Name: preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures
Uploaded: 2022-06-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

Vi tackar Corinne A. Fairchild och Katie L. Vermillion, som deltog i utvecklingen av vår version av chick cranial neural fold culture protocol.

Alla typer av Gallus gallus raser kan användas, inklusive White Leghorn, Golden Sex Link eller Rhode Island Red. Kycklingäggen som användes i den aktuella studien var av olika raser och erhölls från flera källor, inklusive lokala gårdar och kläckerier.
1. Beredning av lösningar och material
<ol><li>Bered Ringers lösning genom att blanda 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na 2 HPO 4 och 0,147 mM KH 2PO4 (se ...

<ol>
	<li>Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+border:+Induction,+specification+and+maturation+of+the+territory+that+generates+neural+crest+cells.">The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells.</a> Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).</li><li>Tang, W., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+lineage+analysis:+From+past+to+future+trajectory.">Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory.</a> Development. 147 (20), (2021).</li><li>Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+different+migration+strategies+as+viewed+from+the+neural+crest.">Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+bulldoze+through+the+microenvironment+using+Aquaporin+1+to+stabilize+filopodia.">Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia.</a> Development. 147 (1), 185231 (2020).</li><li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+fragment+C3a+controls+mutual+cell+attraction+during+collective+cell+migration.">Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration.</a> Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).</li><li>Giovannone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slits+affect+the+timely+migration+of+neural+crest+cells+via+robo+receptor.">Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor.</a> Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).</li><li>Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+methylation+is+essential+for+neural+crest+migration.">Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration.</a> Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).</li><li>Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongator+Protein+3+(Elp3)+stabilizes+Snail1+and+regulates+neural+crest+migration+in+Xenopus.">Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Gonzalez Malagon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3+controls+migration+of+the+neural+crest+lineage+in+mouse+and+Xenopus.">Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).</li><li>Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+promotes+neural+crest+migration+via+yap/tead+signaling.">Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling.</a> Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).</li><li>Jacques-Fricke, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+NSD3-dependent+neural+crest+gene+expression+reveals+known+and+novel+candidate+regulatory+factors.">Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors.</a> Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).</li><li>Bronner-Fraser, M., Garc&#237;a-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+manipulations+of+neural+crest+cells+or+their+migratory+pathways.">Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways.</a> Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation.">Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).</li><li>Malagon, S. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+culture+and+analysis+of+primary+cranial+neural+crest+cells+from+mouse+for+the+study+of+neural+crest+cell+delamination+and+migration.">Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+delamination+and+migration:+From+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration.">Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).</li><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus.">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryological+and+genetic+manipulation+of+chick+development.">Embryological and genetic manipulation of chick development.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).</li><li>Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phalloidin+binding+site+of+F-actin.">The phalloidin binding site of F-actin.</a> The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).</li><li>Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+stages+of+trunk+neural+crest+migration+in+avian+embryos+using+monoclonal+antibody+HNK-1.">Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1.</a> Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations.">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations.</a> Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).</li><li>Haupt, A., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+their+own+shape+-+mechanisms+to+probe+cell+geometry+and+their+implications+in+cellular+organization+and+function.">How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li><li>Ezin, M., Fraser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+time-lapse+imaging+of+the+early+avian+embryo.">Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+live+imaging+of+avian+embryos.">In ovo live imaging of avian embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).</li><li>McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+neural+crest+cell+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+the+chick+embryo.">Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo.</a> Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).</li><li>Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+cranial+neural+crest+cells+release+extracellular+vesicles+that+are+critical+for+their+migration.">Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration.</a> Journal of Cell Science. , (2022).</li><li>Williams, R., Sauka-Spengler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+ovo+electroporation+of+early+chicken+embryos.">Ex ovo electroporation of early chicken embryos.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).</li><li>Moulton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+morpholinos+to+control+gene+expression.">Using morpholinos to control gene expression.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).</li><li>Gandhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-plasmid+approach+for+genome+editing+coupled+with+long-term+lineage+analysis+in+chick+embryos.">A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos.</a> Development. 148 (7), (2021).</li><li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+Global+Neural+Crest+Gene+Regulatory+Network+In+Vivo.">Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo.</a> Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).</li></ol>

Tekniken som beskrivs här ger en anpassningsbar metod för att isolera kycklingneurala veck och plätera dem för att skapa kulturer av migrerande kraniala NCC. Dessa kulturer ger förenklade 2D-förhållanden för enkel analys av kyckling NCC-migration och morfologi som kan komplettera mer tekniskt utmanande i ovo-avbildningsmetoder24,25,26. Även om denna in vitro-metod är relativt enkel, beror konsekventa ...

Neurala vapenceller (NCC) är en övergående cellpopulation i embryon från ryggradsdjur. NCC specificeras vid neuralplattans gränser och genomgår en epitel-till-mesenkymal övergång (EMT) för att migrera från dorsala neuralröret1. Efter EMT sprids NCC i stor utsträckning genom embryot, vilket i slutändan differentierar och bidrar till olika strukturer, inklusive kraniofacialt skelett, utflödeskanal i hjärtat och majoriteten av det perifera nervsystemet2. Förändringar i cellpolaritet, cytoskelett och vidhäftningsegenskaper ligger till grund för detta skifte från en premigrerande till en migrerande cellpopulation3. Att studera NCC EMT och migration ger insikter i grundläggande mekanismer för cellmotilitet och informerar om insatser för att förebygga och behandla fosterskador och cancermetastaser.
Medan in vivo-analys är avgörande för att förstå NCC-utvecklingsprocesser i ett embryonalt sammanhang, erbjuder in vitro-metoder visuell och fysisk tillgänglighet som underlättar ytterligare experimentella vägar. I en förenklad 2D-miljö kan NCC-morfologi, cytoskelettstrukturer och migrerat avstånd utvärderas. Dessutom kan effekterna av genetisk eller löslig faktorstörning på migrerande beteenden hos rörliga NCC analyseras 4,5,6,7,8,9,10. Dessutom kan isolerade premigrerande eller migrerande NCC samlas in, poolas och användas för metoder med hög genomströmning för att studera utvecklingsreglering av NCC genom proteomisk, transkriptomisk och epigenomisk profilering 7,11. Medan metoder finns tillgängliga för att förbereda kranial NCC från olika utvecklingsmodellorganismer12,13,14, visar den här artikeln mekaniken i tillvägagångssättet för dem som först lär sig att odla kranial NCC från kycklingembryon.
Det nuvarande protokollet beskriver en mångsidig teknik för beredning av NCC-kulturer av kycklingkranier (figur 1). Eftersom NCC migrerar lätt från explanterade neurala veck till ett odlingssubstrat, separerar kyckling-NCC naturligt från embryonal vävnad och primära kulturer genereras lätt. Eftersom NCC: er i mitten av hjärnan migrerar massor från kranialneurala veck (i motsats till den långvariga, cell-för-cell-delamineringen i stammen15), består dessa kulturer huvudsakligen av migrerande kraniala neurala vapenceller, med initial neural fold excision som ger en insamlingsmetod för premigrativa NCC. En grundläggande metod för dissekering och odling av kycklingkraniala neurala veck är detaljerad, och förslag på olika applikationer och variationer på denna metod erbjuds.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig01v2.jpg"> Figur 1: Schematisk översikt över chick cranial neural fold culture protocol. (A,B) Kraniala neurala veck (skisserade i blått) skärs ut från ett kycklingembryo med fem somiter (visas i dorsalvy i A). Grå band, hjärtmåne. (C) När de pläteras på fibronektin kommer migrerande neurala vapenceller ut från neurala veck och sprids på substratet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63799/63799fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber dishes (glass bottom, single or divided)</td>
			<td>MatTek; Cell Vis</td>
			<td>P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) 
			X000NOK1OJ (Cellvis)</td>
			<td>Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>633029, 633031, 633033, 633035, 633037</td>
			<td>circles, 0.13&#8211;0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Alternative for L15 media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Sportsman</td>
			<td>1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40008A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>grade 3MM chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (blunt)</td>
			<td>Fisher Scientific; Thomas Scientific</td>
			<td>08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td>Free image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold)</td>
			<td>Vector Laboratories; Thermofisher Scientific</td>
			<td>H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td>10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>VWR (or similar)</td>
			<td></td>
			<td>60 mm, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>multiple flurophores available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td>For tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (dissection)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td>35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>Variety of sources</td>
			<td></td>
			<td>0.01&#34; diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures

Under ryggradsdjurens utveckling migrerar neurala vapenceller (NCC) i stor utsträckning och differentieras till olika celltyper som bidrar till strukturer som kraniofacialt skelett och det perifera nervsystemet. Även om det är viktigt att förstå NCC-migration i samband med ett 3D-embryo, underlättar isolering av migrerande celler i 2D-odling visualisering och funktionell karakterisering, vilket kompletterar embryonala studier. Detta protokoll demonstrerar en metod för att isolera kycklingkraniala neurala veck för att generera primära NCC-kulturer. Migrerande NCC kommer ut från neurala vikplantor pläterade på ett fibronektinbelagt substrat. Detta resulterar i spridda, vidhäftande NCC-populationer som kan bedömas genom färgning och kvantitativa morfologiska analyser. Denna förenklade kulturmetod är mycket anpassningsbar och kan kombineras med andra tekniker. Till exempel kan NCC-emigrations- och migrationsbeteenden utvärderas genom time-lapse-avbildning eller funktionellt frågas genom att inkludera hämmare eller experimentella manipuleringar av genuttryck (t.ex. DNA, morfolino eller CRISPR-elektroporering). På grund av sin mångsidighet ger denna metod ett kraftfullt system för att undersöka kranial NCC-utveckling.

En översikt över detta protokoll visas i figur 1. De inkuberade äggen öppnades och äggulan, med embryot på ytan, isolerades genom att försiktigt hälla i handflatan på en handske (figur 2A,B). Efter att ha rensat bort albuminet (figur 2C) applicerades filterpappersramar på äggulans membran som omger embryot för att underlätta skärning och lyftning av embryot från äggulan, som börjar spillas bort när...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Detta mångsidiga protokoll beskriver isoleringen av premigrativa neurala vapenceller (NCC) genom excision av kraniala neurala veck från kycklingembryon. Vid plätering och inkubation uppstår migrerande NCC från neurala vikplantor, vilket möjliggör bedömning av cellmorfologi och migration i en förenklad 2D-miljö.

Beredning och morfologisk analys av kycklingkraniala neurala vapencellkulturer

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Neurala vapenceller emigrerar från kraniala neurala veck i embryon eller när de placeras i odling. Detta ger en bekväm metod för att isolera primära migrerande neurala vapenceller utan celldissociation. Medan neural crest-migration vanligtvis sker inom den tredimensionella embryonala miljön, möjliggör tvådimensionell kultur visualisering och undersökning av migrationsrelaterade processer.Även om kraniala neurala vikodlingsprotokoll finns, kräver denna metod träning och organismspecifika steg. Denna video visar tekniker för att underlätta reproducerbar beredning av kycklingkraniala neurala vikkulturer. Nybörjare kämpar ofta med att dissekera och plätera neurala veck och bedöma kulturresultat.Genom att följa riktlinjerna för dissektion och tillämpa den morfometriska analys som beskrivs här kan konsekventa, kvantitativa resultat erhållas. För att börja, placera de befruktade äggen i upprätt läge inuti en fuktad inkubator vid 38 grader Celsius. Efter att ha tagit bort äggen från inkubatorn, desinficera skalen genom att spruta 70% etanol noggrant och låta dem torka.För fixering och färgning av kulturerna, använd glasskyddsslipsar placerade i en vävnadsodlingsskål med flera brunnar och pipettera tillräckligt med fibronektinlösning för att täcka botten av brunnen. Byt sedan ut locket och inkubera plattan med fibronektinlösning i en fuktad inkubator vid 38 grader Celsius i minst en timme medan du dissekerar neurala veck. Använd trubbiga tångar för att sticka ett litet hål i skalet vid 1/4 till 1/3 av äggets längd.Sätt försiktigt in de trubbiga tångarna i det lilla hålet och se till att inte störa äggulan. Skär sedan genom äggskalet runt ägget, ta bort toppen av äggskalet och placera embryot för isolering. Förbered embryot genom att försiktigt använda den plana kanten av slutna trubbiga tångar för att torka bort eventuellt överskott av albumin på äggulans yta som täcker embryot.Använd pincett för att placera en filterpappersstödram över embryot, med embryot i ramens fönster. Tryck försiktigt ner filterpapperet för att fästa vid äggulan. Klipp runt utsidan av filterpappersramen med dissektionssax.Använd pincett eller saxspetsar för att ta tag i ramens kant och lyft försiktigt embryot bort från äggulan. Placera embryot med pappersramens sida nedåt i en 60 eller 100 ml petriskål fylld med Ringers med pennstrep. Förvara skålen med embryon på is om du samlar dem för en RNA- eller proteinkänslig nedströmsapplikation.Överför ett embryo till en ren skål som innehåller Ringers penna-strep-lösning. Swisha försiktigt embryot fram och tillbaka för att rensa bort eventuell äggula som skymmer utsikten och byt ut Ringers pennstrep-lösning eller överför den till en ny skål om den blir grumlig. Placera embryots dorsala och ramsida uppåt under ett dissekerande mikroskop.Lämna embryot på pappersramen för att hålla det sträckt och hålls på plats. Ta sedan bort vitellinmembranet med hjälp av pincett för att exponera nervvecken. Inkludera vävnadskaudal till de expanderande optiska vesiklarna och rostral till bakhjärnan, där rhombomerförträngningar just börjar dyka upp.Använd fjädersaxen och skär försiktigt ut midbrain neurala veck. Var noga med att skära ut den dorsala aspekten av neuralvecket med minimal förorening av neuralröret och icke-neural ektoderm och överför neurala veck till en ren skål som innehåller Ringers penna-strep-lösning med en P20-pipettor eller en pasteurpipett av sterilt glas sköljd med yolky Ringers penna-strep-lösning. Förvara uppsamlade veck på is medan du dissekerar ytterligare veck.Efter att ha tagit bort odlingsskålen från inkubatorn, använd en pipettor eller Pasteur-pipett för att ta bort fibronektinlösningen från täckglidningar, skål eller brunn. Efter sköljning av det fibronektinbelagda substratet med Ringers penn-strep-lösning, tillsätt en lämplig volym komplett odlingsmedium till skålen eller brunnen. För att blockera plasten och förhindra att vävnaden fastnar, använd en P20- eller P200-pipett och skölj pipettspetsen med yolky Ringers penn-strep-lösning.Överför sedan de isolerade neurala vecken mot mitten av den fibronektinbelagda täckglidningen och var noga med att överföra så lite Ringers penna-strep-lösning som möjligt. Efter att ha låtit explanterna sätta sig i 10 till 15 minuter, placera dem i en fuktad kammare vid 38 grader Celsius genom att långsamt och försiktigt bära odlingsskålen med pläterade neurala veck. Ta bort odlingsmediet med en Pasteur-pipett och skölj brunnarna med filtersteriliserad PBS.Tillsätt 4% paraformaldehyd och förvara den på en plattformsskakare i 15 minuter vid rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen, ta bort paraformaldehyd, skölj brunnarna tre gånger med PBS och tillsätt PBST innehållande 5% serum. Nu pipetterar du 30 mikroliter 200-nanomolar Oregon Green konjugerat falloidin på en slät yta för varje täckglidning.Använd ett par pincett, ta bort lockglidningen från PBST som innehåller 5% serum, vilket säkerställer orienteringen av cellerna uppåt. Transportera bort överflödig vätska genom att kort röra vid täckglidens kant till en känslig uppgiftstorkare. Placera försiktigt varje lock glidcellssida ner på droppen av utspädd falloidin och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.Efter inkubationsperioden, lyft lockglidningen från färgningslösningen och placera den tillbaka i odlingsskålen och vänd den så att cellsidan är uppe. Se till att täcka locket med PBST och placera det på en plattformsskakare i 10 minuter, håll locket täckt och i mörkret. Ta bort PBST och upprepa tvätten av locket två gånger för totalt tre 10-minuters tvättar.Placera en droppe monteringsmedia på ett mikroskopglas. Montera lockets glidcellssida nedåt genom att långsamt sänka lockglidningen i en vinkel på monteringsmediet för att undvika att skapa bubblor och låt mediet ställas in innan du bildar. Slutligen avbilda de färgade cellerna och exportera dem som TIFF-filer.De neurala vapencellerna började dyka upp från vidhäftande neurala veck explants inom tre till fyra timmar efter inkubation, och migrationen slutfördes efter cirka 20 timmar. De migrerande neurala vapencellerna märktes med HNK-1, och de flesta celler verkade vara HNK-1-positiva. De migrerade neurala vapencellerna visualiserades genom färgning av trådformigt aktin med falloidin.Bilder av de falloidfärgade cellerna bearbetades med ImageJ för att producera en tröskelbild där celler verkade svarta med vit bakgrund. Tröskelbilden analyserades och olika mätningar visades i kontrasterande stapeldiagram eller fioldiagram. Till exempel var den genomsnittliga ytan för de 69 analyserade cellerna cirka 802,11 kvadratmeter, från 60,27 till 2 664,53 kvadratmeter.Cirkularitet återspeglar cellens utbredning och sträcker sig från 0,101 till 0,875. De lägre värdena indikerar en långsträckt form, medan ett värde på en indikerar en perfekt cirkel. De flesta celler uppvisade en långsträckt form, som lättast ses i fiolplottet.Migrerande neurala vapenceller i detta fält hade ett genomsnittligt bildförhållande på cirka 2,13, och ett bildförhållande på en indikerar en symmetrisk form. Noggrann excision och explantplätering är avgörande för framgångsrika kulturer. Låt neurala veck sätta sig ner med snittsidan nedåt i 10 till 15 minuter och överför sedan långsamt till inkubatorn för att uppmuntra vidhäftning.Variationer på dessa tekniker inkluderar övergående genetisk manipulation före odling och time-lapse-avbildning under inkubation. Dessutom möjliggör detta protokoll insamling av premigrerande och migrerande neurala crestcellpopulationer för analys på omics-nivå.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiering av en mänsklig Neural Stem Cell Line den Tredimensionell kulturer, Analys av MicroRNA och Förmodade målgenerna

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dubbel märkning av neurala vapenceller och blodkärl i kycklingembryon med chickGFP neuralrör ympning och karbalybocyanin färgämne dii injektion

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Leverans av<em&gt; In Vivo</em&gt; Akut intermittent hypoxi i neonatal Gnagare Prime subventrikulära zonen-härledda neurala stamceller kulturer

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Framåt Genetisk strategi för Avslöja Stress resistensgener i möss - En hög kapacitet skärm i ES-celler

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generation av genetiskt modifierade Organotypiska Skin kulturer Använda devitaliserad Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Odling av humana pluripotenta och neurala stamceller i en sluten cellodlingssystem för Basic och preklinisk forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Etablering av proliferativ tetraploid celler från icke-transforme humanfibroblaster

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Flera Photon Time Lapse Imaging att visualisera utvecklingen i realtid: visualisering av migrera Neural Crest celler hos zebrafiskar embryon

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika Virus infektion av odlade mänskliga fostrets hjärnan neurala stamceller för Immunocytochemical analys

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering av tangentiella cellmigration i den framkallande Chick fiberoptiska Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...