский край закрытых тупых щипцов, чтобы вытереть избыток альбумина на поверхности желтка, покрывающего эмбрион.Используйте щипцы, чтобы поместить опорную рамку из фильтровальной бумаги поверх эмбриона, а эмбрион находится в окне рамки. Осторожно надавите на фильтровальную бумагу, чтобы прилипнуть к желтку. Вырежьте вокруг внешней стороны рамки фильтровальной бумаги ножницами для рассечения.Используйте щипцы или кончики ножниц, чтобы схватить край рамки, и осторожно поднимите эмбрион от желтка. Поместите эмбрион с бумажной рамкой вниз в 60 или 100-миллилитровую чашку Петри, наполненную рингером со стрептококком. Держите чашку эмбрионов на льду, если собираете их для РНК или белково-чувствительного последующего применения.Перенесите эмбрион в чистую посуду, содержащую раствор Рингера со стрептококковым раствором. Осторожно смахните эмбрион взад и вперед, чтобы очистить любой желток, который скрывает вид, и замените раствор стрептококка Рингера или перенесите его в свежую посуду, если она станет мутной. Расположите дорсальную и рамочную сторону эмбриона вверх под рассекающим микроскопом.Оставьте эмбрион на бумажной рамке, чтобы он был растянут и удерживался на месте. Затем удалите вителлиновую мембрану, используя щипцы, чтобы обнажить нервные складки. Включите тканевый каудальный к расширяющимся зрительным пузырькам и ростральный к заднему мозгу, где ромбомерные сужения только начинают появляться.С помощью пружинных ножниц тщательно иссейте средние мозговые складки. Позаботьтесь о том, чтобы иссечь спинной аспект нервной складки с минимальным загрязнением нервной трубки и ненейронной эктодермы, и перенесите нервные складки в чистую посуду, содержащую раствор Рингера из стрептококкового пера, используя пипетку P20 или стерильную стеклянную пипетку Пастера, промытую раствором стрептококкового пера Желтка Рингера. Храните собранные складки на льду при вскрытии дополнительных складок.После извлечения чашки для культуры из инкубатора используйте пипетку или пипетку Пастера, чтобы удалить раствор фибронектина из крышки, тарелки или колодца. После промывки субстрата, покрытого фибронектином, раствором Рингера со стрептококковым раствором, добавьте соответствующий объем полной культуральной среды в блюдо или колодец. Чтобы заблокировать пластик и предотвратить прилипание ткани, используйте пипеттор P20 или P200 и промойте кончик пипетки раствором желточного рингера.Затем переместите изолированные нервные складки к центру покрытого фибронектином покровного скольжения, позаботившись о том, чтобы перенести как можно меньше раствора Рингера с ручкой и стрептококком. После того, как экспланты осядут в течение 10-15 минут, поместите их в увлажненную камеру при температуре 38 градусов цельсия, медленно и осторожно перенося культуральную посуду с покрытыми нервными складками. Удалите питательные среды пипеткой Пастера и промойте колодцы стерилизованным фильтром PBS.Добавьте 4% параформальдегида и держите его на платформе шейкера в течение 15 минут при комнатной температуре. В конце инкубации удалите параформальдегид, трижды промойте лунки PBS и добавьте PBST, содержащий 5% сыворотки. Теперь пипетка 30 микролитров 200-наномоляра Oregon Green конъюгировала фаллоидин на гладкую поверхность для каждого скольжения крышки.Используя пару щипцов, снимите крышку с PBST, содержащей 5% сыворотки, обеспечив ориентацию клеток вверх. Отведите лишнюю жидкость, ненадолго коснувшись края скольжения крышки к деликатному стеклоочистителю. Аккуратно поместите каждую скользящую клетку крышки вниз на каплю разбавленного фаллоидина и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.После инкубационного периода снимите крышку с окрашивающего раствора и поместите ее обратно в чашку для культивирования, перевернув ее так, чтобы сторона клетки была поднята. Убедитесь, что крышка покрыта PBST и поместите ее на шейкер платформы на 10 минут, сохраняя крышку закрытой и в темноте. Удалите PBST и повторите стирку крышки дважды, в общей сложности три 10-минутные стирки.Поместите одну каплю монтажного носителя на предметное стекло микроскопа. Установите скользящую ячейку крышки стороной вниз, медленно опуская проскальзывание крышки под углом на монтажный носитель, чтобы избежать образования пузырьков и позволить носителю установиться перед съемкой. Наконец, создайте изображение окрашенных ячеек и экспортируйте их в виде файлов TIFF.Клетки нервного гребня начали выходить из адгезивных эксплантов нервной складки в течение трех-четырех часов после инкубации, и миграция была завершена примерно через 20 часов. Мигрирующие клетки нервного гребня были помечены с использованием HNK-1, и большинство клеток оказались HNK-1 положительными. Мигрировавшие клетки нервного гребня были визуализированы путем окрашивания нитевидного актина фаллоидином.Изображения клеток, окрашенных фаллоидином, были обработаны с использованием ImageJ для получения порогового изображения, в котором клетки казались черными с белым фоном. Пороговое изображение было проанализировано и различные измерения отображены в контрастных гистограммах или скрипичных графиках. Например, средняя площадь 69 проанализированных клеток составляла примерно 802,11 квадратных микрометра, в диапазоне от 60,27 до 2 664,53 квадратных микрометров.Циркулярность отражает протрузивность клетки и колеблется от 0,101 до 0,875. Нижние значения указывают на вытянутую форму, в то время как значение единицы указывает на идеальный круг. Большинство клеток демонстрировали вытянутую форму, которую легче всего увидеть на скрипичном сюжете.Мигрирующие клетки нервного гребня в этой области имели среднее соотношение сторон примерно 2,13, а соотношение сторон один указывает на симметричную форму. Тщательное иссечение и эксплантирование имеют решающее значение для успешных культур. Дайте нервным складкам осесть вниз в течение 10-15 минут, а затем медленно перенесите в инкубатор, чтобы стимулировать адгезию.Вариации этих методов включают преходящие генетические манипуляции перед культивированием и покадровую визуализацию во время инкубации. Кроме того, этот протокол позволяет собирать популяции предмиграторных и мигрирующих клеток нервных гребней для анализа на уровне омики.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Дифференциация человеческих нервных стволовых клеток линии на трехмерной культур, анализ микроРНК и предполагаемые гены-мишени

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Двойная маркировка нервных клеток Креста и кровеносных сосудов в куриных эмбрионах сиспользованием Чик GFP нейронной трубки прививки и карбоцианина красителя DiI инъекции

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Доставка<em&gt; В Vivo</em&gt; Острая перемежающейся Гипоксия у новорожденных Грызуны премьер субвентрикулярной зоне, полученных из нейронных клеток-предшественников культур

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Вперед генетический подход к Раскройте стрессоустойчивости генов в мышах - высокой пропускной экране в ЭС клетках

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Генерация генетически модифицированных культур Органотипической кожи Использование нежизнеспособных Human дермы

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Культивирование Человеческий плюрипотентных и нервные стволовые клетки в замкнутой системе клеточной культуре фундаментальных и доклинических исследований

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Создание пролиферативный тетраплоид клеток из нетрансформированных фибробластах человека

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Мульти Фотон время Замедленная съемка изображений для визуализации в режиме реального времени разработки: Визуализация миграции клеток нервной гребень в Zebrafish эмбриона

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Зика вирусной инфекции культурный человеческий мозг плода нервных стволовых клеток для иммуноцитохимическое анализа

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Визуализация тангенциальная клеток миграции в развивающихся куриных оптические Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...