Name: teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00
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这项工作得到了研究基金新前沿（NFRFE201901326）、加拿大卫生研究院（162211，461274，461275），加拿大创新基金会（37439），加拿大研究主席计划（950-231859），加拿大自然科学和工程研究委员会（RGPIN-2019-06824）和魁北克自然与技术研究基金会（253380）的支持。

蒙特利尔大学的机构动物护理和使用委员会（#22053，#22054）批准了所有动物程序。有关溶液及其组成的列表，请参阅表 1 ，有关本协议中使用的材料，设备和试剂的列表，请参阅 材料表 。
1. NK细胞分离、培养和刺激
<ol><li>产生完整的伤害感受器神经元（同窝控制;TRPV1wt：:D TAfl/wt）和消融（TRPV1cre：:D TAfl/wt</s...

<ol>
	<li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain.">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li><li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia.">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li><li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors.">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li><li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology.">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li><li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity.">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li><li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis.">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li><li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier.">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li><li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor.">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li><li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury.">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333 (2021).</li><li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis.">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li><li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation.">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li><li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism.">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li></ol>

Davies等人11 发现受伤的神经元上调RAE1。 通过 细胞间接触，表达NKG2D的NK细胞能够识别和消除RAE1+ 神经元，这反过来又限制了慢性疼痛11。鉴于NK细胞也表达各种神经肽受体，并且这些神经肽以其免疫调节能力而闻名，因此在 体外研究NK细胞与伤害感受器神经元之间的相互作用似乎越来越重要。在这里，我们设计了一个简单的共培养方案，允...

感觉神经元的细胞体起源于背根神经节（DRG）。DRG位于周围神经系统（PNS）中，位于脊髓背角和周围神经末梢之间。DRG神经元的伪单极性质允许将信息从支配靶组织的外周分支传递到中枢分支，中央分支将体感信息传递到脊髓1。使用专门的离子通道受体，一级神经元感知病原体、过敏原和污染物带来的威胁2，导致阳离子（Na+、Ca2+）的流入和动作电位3，4，5 的产生。
这些神经元还将反潜动作电位发送到发生初始危险感知的外围，这导致神经肽1，4的局部释放。因此，伤害感受器神经元作为一种保护机制，提醒宿主注意环境危险4，5，6，7。
为了与二级神经元通信，伤害感受器释放各种神经递质（例如谷氨酸）和神经肽（例如降钙素基因相关肽（CGRP），P物质（SP）和血管活性肠肽（VIP））6，7。这些肽作用于毛细血管，促进血浆外渗、水肿以及免疫细胞的局部流入和调节2，4，7。
体感和免疫系统利用由细胞因子和神经肽及其各自的同源受体组成的共享通信系统4。虽然这种双向通信有助于防止危险并保持体内平衡，但它也有助于疾病病理生理学4。
NK细胞被归类为先天淋巴细胞，专门用于消除病毒感染的细胞。NK细胞功能由刺激性和抑制性受体的平衡控制，包括激活受体NKG2D8。NKG2D的内源性配体，维甲酸早期诱导1（RAE1），由经历肿瘤发生和感染等应激的细胞表达8，9。
最近的研究表明，周围神经损伤驱动感觉神经元表达适应不良的分子，如stathmin 2（STMN2）和RAE1。因此， 通过 细胞间接触，表达NKG2D的NK细胞通过与表达RAE1的神经元相互作用而被激活。反过来，NK细胞能够消除通常与神经损伤相关的损伤伤害感受器神经元和钝性疼痛超敏反应10。除了NKG2D-RAE1轴外，NK细胞还表达各种伤害感受器产生的介质的同源受体。因此，这些介质有可能调节NK细胞活性。本文提出了一种共培养方法来研究伤害感受器神经元-NK细胞相互作用的生物学。这种方法将有助于促进对伤害感受神经元如何调节先天免疫细胞对损伤、感染或恶性肿瘤的反应的理解。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 017769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 009669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Cat no: 504167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-mouse NK-1.1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (50 &#956;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: A3160702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphteria toxinfl/fl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: SH3057402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 13-678-20B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 07-200-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: CLS2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 04942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse NKp46</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 03690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 470236-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat no: 02-0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>Cat no: 03-50/31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: A14867-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat no: 13257-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 450-51-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse GM-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 210-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>Cat no: 19855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 108732</td>
			<td>Clone PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 137606</td>
			<td>Clone 29A1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRPV1Cre</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 505406</td>
			<td>Clone MP1-22E9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers and dissection tools.</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Shaped-bottom 96-well plate</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 101319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability Dye eFlour-780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons

体感神经元已经进化到可以检测有害刺激并激活防御反射。通过共享通信方式，伤害感受器神经元还通过控制免疫系统的活动来调整宿主的防御。这些系统之间的通信大多是自适应的，有助于保护体内平衡，它也可以导致或促进慢性疾病的发作。这两个系统共同进化以允许这种局部相互作用，如在原发性和继发性淋巴组织和粘膜中发现的那样。最近的研究表明，伤害感受器直接检测和响应外来抗原、免疫细胞来源的细胞因子和微生物。
伤害感受器激活不仅会导致疼痛超敏反应和瘙痒，而且会降低伤害感受器的发射阈值，导致神经肽的局部释放。由伤害感受器的外周末端产生和释放的肽可以阻断淋巴细胞的趋化性和极化，控制炎症的定位、持续时间和类型。最近的证据表明，感觉神经元通过细胞间接触与先天免疫细胞相互作用，例如， 与 自然杀伤（NK）细胞上的2D组（NKG2D）受体接触。
鉴于NK细胞表达各种伤害感受器产生的介质的同源受体，可以想象伤害感受器使用神经肽来控制NK细胞的活性。在这里，我们设计了一种共培养方法来研究培养皿中的伤害感受器神经元-NK细胞相互作用。使用这种方法，我们发现腰椎伤害感受器神经元降低NK细胞因子表达。总体而言，这种还原论方法可能有助于研究肿瘤支配神经元如何控制NK细胞的抗癌功能以及NK细胞如何控制受损神经元的消除。

从同窝对照（TRPV1wt：:D TAfl / wt）小鼠脾细胞中磁纯化NK细胞，并用IL-2和IL-15刺激（48小时）。然后将NK细胞单独培养或与从伤害感受器神经元中收获的DRG神经元共培养（同窝对照;TRPV1wt：:D TAfl/wt）或消融（TRPV1cre：:D TAfl/wt）小鼠。然后将细胞暴露于TRPV1激动剂辣椒素（1μM）或其载体中。共培养24小时后，对NK细胞进行FACS纯化，并使用流式细胞术对其?...

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Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

伤害感受器神经元和NK细胞在炎症环境中积极相互作用。共同文化方法可以研究这种相互作用。

梳理自然杀伤细胞和伤害感受神经元之间的相互作用

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

鉴于伤害感受器神经元分泌各种神经肽，并且NK细胞表达这些神经肽的受体，我们决定设计一种共培养方法来研究NK细胞和伤害感受器神经元之间的相互作用。这种还原论方法可用于研究伤害感受神经元如何控制NK细胞的抗肿瘤功能，并且研究NK细胞如何控制受损神经元的消除也可能很有趣。演示该程序的将是我实验室的前硕士生Ali Ahmadi。为了开始自然杀伤或NK细胞分离和培养，将小鼠脾脏收集在含有500微升无菌PBS的1.5毫升微量离心管中，然后使用杵均质化脾脏。接下来，用一毫升无菌PBS稀释细胞，并通过50微米细胞过滤器将混合物过滤到50毫升锥形管中。使用无菌PBS将过滤的匀浆体积加满至10毫升。使用血细胞计数器计数10微升稀释匀浆中的细胞。将剩余的细胞在500G下离心五分钟，并除去上清液。然后将细胞重悬于补充的RPMI 1640培养基中，每毫升10至第八个细胞。使用小鼠NK细胞分离试剂盒磁纯化脾脏NK细胞，并使用流式细胞术确认NK细胞纯度。使用血细胞计数器计数细胞，然后在500G下离心5分钟，然后除去上清液。为了刺激沉淀的NK细胞，将这些细胞重悬于补充的RPMI 1640培养基中的IL-2和IL-15中。在96孔U底板中每毫升培养10至第六个NK细胞两次48小时。在NK细胞刺激前24小时，用每孔100微升层粘连蛋白涂覆96孔板，并在37摄氏度下孵育45分钟。孵育后，取出溶液，让孔在生物安全柜中风干。接下来，将安乐死的鼠标固定在板上的俯卧位置。抬起皮肤并沿背柱切开皮肤。切断腰骶关节，用剪刀将骶骨与腰椎分开。然后通过在颅骨方向切割两侧的肌肉和肋骨来分离脊柱，直到到达颅底。用剪刀剪掉寰枕关节处的脊柱。接下来，从脊柱中去除肌肉和脂肪组织。在进入通过背根连接到脊髓的椎间孔中的背根神经节或DRG之前，固定并打开椎柱以去除脊髓。接下来，将DRG收获到装有10毫升冰冷补充DMEM的15毫升锥形管中。然后将制剂在室温下以200G离心5分钟，并除去上清液。加入含有每毫升1毫克胶原酶IV和2.4单位/毫升分散酶II的250微升PBS.将此DRG与胶原酶分散酶溶液一起孵育80分钟，并轻轻搅拌。要灭活酶，加入五毫升补充的DMEM培养基并以200G离心溶液.五分钟后，使用移液管轻轻除去上清液并留下约100微升上清液以避免不必要的细胞损失。接下来，向细胞中加入一毫升补充的DMEM培养基，并使用移液器枪和三个尺寸减小的玻璃巴斯德移液器将DRG轻轻研磨成单细胞制剂。在生物安全柜中工作时，将牛血清白蛋白或BSA在无菌PBS中稀释至终浓度为15%，并在零下20摄氏度下储存一毫升等分试样。要在15毫升锥形管中创建BSA梯度，请加入两毫升无菌PBS，然后在管底部缓慢分配一毫升15%BSA溶液。通过轻轻取出移液器来避免破坏梯度。使用P200移液器，将含有神经元的研磨神经节悬浮液添加到试管侧面的梯度中。然后将加速和减速设置为最小值，以200G离心含有BSA梯度的神经元12分钟.离心后，使用移液管除去所有上清液并将细胞重悬于500微升Neurobasal中。板10， 000个神经元每孔在层纤层蛋白包被的平底96孔板中。为了允许神经元附着，将96孔板在37摄氏度下孵育过夜。要开始共培养，请从神经元培养物中缓慢去除神经基底。用IL-2和IL-15刺激48小时后，重悬NK细胞，并向神经元培养物中每孔向第五个NK细胞添加10个。在37摄氏度的补充神经基础MX中共培养细胞。48小时后，用PBS收集并洗涤细胞三次，并在4摄氏度下以500G离心5分钟。弃去上清液，然后在4摄氏度下用1至1，000稀释的活性染料eFluor 780染色细胞15分钟。如图所示洗涤并离心细胞，然后用CD 1632在4摄氏度下处理15分钟以阻断细胞上的非特异性位点，然后用PBS收集和洗涤细胞三次。在下一个洗涤和离心循环后，用BV421，抗NK-1.1，异硫氰酸荧光素抗NKp46和藻红蛋白抗GM-CSF染色细胞15分钟。再次用PBS收集和洗涤细胞三次，离心并丢弃上清液，然后将细胞重悬于500微升FACS缓冲液中，并使用流式细胞术对NK细胞进行免疫表型分析。当单独培养时，NK细胞表达粒细胞巨噬细胞集落刺激因子或GM-CSF和NKp46的基础水平。当与从伤害感受器完整小鼠收获的DRG神经元共培养时，辣椒素刺激降低了GM-CSF的NK细胞表达。当辣椒素与从伤害感受器消融小鼠获得的DRG神经元共培养时，辣椒素对NK细胞活化没有影响。NKp46的水平不受影响。该协议中的关键步骤是DRG解离和分离。这个想法是通过避免产生气泡和使用合适尺寸的移液器来保持最大的神经元活力。方案结束后，研究者可以使用RNA测序或qPCR来测量FACS纯化细胞中的转录本变化，或者他们可以使用ELISA来测量细胞因子或神经肽的分泌。这种相互作用表明NK细胞功能可能由伤害感受器神经元调节。这种串扰在从神经损伤、细菌和病毒感染一直到恶性肿瘤的生物过程中可能很重要。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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科研

神经科学

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We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...