Name: teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل صندوق الحدود الجديدة في الأبحاث (NFRFE201901326) ، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (162211 ، 461274 ، 461275) ، والمؤسسة الكندية للابتكار (37439) ، وبرنامج كرسي الأبحاث الكندي (950-231859) ، ومجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (RGPIN-2019-06824) ، وصندوق أبحاث الطبيعة والتقنيات في كيبيك (253380).

وافقت لجان رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة مونتريال (# 22053 ، # 22054) على جميع إجراءات الحيوانات. انظر الجدول 1 للحصول على قائمة بالمحاليل وتكوينها وجدول المواد للحصول على قائمة بالمواد والمعدات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. عزل الخلايا ا?...

<ol>
	<li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain.">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li><li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia.">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li><li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors.">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li><li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology.">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li><li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity.">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li><li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis.">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li><li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier.">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li><li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor.">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li><li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury.">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333 (2021).</li><li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis.">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li><li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation.">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li><li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism.">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li></ol>

وجد Davies et al.11 أن الخلايا العصبية المصابة تنظم RAE1. من خلال الاتصال بالخلايا الخلوية ، تمكنت خلايا NKG2D التي تعبر عن NKG من تحديد الخلايا العصبية RAE1 + والقضاء عليها ، والتي بدورها تحد من الألم المزمن11. بالنظر إلى أن الخلايا القاتلة الطبيعية تعبر أيضا عن مستقب?...

تنشأ الأجسام الخلوية للخلايا العصبية الحسية في العقد الجذرية الظهرية (DRG). تقع DRG في الجهاز العصبي المحيطي (PNS) ، بين القرن الظهري للحبل الشوكي وأطراف الأعصاب الطرفية. تسمح الطبيعة الزائفة أحادية القطب للخلايا العصبية DRG بنقل المعلومات من الفرع المحيطي ، الذي يعصب الأنسجة المستهدفة ، إلى الفرع المركزي ، الذي يحمل المعلومات الحسية الجسدية إلى الحبل الشوكي1. باستخدام مستقبلات القناة الأيونية المتخصصة ، تستشعر الخلايا العصبية من الدرجة الأولى التهديدات التي تشكلها مسببات الأمراض والمواد المسببة للحساسية والملوثات2 ، مما يؤدي إلى تدفق الكاتيونات (Na + ، Ca2+) وتوليد جهد الفعل3،4،5.
ترسل هذه الخلايا العصبية أيضا إمكانات عمل مضادة للدروم نحو المحيط ، حيث حدث استشعار الخطر الأولي ، مما يؤدي إلى الإطلاق المحلي للببتيدات العصبية 1,4. لذلك ، تعمل الخلايا العصبية مستقبلات الألم كآلية وقائية ، تنبه المضيف إلى الخطر البيئي4،5،6،7.
للتواصل مع الخلايا العصبية من الدرجة الثانية ، تطلق مستقبلات الألم العديد من الناقلات العصبية (مثل الغلوتامات) والببتيدات العصبية (على سبيل المثال ، الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) ، والمادة P (SP) ، والببتيد المعوي النشط في الأوعية (VIP))6,7. تعمل هذه الببتيدات على الشعيرات الدموية وتعزز تسرب البلازما والوذمة والتدفق المحلي وتعديل الخلايا المناعية2،4،7.
يستخدم الجهاز الحسي الجسدي والجهاز المناعي نظام اتصال مشترك يتكون من السيتوكينات والببتيدات العصبية ، ومستقبلاتها المشابهة4. في حين أن هذا الاتصال ثنائي الاتجاه يساعد على الحماية من الخطر والحفاظ على التوازن ، فإنه يمكن أن يساهم أيضا في الفيزيولوجيا المرضيةللأمراض 4.
تصنف الخلايا القاتلة الطبيعية على أنها خلايا لمفاوية فطرية وهي متخصصة في القضاء على الخلايا المصابة بالفيروس. تخضع وظيفة الخلية القاتلة الطبيعية لتوازن المستقبلات التحفيزية والمثبطة ، بما في ذلك المستقبل المنشط NKG2D8. يتم التعبير عن الرباط الداخلي ل NKG2D ، حمض الريتينويك المحرض المبكر 1 (RAE1) ، من خلال الخلايا التي تخضع للإجهاد مثل تكوين الورم والعدوى 8,9.
أظهرت التحقيقات الحديثة أن إصابة الأعصاب الطرفية تدفع الخلايا العصبية الحسية للتعبير عن جزيئات غير قادرة على التكيف مثل stathmin 2 (STMN2) و RAE1. وهكذا ، عن طريق الاتصال بالخلية الخلوية ، تم تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية المعبرة عن NKG2D عن طريق التفاعل مع الخلايا العصبية المعبرة عن RAE1. في المقابل ، تمكنت الخلايا القاتلة الطبيعية من القضاء على الخلايا العصبية المصابة مستقبلات الألم وفرط الحساسية الحاد للألم المرتبط عادة بإصابة الأعصاب10. بالإضافة إلى محور NKG2D-RAE1 ، تعبر الخلايا القاتلة الطبيعية عن المستقبلات المشابهة لمختلف الوسطاء الذين ينتجهم مستقبلات الألم. لذلك من الممكن أن يقوم هؤلاء الوسطاء بتعديل نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية. تقدم هذه الورقة طريقة استزراع مشترك للتحقيق في بيولوجيا تفاعل الخلايا العصبية القاتلة الطبيعية مستقبلات للألم. سيساعد هذا النهج في تعزيز فهم كيفية تعديل الخلايا العصبية المستقبلة للألم لاستجابات الخلايا المناعية الفطرية للإصابة أو العدوى أو الورم الخبيث.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 017769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 009669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Cat no: 504167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-mouse NK-1.1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (50 &#956;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: A3160702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphteria toxinfl/fl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: SH3057402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 13-678-20B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 07-200-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: CLS2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 04942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse NKp46</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 03690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 470236-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat no: 02-0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>Cat no: 03-50/31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: A14867-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat no: 13257-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 450-51-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse GM-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 210-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>Cat no: 19855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 108732</td>
			<td>Clone PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 137606</td>
			<td>Clone 29A1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRPV1Cre</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 505406</td>
			<td>Clone MP1-22E9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers and dissection tools.</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Shaped-bottom 96-well plate</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 101319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability Dye eFlour-780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons

تطورت الخلايا العصبية الحسية الجسدية للكشف عن المنبهات الضارة وتنشيط ردود الفعل الدفاعية. من خلال مشاركة وسائل الاتصال ، تقوم الخلايا العصبية المستقبلة للألم أيضا بضبط دفاعات المضيف من خلال التحكم في نشاط الجهاز المناعي. يكون الاتصال بين هذه الأنظمة في الغالب تكيفيا ، مما يساعد على حماية التوازن ، ويمكن أن يؤدي أيضا إلى ظهور الأمراض المزمنة أو يعززها. تطور كلا النظامين معا للسماح بمثل هذا التفاعل المحلي ، كما هو موجود في الأنسجة اللمفاوية الأولية والثانوية والغشاء المخاطي. أظهرت الدراسات الحديثة أن مستقبلات الألم تكتشف وتستجيب مباشرة للمستضدات الأجنبية والسيتوكينات المشتقة من الخلايا المناعية والميكروبات.
لا يؤدي تنشيط مستقبلات الألم إلى فرط الحساسية والحكة فحسب ، بل يقلل من عتبة إطلاق مستقبلات الألم ، مما يؤدي إلى إطلاق الببتيدات العصبية محليا. يمكن للببتيدات التي تنتجها الطرفيات الطرفية لمستقبلات الألم وتنطلق منها أن تمنع الانجذاب الكيميائي واستقطاب الخلايا الليمفاوية ، وتتحكم في توطين الالتهاب ومدته ونوعه. تظهر الأدلة الحديثة أن الخلايا العصبية الحسية تتفاعل مع الخلايا المناعية الفطرية عن طريق الاتصال بالخلايا الخلوية ، على سبيل المثال ، إشراك مستقبلات المجموعة 2D (NKG2D) على الخلايا القاتلة الطبيعية (NK).
بالنظر إلى أن الخلايا القاتلة الطبيعية تعبر عن المستقبلات المشابهة لمختلف الوسطاء الذين ينتجهم مستقبلات الألم ، فمن المتصور أن مستقبلات الألم تستخدم الببتيدات العصبية للتحكم في نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية. هنا ، نبتكر طريقة زراعة مشتركة لدراسة تفاعلات الخلايا العصبية القاتلة الطبيعية في طبق. باستخدام هذا النهج ، وجدنا أن الخلايا العصبية القطنية المستقبلة للألم تقلل من تعبير السيتوكين في الخلايا القاتلة الطبيعية. بشكل عام ، يمكن أن تكون هذه الطريقة الاختزالية مفيدة لدراسة كيفية تحكم الخلايا العصبية المعصبة للورم في الوظيفة المضادة للسرطان للخلايا القاتلة الطبيعية وكيف تتحكم الخلايا القاتلة الطبيعية في القضاء على الخلايا العصبية المصابة.

تم تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية مغناطيسيا من خلايا الطحال في الفئران (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) وتحفيزها (48 ساعة) باستخدام IL-2 و IL-15. ثم تم استزراع الخلايا القاتلة الطبيعية بمفردها أو استزراعها مع الخلايا العصبية DRG التي تم حصادها من الخلايا العصبية المستقبلة للألم سليمة (التحكم في القمام?...

Watch this Scientific Journal Video about Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons at JoVE.com

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

تتفاعل الخلايا العصبية المستقبلة للألم والخلايا القاتلة الطبيعية بنشاط في سياق التهابي. يتيح نهج الثقافة المشتركة دراسة هذا التفاعل.

إثارة التفاعل بين الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا العصبية المستقبلة للألم

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

بالنظر إلى أن الخلايا العصبية المستقبلة للألم تفرز العديد من الببتيدات العصبية وأن الخلية القاتلة الطبيعية عبرت عن مستقبل هذه الببتيد العصبي ، فقد قررنا ابتكار طريقة زراعة مشتركة لدراسة التفاعل بين الخلية القاتلة الطبيعية والخلايا العصبية المستقبلة للألم. يمكن أن تكون هذه الطريقة الاختزالية مفيدة لدراسة كيفية تحكم الخلايا العصبية المستقبلة للألم في الوظيفة المضادة للورم في الخلية القاتلة الطبيعية ، وقد يكون من المثير للاهتمام أيضا دراسة كيفية تحكم الخلايا القاتلة الطبيعية في القضاء على الخلايا العصبية المصابة. سيوضح الإجراء علي أحمدي ، طالب ماجستير سابق من مختبري.لبدء عزل وثقافة الخلايا القاتلة الطبيعية أو الخلايا القاتلة الطبيعية ، اجمع طحال الفأر في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 500 ميكرولتر من PBS المعقم ، ثم قم بتجانس الطحال باستخدام مدقة. بعد ذلك ، قم بتخفيف الخلايا بملليلتر واحد من PBS المعقم وقم بتصفية الخليط من خلال مصفاة خلية 50 ميكرون في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. قم بتعبئة حجم التجانس المصفى إلى 10 ملليلتر باستخدام PBS معقم.عد الخلايا في 10 ميكرولتر من التجانس المخفف باستخدام مقياس الدم. الطرد المركزي الخلايا المتبقية لمدة خمس دقائق في 500 غرام وإزالة طاف. ثم أعد تعليق الخلايا من 10 إلى الخلايا الثامنة لكل ملليلتر في وسط RPMI 1640 المكمل.تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية للطحال مغناطيسيا باستخدام مجموعة عزل الخلايا القاتلة الطبيعية للفأر وتأكيد نقاء الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام قياس التدفق الخلوي. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، متبوعا بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 500 G ، ثم قم بإزالة المادة الطافية. لتحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية المحببة ، أعد تعليق هذه الخلايا في وسط ثقافة IL-2 و IL-15 RPMI 1640 المكمل.استزرع مرتين في 10 إلى سادس خلايا NK لكل مليلتر في صفيحة قاع U ذات 96 بئرا لمدة 48 ساعة. قبل 24 ساعة من تحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية ، قم بتغطية الصفيحة المكونة من 96 بئرا ب 100 ميكرولتر لكل بئر من الصفيحة واحتضانها لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة المحلول واترك الآبار تجف في الهواء في خزانة السلامة الحيوية.بعد ذلك ، قم بتأمين الماوس الرحيم على السبورة في وضع الانبطاح. ارفع الجلد وشق الجلد على طول العمود الظهري. قطع المفصل القطني العجزي وفصل العجز عن العمود الفقري القطني بالمقص.ثم افصل العمود الفقري عن طريق قطع العضلات والأضلاع على كلا الجانبين في اتجاه الجمجمة حتى يتم الوصول إلى قاعدة الجمجمة. استخدم المقص لقطع العمود الفقري عند المفصل الأطلسي القذالي. بعد ذلك ، قم بإزالة العضلات والأنسجة الدهنية من العمود الفقري.قم بتثبيت العمود الفقري وفتحه لإزالة الحبل الشوكي قبل الوصول إلى العقدة الجذرية الظهرية أو DRG في الثقبة الفقرية المتصلة بالحبل الشوكي من خلال الجذر الظهري. بعد ذلك ، قم بحصاد DRGs في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر مملوء ب 10 ملليلتر من الثلج البارد المكمل DMEM. ثم الطرد المركزي التحضير لمدة خمس دقائق في 200 غرام في درجة حرارة الغرفة وإزالة طاف.أضف 250 ميكرولتر من PBS تحتوي على ملليغرام واحد لكل ملليلتر كولاجيناز IV و 2.4 وحدة لكل ملليلتر ديسباز II.احتضان هذا DRG بمحلول كولاجيناز-ديسباز لمدة 80 دقيقة مع تحريض خفيف. لتعطيل الإنزيمات ، أضف خمسة ملليلتر من وسط DMEM المكمل وطرد مركزي المحلول عند 200 G.بعد خمس دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية برفق باستخدام ماصة واترك حوالي 100 ميكرولتر من المادة الطافية لتجنب فقدان الخلايا غير المرغوب فيه. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من وسط DMEM المكمل إلى الخلايا واستخدم مسدس ماصة وثلاث ماصات باستور زجاجية ذات أحجام متناقصة لسحن DRG برفق في إعداد خلية واحدة.أثناء العمل في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتخفيف ألبومين مصل الأبقار أو BSA في PBS معقم إلى تركيز نهائي بنسبة 15٪ وقم بتخزين حصة ملليلتر واحدة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. لإنشاء تدرج BSA في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر ، أضف ملليلتر من PBS المعقم ثم قم بتوزيع ملليلتر واحد من محلول BSA بنسبة 15٪ ببطء في الجزء السفلي من الأنبوب. تجنب تعطيل التدرج عن طريق إزالة الماصة برفق.باستخدام ماصة P200 ، أضف تعليق العقد الذي يحتوي على الخلايا العصبية على جانب الأنبوب إلى التدرج. ثم اضبط التسارع والتباطؤ عند الحد الأدنى للطرد المركزي للخلية العصبية التي تحتوي على تدرج BSA لمدة 12 دقيقة عند 200 G.بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة كل المادة الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من Neurobasal. لوحة 10،000 خلية عصبية لكل بئر في لوحة مسطحة القاع 96 بئر مطلية بالصفيحة.للسماح بربط الخلايا العصبية ، احتضان لوحة 96 بئر بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. لبدء الزراعة المشتركة ، قم بإزالة Neurobasal ببطء من ثقافة الخلايا العصبية. بعد 48 ساعة من التحفيز باستخدام IL-2 و IL-15 ، أعد تعليق الخلايا القاتلة الطبيعية وأضف 10 إلى الخلايا القاتلة الطبيعية الخامسة لكل بئر إلى مزرعة الخلايا العصبية.شارك في زراعة الخلايا في Neurobasal MX المكمل عند 37 درجة مئوية. بعد 48 ساعة ، قم بجمع الخلايا وغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS وطردها بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 500 جم عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية قبل تلطيخ الخلايا بصبغة eFluor 780 مخففة من واحد إلى 1،000 لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.اغسل الخلايا وطردها بالطرد المركزي كما هو موضح ، متبوعا بالعلاج بالقرص المضغوط 1632 لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية لحظر المواقع غير المحددة على الخلايا ، يليها جمع الخلايا وغسلها باستخدام PBS ثلاث مرات. بعد الدورة التالية من الغسيل والطرد المركزي ، قم بتلطيخ الخلايا باستخدام BV421 ، ومضاد NK-1.1 ، وفلوريسئين إيزوثيوسيانات مضاد NKp46 ، ومضاد phycoerythrin anti-GM-CSF لمدة 15 دقيقة. مرة أخرى ، قم بجمع الخلايا وغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS ، وقم بالطرد المركزي وتخلص من المادة الطافية ، ثم أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS والنمط المناعي للخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام قياس التدفق الخلوي.عند الاستزراع بمفردها ، عبرت الخلايا القاتلة الطبيعية عن المستويات القاعدية لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم المحببة أو GM-CSF و NKp46. عند الاستزراع المشترك مع الخلايا العصبية DRG التي تم حصادها من الفئران السليمة مستقبلات الألم ، قلل تحفيز الكابسيسين من تعبير الخلايا القاتلة الطبيعية عن GM-CSF. لم يكن للكبخاخات أي تأثير على تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية عند زراعتها مع الخلايا العصبية DRG التي تم حصادها من الفئران المستأصلة بمستقبلات الألم.لم يتأثر مستوى NKp46. الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول هي تفكك DRG والعزل. الفكرة هي الحفاظ على أقصى قدر من الجدوى العصبية عن طريق تجنب صنع الفقاعة واستخدام ماصة الحجم المناسب.بعد البروتوكول ، يمكن للباحث استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أو qPCR لقياس تغير النص في الخلايا المنقاة FACS ، أو يمكنهم استخدام ELISA لقياس إفراز السيتوكين أو الببتيدات العصبية. يكشف هذا التفاعل أن وظيفة الخلية القاتلة الطبيعية من المحتمل أن يتم ضبطها بواسطة الخلايا العصبية المستقبلة للألم. وقد يكون هذا الحديث المتبادل مهما في العمليات البيولوجية التي تمتد من إصابة الأعصاب والعدوى البكتيرية والفيروسية ، وصولا إلى الأورام الخبيثة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

تعديل العمليات العصبية والنقل الميتوكوندريا : تصوير مباشر في الخلايا العصبية الحصين خلال فترات طويلة

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

خفض التحميل : أداة مفيدة لفحص مدى تقاطع الفجوة بين الخلايا العصبية توصيلات الراسم الشبكية

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

مواصفات من الخلايا العصبية الجلوتاميرجي الدماغ الانتهائي من خلايا الجذعية المحفزة

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

النسب-إعادة برمجة الخلايا المشتقة من خلية حوطية الدماغ البشري الكبار في الخلايا العصبية المستحثة

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

على الإحاطة الفحص: بروتوكول لتقييم التفاعلات بين الخلايا العصبية والجهاز العصبي المركزي البالعات

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

العزلة وثقافة فصل الخلايا العصبية الحسية من الفرخ الأجنة

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

الظهرية جذر العقد الخلايا العصبية والخلايا الجذعية المتباينة الدهنية المشتقة: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك الثقافة نموذج لدراسة الأعصاب الطرفية التجديد

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

تصور انهيار مخروط النمو محواري وأوائل آثار بيتا اميلويد في الماوس استزراع الخلايا العصبية

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

تحويل الخلايا الجذعية مستحث البشرية المستحثة (iPSCs) في العمود الفقري الوظيفي الشوكي والجمجمة الحركية باستخدام متجات البكالوريا

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...