Name: preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures
Uploaded: 2022-06-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

Civciv kafatası nöral kıvrım kültürü protokolümüzün versiyonunun geliştirilmesine katılan Corinne A. Fairchild ve Katie L. Vermillion'a teşekkür ederiz.

Beyaz Leghorn, Golden Sex Link veya Rhode Island Red dahil olmak üzere her türlü Gallus gallus ırkı kullanılabilir. Bu çalışmada kullanılan tavuk yumurtaları çeşitli ırklara aitti ve yerel çiftlikler ve kuluçkahaneler de dahil olmak üzere birçok kaynaktan elde edildi.
1. Çözeltilerin ve malzemelerin hazırlanması
<ol><li>123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl 2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na2 HPO 4 ve 0,147 mM KH2PO4'ü</su...

<ol>
	<li>Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+border:+Induction,+specification+and+maturation+of+the+territory+that+generates+neural+crest+cells.">The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells.</a> Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).</li><li>Tang, W., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+lineage+analysis:+From+past+to+future+trajectory.">Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory.</a> Development. 147 (20), (2021).</li><li>Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+different+migration+strategies+as+viewed+from+the+neural+crest.">Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+bulldoze+through+the+microenvironment+using+Aquaporin+1+to+stabilize+filopodia.">Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia.</a> Development. 147 (1), 185231 (2020).</li><li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+fragment+C3a+controls+mutual+cell+attraction+during+collective+cell+migration.">Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration.</a> Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).</li><li>Giovannone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slits+affect+the+timely+migration+of+neural+crest+cells+via+robo+receptor.">Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor.</a> Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).</li><li>Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+methylation+is+essential+for+neural+crest+migration.">Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration.</a> Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).</li><li>Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongator+Protein+3+(Elp3)+stabilizes+Snail1+and+regulates+neural+crest+migration+in+Xenopus.">Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Gonzalez Malagon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3+controls+migration+of+the+neural+crest+lineage+in+mouse+and+Xenopus.">Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).</li><li>Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+promotes+neural+crest+migration+via+yap/tead+signaling.">Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling.</a> Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).</li><li>Jacques-Fricke, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+NSD3-dependent+neural+crest+gene+expression+reveals+known+and+novel+candidate+regulatory+factors.">Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors.</a> Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).</li><li>Bronner-Fraser, M., Garc&#237;a-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+manipulations+of+neural+crest+cells+or+their+migratory+pathways.">Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways.</a> Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation.">Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).</li><li>Malagon, S. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+culture+and+analysis+of+primary+cranial+neural+crest+cells+from+mouse+for+the+study+of+neural+crest+cell+delamination+and+migration.">Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+delamination+and+migration:+From+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration.">Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).</li><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus.">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryological+and+genetic+manipulation+of+chick+development.">Embryological and genetic manipulation of chick development.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).</li><li>Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phalloidin+binding+site+of+F-actin.">The phalloidin binding site of F-actin.</a> The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).</li><li>Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+stages+of+trunk+neural+crest+migration+in+avian+embryos+using+monoclonal+antibody+HNK-1.">Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1.</a> Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations.">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations.</a> Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).</li><li>Haupt, A., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+their+own+shape+-+mechanisms+to+probe+cell+geometry+and+their+implications+in+cellular+organization+and+function.">How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li><li>Ezin, M., Fraser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+time-lapse+imaging+of+the+early+avian+embryo.">Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+live+imaging+of+avian+embryos.">In ovo live imaging of avian embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).</li><li>McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+neural+crest+cell+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+the+chick+embryo.">Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo.</a> Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).</li><li>Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+cranial+neural+crest+cells+release+extracellular+vesicles+that+are+critical+for+their+migration.">Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration.</a> Journal of Cell Science. , (2022).</li><li>Williams, R., Sauka-Spengler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+ovo+electroporation+of+early+chicken+embryos.">Ex ovo electroporation of early chicken embryos.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).</li><li>Moulton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+morpholinos+to+control+gene+expression.">Using morpholinos to control gene expression.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).</li><li>Gandhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-plasmid+approach+for+genome+editing+coupled+with+long-term+lineage+analysis+in+chick+embryos.">A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos.</a> Development. 148 (7), (2021).</li><li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+Global+Neural+Crest+Gene+Regulatory+Network+In+Vivo.">Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo.</a> Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).</li></ol>

Burada açıklanan teknik, civciv nöral kıvrımlarını izole etmek ve göçmen kraniyal NCC'lerin kültürlerini oluşturmak için bunları kaplamak için uyarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu kültürler, civciv NCC migrasyonunun ve morfolojisinin kolay analizi için basitleştirilmiş 2D koşullar sağlar ve bu da ovo görüntüleme yöntemlerinde teknik olarak daha zorluolabilir 24,25,26. Bu in vitro yön...

Nöral krest hücreleri (NCC'ler) omurgalı embriyolarında geçici bir hücre popülasyonudur. NCC'ler nöral plakanın sınırlarında belirtilir ve dorsal nöral tüp1'den göç etmek için epitel-mezenkimal geçişe (EMT) uğrar. EMT'den sonra, NCC'ler embriyo boyunca yoğun bir şekilde dağılır, sonuçta kraniyofasiyal iskelet, kalbin çıkış yolu ve periferik sinir sisteminin çoğunluğu dahil olmak üzere çeşitli yapılara farklılaşır ve katkıda bulunur2. Hücre polaritesindeki, hücre iskeletindeki ve yapışma özelliklerindeki değişiklikler, bu göçmenlikten göçmen hücre popülasyonunageçişin altında yatmaktadır 3. NCC EMT ve göçün incelenmesi, hücre hareketliliğinin temel mekanizmaları hakkında fikir verir ve doğum kusurlarını ve kanser metastazını önleme ve tedavi etme çabalarını bilgilendirir.
İn vivo analiz, NCC gelişimsel süreçlerini embriyonik bir bağlamda anlamak için hayati önem taşırken, in vitro yöntemler ek deneysel yolları kolaylaştıran görsel ve fiziksel erişilebilirlik sunar. Basitleştirilmiş bir 2D ortamda, NCC morfolojisi, sitoiskelet yapıları ve göç edilen mesafe değerlendirilebilir. Ayrıca, genetik veya çözünür faktör pertürbasyonunun hareketli NCC'lerin göç davranışları üzerindeki etkileri analiz edilebilir 4,5,6,7,8,9,10. Ek olarak, izole edilmiş premigratory veya migratory NCC'ler toplanabilir, bir araya getirilebilir ve proteomik, transkriptomik ve epigenomik profilleme yoluyla NCC'lerin gelişimsel düzenlemesini incelemek için yüksek verimli metodolojiler için kullanılabilir 7,11. Çeşitli gelişimsel model organizmalardan12,13,14 kraniyal NCC'lerin hazırlanması için yöntemler mevcut olsa da, bu makale civciv embriyolarından kraniyal NCC kültürünü ilk öğrenenler için yaklaşımın mekaniğini göstermektedir.
Mevcut protokol, civciv kafatası NCC kültürlerini hazırlamak için çok yönlü bir tekniği tanımlamaktadır (Şekil 1). NCC'ler ekşi nöral kıvrımlardan bir kültür substratına kolayca göç ettiğinden, civciv NCC'ler doğal olarak embriyonik dokudan ayrılır ve birincil kültürler kolayca üretilir. Orta beyin NCC'leri kraniyal nöral kıvrımlardan toplu olarak göç ederken (gövde15'teki uzun süreli, hücre hücre delaminasyonunun aksine), bu kültürler esas olarak göçmen kraniyal nöral krest hücrelerinden oluşur ve ilk nöral kıvrım eksizyonu premigrasyon NCC'ler için bir toplama yöntemi sağlar. Civciv kraniyal nöral kıvrımlarının diseksiyonu ve kültürlenmesi için temel bir yöntem detaylandırılmıştır ve bu yöntemin farklı uygulamaları ve varyasyonları için öneriler sunulmaktadır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig01v2.jpg"> Şekil 1: Civciv kafatası nöral kıvrım kültürü protokolüne şematik genel bakış. (A,B) Kraniyal nöral kıvrımlar (mavi ile özetlenmiş) beş somitli bir civciv embriyosundan eksize edilir (A'da dorsal görünümde gösterilmiştir). Gri bantlar, kalp hilali. (C) Fibronektin üzerine kaplandığında, göçmen nöral krest hücreleri nöral kıvrımlardan ortaya çıkar ve substrat üzerine dağılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63799/63799fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber dishes (glass bottom, single or divided)</td>
			<td>MatTek; Cell Vis</td>
			<td>P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) 
			X000NOK1OJ (Cellvis)</td>
			<td>Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>633029, 633031, 633033, 633035, 633037</td>
			<td>circles, 0.13&#8211;0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Alternative for L15 media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Sportsman</td>
			<td>1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40008A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>grade 3MM chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (blunt)</td>
			<td>Fisher Scientific; Thomas Scientific</td>
			<td>08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td>Free image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold)</td>
			<td>Vector Laboratories; Thermofisher Scientific</td>
			<td>H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td>10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>VWR (or similar)</td>
			<td></td>
			<td>60 mm, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>multiple flurophores available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td>For tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (dissection)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td>35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>Variety of sources</td>
			<td></td>
			<td>0.01&#34; diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and morphological analysis of chick cranial neural crest cell cultures

Omurgalı gelişimi sırasında, nöral krest hücreleri (NCC'ler) yoğun bir şekilde göç eder ve kraniyofasiyal iskelet ve periferik sinir sistemi gibi yapılara katkıda bulunan çeşitli hücre tiplerine farklılaşır. NCC göçünü bir 3D embriyo bağlamında anlamak kritik olsa da, 2D kültürde göçmen hücrelerin izole edilmesi, embriyonik çalışmaları tamamlayarak görselleştirmeyi ve fonksiyonel karakterizasyonu kolaylaştırır. Mevcut protokol, primer NCC kültürleri oluşturmak için civciv kraniyal nöral kıvrımlarını izole etmek için bir yöntem göstermektedir. Göçmen NCC'ler, fibronektin kaplı bir substrat üzerine kaplanmış nöral kıvrımlı eksplantlardan ortaya çıkar. Bu, boyama ve kantitatif morfolojik analizlerle değerlendirilebilen dağınık, yapışkan NCC popülasyonları ile sonuçlanır. Bu basitleştirilmiş kültür yaklaşımı son derece uyarlanabilir ve diğer tekniklerle birleştirilebilir. Örneğin, NCC göçü ve göç davranışları, hızlandırılmış görüntüleme ile değerlendirilebilir veya inhibitörler veya gen ekspresyonunun deneysel manipülasyonları (örneğin, DNA, morfolino veya CRISPR elektroporasyonu) dahil edilerek fonksiyonel olarak sorgulanabilir. Çok yönlülüğü nedeniyle, bu yöntem kraniyal NCC gelişimini araştırmak için güçlü bir sistem sağlar.

Mevcut protokole genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Kuluçkaya yatırılan yumurtalar açıldı ve yumurta sarısı, embriyo yüzeyde olacak şekilde, eldivenli bir elin avucuna hafifçe dökülerek izole edildi (Şekil 2A, B). Albümin temizlendikten sonra (Şekil 2C), embriyonun sarıdan kesilmesini ve kaldırılmasını kolaylaştırmak için embriyoyu çevreleyen yumurta sarısı zarına filtre kağ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures at JoVE.com

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Bu çok yönlü protokol, civciv embriyolarından kraniyal nöral kıvrımların eksizyonu yoluyla göç öncesi nöral krest hücrelerinin (NCC'ler) izolasyonunu tanımlar. Kaplama ve inkübasyon üzerine, göçmen NCC'ler nöral kıvrım eksplantlarından ortaya çıkar ve basitleştirilmiş bir 2D ortamda hücre morfolojisinin ve göçünün değerlendirilmesine izin verir.

Civciv Kraniyal Nöral Kret Hücre Kültürlerinin Hazırlanması ve Morfolojik Analizi

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Nöral krest hücreleri, embriyolardaki kraniyal nöral kıvrımlardan veya kültüre yerleştirildiğinde göç eder. Bu, hücre ayrışması olmadan birincil göçmen nöral krest hücrelerini izole etmek için uygun bir yöntem sağlar. Nöral krest göçü tipik olarak üç boyutlu embriyonik ortamda meydana gelirken, iki boyutlu kültür, göçle ilgili süreçlerin görselleştirilmesini ve araştırılmasını sağlar.Kraniyal nöral kıvrım kültürü protokolleri mevcut olmasına rağmen, bu yöntem eğitim ve organizmaya özgü adımlar gerektirir. Bu video, civciv kraniyal nöral kıvrım kültürlerinin tekrarlanabilir hazırlanmasını kolaylaştırma tekniklerini göstermektedir. Yeni başlayanlar genellikle nöral kıvrımları parçalara ayırmak ve kaplamak ve kültür sonuçlarını değerlendirmek için mücadele ederler.Diseksiyon kılavuzlarını takip etmek ve burada açıklanan morfometrik analizi uygulamak tutarlı, nicel sonuçların elde edilmesini sağlar. Başlamak için, döllenmiş yumurtaları nemlendirilmiş bir inkübatörün içine 38 santigrat derecede dik bir konuma getirin. Yumurtaları inkübatörden çıkardıktan sonra,% 70 etanol püskürterek ve kurumasını sağlayarak kabukları dezenfekte edin.Kültürleri sabitlemek ve boyamak için, çok kuyulu bir doku kültürü kabına yerleştirilmiş cam kapak fişleri ve kuyunun tabanını örtmek için yeterli fibronektin çözeltisi pipet kullanın. Daha sonra, kapağı değiştirin ve nöral kıvrımları parçalara ayırırken plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde en az bir saat boyunca 38 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Yumurta uzunluğunun 1/4 ila 1/3'ünde kabukta küçük bir delik açmak için künt forseps kullanın.Künt forsepsleri dikkatlice küçük deliğe yerleştirin ve yumurta sarısını bozmadığınızdan emin olun. Daha sonra, yumurta kabuğunu yumurtanın etrafından kesin, yumurta kabuğunun üstünü çıkarın ve embriyoyu izolasyon için konumlandırın. Embriyoyu, yumurta sarısının embriyoyu kaplayan yüzeyindeki fazla albümini silmek için kapalı künt forsepslerin düz kenarını nazikçe kullanarak hazırlayın.Embriyonun üzerine, embriyo çerçevenin penceresinde olacak şekilde bir filtre kağıdı destek çerçevesi yerleştirmek için forseps kullanın. Yumurta sarısına yapışmak için filtre kağıdına hafifçe bastırın. Filtre kağıdı çerçevesinin dışını diseksiyon makası ile kesin.Çerçevenin kenarını kavramak için forseps veya makas uçları kullanın ve embriyoyu yumurta sarısından yavaşça kaldırın. Embriyoyu, kağıt çerçeve tarafı aşağı bakacak şekilde, kalem strepli Ringer's ile doldurulmuş 60 veya 100 mililitrelik bir Petri kabına yerleştirin. RNA veya proteine duyarlı bir aşağı akış uygulaması için toplanırsa, embriyo kabını buz üzerinde tutun.Bir embriyoyu Ringer'ın kalem strep çözeltisini içeren temiz bir kaba aktarın. Görüşü gizleyen yumurta sarısını temizlemek için embriyoyu nazikçe ileri geri sallayın ve Ringer'ın kalem strep çözeltisini değiştirin veya bulanıklaşırsa taze bir kaba aktarın. Embriyo sırtını ve çerçeve tarafını diseksiyon mikroskobu altında yukarı doğru yerleştirin.Embriyoyu gerilmiş ve yerinde tutmak için kağıt çerçevenin üzerinde bırakın. Ardından, nöral kıvrımları açığa çıkarmak için forseps kullanarak vitelin zarını çıkarın. Genişleyen optik veziküllere doku kaudalini ve eşkenar dörtgen daralmalarının yeni ortaya çıkmaya başladığı arka beyne rostral ekleyin.Yaylı makas kullanarak, orta beyin nöral kıvrımlarını dikkatlice tüketin. Nöral tüpün minimum kontaminasyonu ve nöral olmayan ektoderm ile nöral kıvrımın en dorsal yönünü eksize etmeye özen gösterin ve nöral kıvrımları, bir P20 pipetör veya sarılı Ringer'ın kalem strep çözeltisi ile durulanmış steril bir cam Pasteur pipet kullanarak Ringer'ın kalem strep çözeltisini içeren temiz bir kaba aktarın. Ek kıvrımları parçalara ayırırken toplanan kıvrımları buz üzerinde saklayın.Kültür kabını inkübatörden çıkardıktan sonra, fibronektin çözeltisini kapak kaymalarından, tabaklardan veya kuyudan çıkarmak için bir pipettor veya Pasteur pipet kullanın. Fibronektin kaplı substratı Ringer'ın kalem strep çözeltisi ile duruladıktan sonra, tabağa veya kuyuya uygun miktarda tam kültür ortamı ekleyin. Plastiği bloke etmek ve dokunun yapışmasını önlemek için bir P20 veya P200 pipetleyici kullanın ve pipet ucunu sarılı Ringer'ın kalem strep çözeltisiyle durulayın.Daha sonra, izole edilmiş nöral kıvrımları fibronektin kaplı kapak kaymasının merkezine doğru aktarın ve mümkün olduğunca az Ringer'ın kalem strep çözeltisini aktarmaya özen gösterin. Eksplantların 10 ila 15 dakika boyunca yerleşmesine izin verdikten sonra, kültür kabını kaplanmış nöral kıvrımlarla yavaşça ve dikkatlice taşıyarak 38 santigrat derecede nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. Kültür ortamını bir Pasteur pipetle çıkarın ve kuyucukları filtre ile sterilize edilmiş PBS ile durulayın.% 4 paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir platform çalkalayıcıda tutun. Kuluçkanın sonunda, paraformaldehiti çıkarın, kuyucukları PBS ile üç kez durulayın ve% 5 serum içeren PBST ekleyin. Şimdi, pipet 30 mikrolitre 200-nanomolar Oregon Green, her kapak kayması için pürüzsüz bir yüzeye falloidin konjuge etti.Bir çift forseps kullanarak,% 5 serum içeren PBST'den kapak kaymasını çıkarın ve hücrelerin yukarı bakacak şekilde yönlendirilmesini sağlayın. Kapak kaymasının kenarına hassas bir görev sileceğine kısaca dokunarak fazla sıvıyı uzaklaştırın. Her bir kapak kayma hücresini, seyreltilmiş falloidin damlasının üzerine yavaşça yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.Kuluçka döneminden sonra, kapak kaymasını boyama çözeltisinden kaldırın ve tekrar kültür kabına yerleştirin, hücre tarafı yukarı bakacak şekilde ters çevirin. Kapak kaymasını PBST ile örttüğünüzden emin olun ve kapak fişlerini kapalı ve karanlıkta tutarak 10 dakika boyunca bir platform çalkalayıcıya yerleştirin. PBST'yi çıkarın ve toplam üç 10 dakikalık yıkama için kapak kaymalarını iki kez yıkamayı tekrarlayın.Bir damla montaj ortamını mikroskop slaydına yerleştirin. Kabarcıklar oluşmasını önlemek için kapak kaymasını montaj ortamına bir açıyla yavaşça indirerek kapak kayma hücresini yan yana doğru yerleştirin ve görüntülemeden önce ortamın ayarlanmasına izin verin. Son olarak, lekeli hücreleri görüntüleyin ve bunları TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.Nöral krest hücreleri, inkübasyondan sonraki üç ila dört saat içinde yapışkan nöral kıvrım eksplantlarından çıkmaya başladı ve yaklaşık 20 saat sonra göç tamamlandı. Göçmen nöral krest hücreleri HNK-1 kullanılarak etiketlendi ve çoğu hücrenin HNK-1 pozitif olduğu ortaya çıktı. Göç eden nöral krest hücreleri, filamentli aktinin falloidin ile boyanmasıyla görselleştirildi.Falloidin lekeli hücrelerin görüntüleri, hücrelerin beyaz bir arka planla siyah göründüğü bir eşik görüntüsü üretmek için ImageJ kullanılarak işlendi. Eşik görüntüsü analiz edildi ve kontrast çubuk grafiklerde veya keman grafiklerinde çeşitli ölçümler görüntülendi. Örneğin, analiz edilen 69 hücrenin ortalama alanı, 60.27 ila 2.664.53 mikrometre kare arasında değişen yaklaşık 802.11 mikrometre kareydi.Dairesellik, hücrenin çıkıntısını yansıtır ve 0.101 ila 0.875 arasında değişir. Alt değerler uzatılmış bir şekli gösterirken, birinin değeri mükemmel bir daireyi gösterir. Çoğu hücre, keman arsasında en kolay görülen uzun bir şekil sergiledi.Bu alandaki göçmen nöral krest hücreleri ortalama en boy oranı yaklaşık 2.13'tü ve birinin en boy oranı simetrik bir şekli gösteriyordu. Dikkatli eksizyon ve eksplant kaplama, başarılı kültürler için çok önemlidir. Nöral kıvrımların 10 ila 15 dakika boyunca kesilmiş tarafa çökmesine izin verin ve daha sonra yapışmayı teşvik etmek için yavaşça inkübatöre aktarın.Bu tekniklerdeki varyasyonlar, kültürleme öncesi geçici genetik manipülasyonu ve inkübasyon sırasında hızlandırılmış görüntülemeyi içerir. Ek olarak, bu protokol omik düzeyinde analiz için premigrasyon ve migrasyon nöral krest hücre popülasyonlarının toplanmasına izin verir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

ChickGFP Nöral Tüp Greftleme ve Karbosiyanine Boya DiI Enjeksiyonu Kullanılarak Tavuk Embriyoları İçinde Nöral Kret Hücrelerinin ve Kan Damarlarının Çift Etiketlenimi

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Teslimatı<em&gt; İn Vivo</em&gt; Akut Aralıklı hipoksi Yenidoğan Kemirgenler Başbakan subventricular bölgesi kökenli Sinir Progenitör Hücre Kültürleri için

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

İleri Genetik Yaklaşım Farelerde Stres Direnci Genler ortaya çıkarmak için - ES Hücrelerde bir Yüksek verim Ekranı

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Transforme İnsan Fibroblastlar gelen Proliferatif Tetraploid Hücreleri kurulması

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Kültürlü insan Fetal beyin sinir kök hücreleri Zika virüs enfeksiyonu Immunocytochemical analiz için

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...