Name: preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures
Uploaded: 2022-06-27T13:30:00
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Agradecemos a Corinne A. Fairchild y Katie L. Vermillion, quienes participaron en el desarrollo de nuestra versión del protocolo de cultivo del pliegue neural craneal del pollo.

Se puede usar cualquier variedad de razas Gallus gallus , incluyendo White Leghorn, Golden Sex Link o Rhode Island Red. Los huevos de gallina utilizados en el presente estudio eran de varias razas y se obtuvieron de múltiples fuentes, incluidas granjas y criaderos locales.
1. Preparación de soluciones y materiales
<ol><li>Prepare la solución de Ringer mezclando 123,3 mM de NaCl, 1,53 mM de CaCl 2, 4,96 mM de KCl, 0,809 mM deNa2HPO 4 y 0,147 mM de KH<su...

<ol>
	<li>Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+border:+Induction,+specification+and+maturation+of+the+territory+that+generates+neural+crest+cells.">The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells.</a> Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).</li><li>Tang, W., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+lineage+analysis:+From+past+to+future+trajectory.">Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory.</a> Development. 147 (20), (2021).</li><li>Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+different+migration+strategies+as+viewed+from+the+neural+crest.">Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+bulldoze+through+the+microenvironment+using+Aquaporin+1+to+stabilize+filopodia.">Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia.</a> Development. 147 (1), 185231 (2020).</li><li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+fragment+C3a+controls+mutual+cell+attraction+during+collective+cell+migration.">Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration.</a> Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).</li><li>Giovannone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slits+affect+the+timely+migration+of+neural+crest+cells+via+robo+receptor.">Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor.</a> Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).</li><li>Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+methylation+is+essential+for+neural+crest+migration.">Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration.</a> Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).</li><li>Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongator+Protein+3+(Elp3)+stabilizes+Snail1+and+regulates+neural+crest+migration+in+Xenopus.">Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Gonzalez Malagon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3+controls+migration+of+the+neural+crest+lineage+in+mouse+and+Xenopus.">Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).</li><li>Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+promotes+neural+crest+migration+via+yap/tead+signaling.">Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling.</a> Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).</li><li>Jacques-Fricke, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+NSD3-dependent+neural+crest+gene+expression+reveals+known+and+novel+candidate+regulatory+factors.">Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors.</a> Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).</li><li>Bronner-Fraser, M., Garc&#237;a-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+manipulations+of+neural+crest+cells+or+their+migratory+pathways.">Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways.</a> Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation.">Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).</li><li>Malagon, S. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+culture+and+analysis+of+primary+cranial+neural+crest+cells+from+mouse+for+the+study+of+neural+crest+cell+delamination+and+migration.">Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+delamination+and+migration:+From+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration.">Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).</li><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus.">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryological+and+genetic+manipulation+of+chick+development.">Embryological and genetic manipulation of chick development.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).</li><li>Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phalloidin+binding+site+of+F-actin.">The phalloidin binding site of F-actin.</a> The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).</li><li>Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+stages+of+trunk+neural+crest+migration+in+avian+embryos+using+monoclonal+antibody+HNK-1.">Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1.</a> Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations.">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations.</a> Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).</li><li>Haupt, A., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+their+own+shape+-+mechanisms+to+probe+cell+geometry+and+their+implications+in+cellular+organization+and+function.">How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li><li>Ezin, M., Fraser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+time-lapse+imaging+of+the+early+avian+embryo.">Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+live+imaging+of+avian+embryos.">In ovo live imaging of avian embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).</li><li>McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+neural+crest+cell+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+the+chick+embryo.">Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo.</a> Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).</li><li>Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+cranial+neural+crest+cells+release+extracellular+vesicles+that+are+critical+for+their+migration.">Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration.</a> Journal of Cell Science. , (2022).</li><li>Williams, R., Sauka-Spengler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+ovo+electroporation+of+early+chicken+embryos.">Ex ovo electroporation of early chicken embryos.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).</li><li>Moulton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+morpholinos+to+control+gene+expression.">Using morpholinos to control gene expression.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).</li><li>Gandhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-plasmid+approach+for+genome+editing+coupled+with+long-term+lineage+analysis+in+chick+embryos.">A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos.</a> Development. 148 (7), (2021).</li><li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+Global+Neural+Crest+Gene+Regulatory+Network+In+Vivo.">Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo.</a> Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).</li></ol>

La técnica descrita aquí proporciona un método adaptable para aislar los pliegues neurales de los pollitos y colocarlos en placas para crear cultivos de NCC craneales migratorios. Estos cultivos proporcionan condiciones 2D simplificadas para un fácil análisis de la migración y morfología de NCC de los pollitos que pueden complementar los métodos de imagen in ovo más desafiantes técnicamente24,25,26. Si bien es...

Las células de la cresta neural (NCC) son una población celular transitoria en embriones de vertebrados. Las NCC se especifican en los bordes de la placa neural y experimentan una transición epitelial-mesenquimal (EMT) para migrar desde el tubo neural dorsal1. Después de la EMT, las NCC se dispersan extensamente por todo el embrión, diferenciando y contribuyendo finalmente a varias estructuras, incluido el esqueleto craneofacial, el tracto de salida del corazón y la mayoría del sistema nervioso periférico2. Los cambios en la polaridad celular, el citoesqueleto y las propiedades de adhesión subyacen a este cambio de una población celular premigratoria a una migratoria3. El estudio de NCC EMT y la migración proporciona información sobre los mecanismos fundamentales de la motilidad celular e informa los esfuerzos para prevenir y tratar defectos de nacimiento y metástasis del cáncer.
Si bien el análisis in vivo es vital para comprender los procesos de desarrollo de NCC en un contexto embrionario, los métodos in vitro ofrecen accesibilidad visual y física que facilitan vías experimentales adicionales. En un entorno 2D simplificado, se puede evaluar la morfología de NCC, las estructuras citoesqueléticas y la distancia migrada. Además, se pueden analizar los efectos de la perturbación genética o del factor soluble sobre los comportamientos migratorios de las NCC móviles 4,5,6,7,8,9,10. Además, las NCC premigratorias o migratorias aisladas pueden ser recolectadas, agrupadas y utilizadas para metodologías de alto rendimiento para estudiar la regulación del desarrollo de las NCC a través de perfiles proteómicos, transcriptómicos y epigenómicos 7,11. Si bien hay métodos disponibles para preparar NCC craneales a partir de varios organismos modelo de desarrollo12,13,14, este artículo demuestra la mecánica del enfoque para aquellos que primero aprenden a cultivar NCC craneal a partir de embriones de pollo.
El protocolo actual describe una técnica versátil para preparar cultivos craneales de NCC de pollo (Figura 1). Debido a que los NCC migran fácilmente de los pliegues neurales explantados a un sustrato de cultivo, los NCC de los pollitos se segregan naturalmente del tejido embrionario, y los cultivos primarios se generan fácilmente. A medida que las NCC del mesencéfalo migran en masa desde los pliegues neurales craneales (en contraste con la delaminación prolongada célula por célula en el tronco15), estos cultivos consisten principalmente en células migratorias de la cresta neural craneal, con la escisión inicial del pliegue neural que proporciona un método de recolección para las NCC premigratorias. Se detalla un método básico para diseccionar y cultivar pliegues neurales craneales de pollo, y se ofrecen sugerencias para diferentes aplicaciones y variaciones de este método.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig01v2.jpg"> Figura 1: Descripción esquemática del protocolo de cultivo del pliegue neural craneal de pollo. (A,B) Los pliegues neurales craneales (delineados en azul) se extirpan de un embrión de pollo con cinco somitas (se muestra en vista dorsal en A). Bandas grises, media luna cardíaca. (C) Cuando se colocan en fibronectina, las células migratorias de la cresta neural emergen de los pliegues neurales y se dispersan sobre el sustrato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63799/63799fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber dishes (glass bottom, single or divided)</td>
			<td>MatTek; Cell Vis</td>
			<td>P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) 
			X000NOK1OJ (Cellvis)</td>
			<td>Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>633029, 633031, 633033, 633035, 633037</td>
			<td>circles, 0.13&#8211;0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Alternative for L15 media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Sportsman</td>
			<td>1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40008A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>grade 3MM chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (blunt)</td>
			<td>Fisher Scientific; Thomas Scientific</td>
			<td>08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td>Free image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold)</td>
			<td>Vector Laboratories; Thermofisher Scientific</td>
			<td>H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td>10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>VWR (or similar)</td>
			<td></td>
			<td>60 mm, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>multiple flurophores available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td>For tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (dissection)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td>35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>Variety of sources</td>
			<td></td>
			<td>0.01&#34; diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures

Durante el desarrollo de los vertebrados, las células de la cresta neural (NCC) migran ampliamente y se diferencian en varios tipos de células que contribuyen a estructuras como el esqueleto craneofacial y el sistema nervioso periférico. Si bien es fundamental comprender la migración de NCC en el contexto de un embrión 3D, el aislamiento de células migratorias en cultivo 2D facilita la visualización y la caracterización funcional, complementando los estudios embrionarios. El presente protocolo demuestra un método para aislar los pliegues neurales craneales de los pollitos para generar cultivos primarios de NCC. Los NCC migratorios emergen de los explantes del pliegue neural colocados en un sustrato recubierto de fibronectina. Esto da como resultado poblaciones de NCC dispersas y adherentes que pueden evaluarse mediante tinción y análisis morfológicos cuantitativos. Este enfoque de cultivo simplificado es altamente adaptable y se puede combinar con otras técnicas. Por ejemplo, la emigración de NCC y los comportamientos migratorios pueden evaluarse mediante imágenes de lapso de tiempo o consultarse funcionalmente mediante la inclusión de inhibidores o manipulaciones experimentales de la expresión génica (por ejemplo, ADN, morfolino o electroporación CRISPR). Debido a su versatilidad, este método proporciona un poderoso sistema para investigar el desarrollo craneal de NCC.

En la figura 1 se muestra una descripción general del protocolo actual. Los huevos incubados se abrieron y la yema, con el embrión en la superficie, se aisló vertiendo suavemente en la palma de una mano enguantada (Figura 2A, B). Después de eliminar la albúmina (Figura 2C), se aplicaron marcos de papel de filtro a la membrana vitelina que rodea el embrión para facilitar el corte y la elevación del embrión de...

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Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Este protocolo versátil describe el aislamiento de células de la cresta neural premigratoria (NCC) a través de la escisión de pliegues neurales craneales de embriones de pollo. Tras el recubrimiento y la incubación, las NCC migratorias emergen de los explantes del pliegue neural, lo que permite la evaluación de la morfología celular y la migración en un entorno 2D simplificado.

Preparación y análisis morfológico de cultivos de células de cresta neural craneal de pollo

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Las células de la cresta neural emigran de los pliegues neurales craneales en embriones o cuando se colocan en cultivo. Esto proporciona un método conveniente para aislar las células primarias de la cresta neural migratoria sin disociación celular. Mientras que la migración de la cresta neural ocurre típicamente dentro del entorno embrionario tridimensional, la cultura bidimensional permite la visualización e investigación de los procesos relacionados con la migración.Aunque existen protocolos de cultivo del pliegue neural craneal, este método requiere entrenamiento y pasos específicos del organismo. Este video demuestra técnicas para facilitar la preparación reproducible de cultivos de pliegues neurales craneales de pollo. Los principiantes a menudo luchan con la disección y el recubrimiento de los pliegues neuronales y la evaluación de los resultados de la cultura.Seguir las pautas de disección y aplicar el análisis morfométrico aquí descrito permite obtener resultados consistentes y cuantitativos. Para comenzar, coloque los huevos fertilizados en posición vertical dentro de una incubadora humidificada a 38 grados centígrados. Después de retirar los huevos de la incubadora, desinfecte las cáscaras rociando bien etanol al 70% y dejándolas secar.Para fijar y teñir los cultivos, use cubreobjetos de vidrio colocados en una placa de cultivo de tejido de múltiples pocillos y pipetear suficiente solución de fibronectina para cubrir el fondo del pozo. A continuación, vuelva a colocar la tapa e incubar la placa con una solución de fibronectina en una incubadora humidificada a 38 grados centígrados durante al menos una hora mientras disecciona los pliegues neurales. Use pinzas romas para hacer un pequeño agujero en la cáscara de 1/4 a 1/3 de la longitud del huevo.Inserte cuidadosamente las pinzas romas en el orificio pequeño, asegurándose de no interrumpir la yema. Luego, corte a través de la cáscara del huevo alrededor del huevo, retire la parte superior de la cáscara del huevo y coloque el embrión para el aislamiento. Prepare el embrión usando suavemente el borde plano de pinzas romas cerradas para limpiar cualquier exceso de albúmina en la superficie de la yema que cubre el embrión.Use fórceps para colocar un marco de soporte de papel de filtro sobre el embrión, con el embrión en la ventana del marco. Presione suavemente el papel de filtro para adherirse a la yema. Corte alrededor del exterior del marco de papel de filtro con tijeras de disección.Use fórceps o puntas de tijera para agarrar el borde del marco y levante suavemente el embrión lejos de la yema. Coloque el embrión con el marco de papel hacia abajo en una placa de Petri de 60 o 100 mililitros llena de Ringer con estreptococo por pluma. Mantenga el plato de embriones en hielo si los recolecta para una aplicación posterior sensible al ARN o a las proteínas.Transfiera un embrión a un plato limpio que contenga la solución pen-estreptocócica de Ringer. Agite suavemente el embrión hacia adelante y hacia atrás para eliminar cualquier yema que oscurezca la vista, e intercambie la solución de estreptococo de Ringer o transfiérala a un plato fresco si se vuelve turbia. Coloque el embrión dorsal y el marco hacia arriba bajo un microscopio de disección.Deje el embrión en el marco de papel para mantenerlo estirado y mantenido en su lugar. Luego, retire la membrana vitelina, usando fórceps para exponer los pliegues neurales. Incluye tejido caudal a las vesículas ópticas en expansión y rostral al cerebro posterior, donde las constricciones rombomeras apenas comienzan a aparecer.Usando tijeras de resorte, extirpe cuidadosamente los pliegues neuronales del mesencéfalo. Tenga cuidado de extirpar el aspecto más dorsal del pliegue neural con una contaminación mínima del tubo neural y el ectodermo no neural, y transfiera los pliegues neurales a un plato limpio que contenga la solución pen-estreptocócica de Ringer utilizando una pipeta P20 o una pipeta Pasteur de vidrio estéril enjuagada con yema Solución de estreptococo de Ringer. Almacene los pliegues recolectados en hielo mientras disecciona pliegues adicionales.Después de retirar la placa de cultivo de la incubadora, use una pipeta o pipeta Pasteur para extraer la solución de fibronectina de los cubiertos, la placa o el pozo. Después de enjuagar el sustrato recubierto de fibronectina con la solución pen-estreptococo de Ringer, agregue un volumen apropiado de medios de cultivo completos al plato o pozo. Para bloquear el plástico y evitar que el tejido se pegue, use un pipetor P20 o P200 y enjuague la punta de la pipeta con la solución de estreptococo de yema Ringer.Luego, transfiera los pliegues neurales aislados hacia el centro del resbalón de cubierta recubierto de fibronectina, teniendo cuidado de transferir la menor cantidad posible de solución de estreptococo de Ringer. Después de dejar que los explantes se asienten durante 10 a 15 minutos, colóquelos en una cámara humidificada a 38 grados centígrados llevando lenta y cuidadosamente la placa de cultivo con pliegues neurales plateados. Retire los medios de cultivo con una pipeta Pasteur y enjuague los pocillos con PBS esterilizado por filtro.Agregue 4% de paraformaldehído y manténgalo en una coctelera de plataforma durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, retire el paraformaldehído, enjuague los pocillos tres veces con PBS y agregue PBST que contenga 5% de suero. Ahora, pipetear 30 microlitros de faloidina conjugada Oregon Green de 200 nanomolares sobre una superficie lisa para cada cubreobjetos.Usando un par de fórceps, retire el cubreobjetos del PBST que contiene 5% de suero, asegurando la orientación de las células hacia arriba. Absorba el exceso de líquido tocando brevemente el borde de la cubierta con un limpiaparabrisas de tareas delicadas. Coloque suavemente cada lado de la célula deslizante de la cubierta hacia abajo sobre la gota de faloidina diluida e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después del período de incubación, levante el resbalón de la cubierta de la solución de tinción y colóquelo de nuevo en la placa de cultivo, volteándolo para que el lado de la celda quede hacia arriba. Asegúrese de cubrir el cubrebocado con PBST y colóquelo en un agitador de plataforma durante 10 minutos, manteniendo los cubreobjetos cubiertos y en la oscuridad. Retire PBST y repita el lavado de los cubreobjetos dos veces para un total de tres lavados de 10 minutos.Coloque una gota de medios de montaje en un portaobjetos de microscopio. Monte el lado de la celda deslizante de la cubierta hacia abajo bajando lentamente el deslizamiento de la cubierta en ángulo sobre el medio de montaje para evitar la creación de burbujas y permita que el medio se fije antes de la imagen. Finalmente, cree una imagen de las celdas teñidas y expórtelas como archivos TIFF.Las células de la cresta neural comenzaron a emerger de los explantes del pliegue neural adherente dentro de las tres o cuatro horas posteriores a la incubación, y la migración se completó después de aproximadamente 20 horas. Las células migratorias de la cresta neural se marcaron con HNK-1, y la mayoría de las células parecían ser positivas para HNK-1. Las células de la cresta neural migradas se visualizaron tiñendo actina filamentosa con faloidina.Las imágenes de las células teñidas con faloidina se procesaron utilizando ImageJ para producir una imagen de umbral en la que las células aparecían negras con un fondo blanco. Se analizó la imagen umbral y se mostraron varias mediciones en gráficos de barras contrastantes o diagramas de violín. Por ejemplo, el área promedio de las 69 células analizadas fue de aproximadamente 802.11 micrómetros cuadrados, que van desde 60.27 a 2, 664.53 micrómetros cuadrados.La circularidad refleja la protuberancia de la célula y varía de 0.101 a 0.875. Los valores más bajos indican una forma alargada, mientras que un valor de uno indica un círculo perfecto. La mayoría de las células exhibieron una forma alargada, que se ve más fácilmente en la trama del violín.Las células migratorias de la cresta neural en este campo tenían una relación de aspecto promedio de aproximadamente 2.13, y una relación de aspecto de uno indica una forma simétrica. La escisión cuidadosa y el recubrimiento de explante son cruciales para el éxito de los cultivos. Permita que los pliegues neurales se asienten cortados hacia abajo durante 10 a 15 minutos, y luego transfiéralos lentamente a la incubadora para fomentar la adhesión.Las variaciones de estas técnicas incluyen la manipulación genética transitoria antes del cultivo y las imágenes de lapso de tiempo durante la incubación. Además, este protocolo permite la recolección de poblaciones de células de cresta neural premigratorias y migratorias para el análisis a nivel ómico.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Etiquetado Dual De Las Células De La Cresta Neural Y Los Vasos Sanguíneos Dentro De Los Embriones De Pollo Usando ChickGFP Injerto De Tubo Neural Y Carbocianina Tinte DiI Inyección

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Entrega de<em&gt; En Vivo</em&gt; Aguda intermitente hipoxia neonatal en roedores a derivados de la Zona Prime subventricular progenitoras neurales Cultivos Celulares

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Enfoque genético adelante para descubrir Estrés Los genes de resistencia en ratones - Una pantalla de alto rendimiento en células madre embrionarias

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

El cultivo humanas pluripotentes y células madre neurales en un sistema de cultivo celular cerrado para la investigación básica y preclínica

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Establecimiento de células tetraploides proliferativa de fibroblastos humanos no transformadas

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Infección por el Virus Zika de células madre neurales de cerebro Fetal humano cultivadas para análisis de Immunocytochemical

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualización de la migración celular tangencial en el Tectum óptico de Chick en desarrollo

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...