Name: teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door The New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), de Canadian Institutes of Health Research (162211, 461274, 461275), de Canadian Foundation for Innovation (37439), Canada Research Chair-programma (950-231859), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (RGPIN-2019-06824) en het Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).

De Institutional Animal Care and Use Committees van de Université de Montréal (#22053, #22054) keurden alle dierprocedures goed. Zie tabel 1 voor een lijst van oplossingen en hun samenstelling en de tabel met materialen voor een lijst van materialen, apparatuur en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.
1. NK-celisolatie, -cultuur en -stimulatie
<ol><li>Genereer nociceptorneuron intact (nestgenootcontrole; TRPV1wt::D TA<s...

<ol>
	<li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain.">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li><li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia.">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li><li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors.">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li><li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology.">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li><li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity.">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li><li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis.">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li><li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier.">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li><li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor.">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li><li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury.">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333 (2021).</li><li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis.">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li><li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation.">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li><li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism.">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li></ol>

Davies et al.11 ontdekten dat gewonde neuronen RAE1 upreguleren. Via cel-celcontact waren NKG2D-tot expressie brengende NK-cellen vervolgens in staat om RAE1 + -neuronen te identificeren en te elimineren, die op hun beurt chronische pijn beperken11. Gezien het feit dat NK-cellen ook verschillende neuropeptidereceptoren tot expressie brengen en dat die neuropeptiden bekend staan om hun immunomodulerende mogelijkheden, lijkt het steeds belangrijker om de i...

De cellichamen van sensorische neuronen zijn afkomstig uit de dorsale wortelganglia (DRG). De DRG bevinden zich in het perifere zenuwstelsel (PNS), tussen de dorsale hoorn van het ruggenmerg en de perifere zenuwuiteinden. De pseudo-unipolaire aard van DRG-neuronen maakt de overdracht van informatie mogelijk van de perifere tak, die het doelweefsel innerveert, naar de centrale tak, die de somatosensorische informatie naar het ruggenmerg draagt1. Met behulp van gespecialiseerde ionkanaalreceptoren detecteren eerste-orde neuronen bedreigingen van pathogenen, allergenen en verontreinigende stoffen2, wat leidt tot de instroom van kationen (Na +, Ca2 +) en het genereren van een actiepotentiaal 3,4,5.
Deze neuronen sturen ook antidromale actiepotentiaal naar de periferie, waar de eerste gevaardetectie was opgetreden, wat leidt tot de lokale afgifte van neuropeptiden 1,4. Daarom dienen de nociceptorneuronen als een beschermend mechanisme en waarschuwen de gastheer voor omgevingsgevaar 4,5,6,7.
Om te communiceren met tweede-orde neuronen, geven de nociceptoren verschillende neurotransmitters (bijv. glutamaat) en neuropeptiden (bijv. Calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP), stof P (SP) en vasoactief intestinaal peptide (VIP))6,7 vrij. Deze peptiden werken in op haarvaten en bevorderen plasma-extravasatie, oedeem en de lokale instroom en modulatie van immuuncellen 2,4,7.
Het somatosensorische en immuunsysteem maken gebruik van een gedeeld communicatiesysteem dat bestaat uit cytokines en neuropeptiden, en hun respectieve verwante receptoren4. Hoewel deze bidirectionele communicatie helpt beschermen tegen gevaar en homeostase behouden, kan het ook bijdragen aan ziekte pathofysiologie4.
NK-cellen worden geclassificeerd als aangeboren lymfoïde cellen en zijn gespecialiseerd om viraal geïnfecteerde cellen te elimineren. Nk-celfunctie wordt geregeld door een balans van stimulerende en remmende receptoren, waaronder de activerende receptor NKG2D8. Het endogene ligand van NKG2D, retinoïnezuur early inducible1 (RAE1), wordt tot expressie gebracht door cellen die stress ondergaan zoals tumorigenese en infectie 8,9.
Recente onderzoeken hebben aangetoond dat perifeer zenuwletsel sensorische neuronen drijft om onaangepaste moleculen zoals stathmin 2 (STMN2) en RAE1 tot expressie te brengen. Dus, via cel-celcontact, werden NKG2D-expresserende NK-cellen geactiveerd door interactie met RAE1-expresserende neuronen. Nk-cellen waren op hun beurt in staat om gewonde nociceptorneuronen en stompe pijnovergevoeligheid te elimineren die normaal geassocieerd wordt met zenuwletsel10. Naast de NKG2D-RAE1-as drukken NK-cellen de cognatereceptoren uit voor verschillende nociceptor-geproduceerde mediatoren. Het is daarom mogelijk dat deze mediatoren de NK-celactiviteit moduleren. Dit artikel presenteert een co-kweekmethode om de biologie van de nociceptor neuron-NK celinteractie te onderzoeken. Deze aanpak zal helpen het begrip te vergroten van hoe nociceptorneuronen aangeboren immuuncelreacties op letsel, infectie of maligniteit moduleren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 017769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 009669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Cat no: 504167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-mouse NK-1.1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (50 &#956;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: A3160702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphteria toxinfl/fl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: SH3057402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 13-678-20B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 07-200-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: CLS2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 04942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse NKp46</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 03690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 470236-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat no: 02-0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>Cat no: 03-50/31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: A14867-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat no: 13257-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 450-51-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse GM-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 210-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>Cat no: 19855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 108732</td>
			<td>Clone PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 137606</td>
			<td>Clone 29A1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRPV1Cre</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 505406</td>
			<td>Clone MP1-22E9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers and dissection tools.</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Shaped-bottom 96-well plate</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 101319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability Dye eFlour-780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons

Somatosensorische neuronen zijn geëvolueerd om schadelijke stimuli te detecteren en defensieve reflexen te activeren. Door communicatiemiddelen te delen, stemmen nociceptorneuronen ook de afweer van de gastheer af door de activiteit van het immuunsysteem te regelen. De communicatie tussen deze systemen is meestal adaptief en helpt de homeostase te beschermen, het kan ook leiden tot of het begin van chronische ziekten bevorderen. Beide systemen zijn samen geëvolueerd om een dergelijke lokale interactie mogelijk te maken, zoals gevonden in primaire en secundaire lymfoïde weefsels en slijmvliezen. Recente studies hebben aangetoond dat nociceptoren direct vreemde antigenen, van immuuncellen afgeleide cytokines en microben detecteren en erop reageren.
Nociceptoractivering resulteert niet alleen in pijnovergevoeligheid en jeuk, maar verlaagt ook de nociceptorvuurdrempel, wat leidt tot de lokale afgifte van neuropeptiden. De peptiden die worden geproduceerd door en vrijgegeven uit de perifere terminals van nociceptoren kunnen de chemotaxis en polarisatie van lymfocyten blokkeren, waardoor de lokalisatie, duur en het type ontsteking worden gecontroleerd. Recent bewijs toont aan dat sensorische neuronen interageren met aangeboren immuuncellen via cel-celcontact, bijvoorbeeld door groep 2D (NKG2D) receptoren op natural killer (NK) cellen aan te spreken.
Gezien het feit dat NK-cellen de cognate receptoren tot expressie brengen voor verschillende nociceptor-geproduceerde mediatoren, is het denkbaar dat nociceptoren neuropeptiden gebruiken om de activiteit van NK-cellen te beheersen. Hier bedenken we een co-kweekmethode om nociceptor neuron-NK celinteracties in een schotel te bestuderen. Met behulp van deze benadering ontdekten we dat lumbale nociceptorneuronen de expressie van NK-cellencytokine verminderen. Over het algemeen zou een dergelijke reductionistische methode nuttig kunnen zijn om te bestuderen hoe tumor-innervating neuronen de antikankerfunctie van NK-cellen regelen en hoe NK-cellen de eliminatie van gewonde neuronen regelen.

NK-cellen werden magnetisch gezuiverd van littermate control (TRPV1wt::D TAfl/wt) muizensplenocyten en gestimuleerd (48 h) met IL-2 en IL-15. De NK-cellen werden vervolgens alleen gekweekt of samen gekweekt met DRG-neuronen geoogst uit nociceptorneuron intact (nestmate control; TRPV1wt::D TAfl/wt) of ablated (TRPV1cre::D TAfl/wt) muizen. De cellen werden vervolgens blootgesteld aan de TRPV1-agonist capsaïcine (1 μM) of het voertuig ervan. Na 24 uur co-kw...

Watch this Scientific Journal Video about Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons at JoVE.com

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

Nociceptorneuronen en NK-cellen werken actief samen in een inflammatoire context. Een co-cultuurbenadering maakt het mogelijk om dit samenspel te bestuderen.

Het uitpluizen van het samenspel tussen Natural Killer Cells en Nociceptor Neurons

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

Gezien het feit dat nociceptorneuronen verschillende neuropeptiden afscheiden en dat NK-cel de receptor voor deze neuropeptiden tot expressie bracht, besloten we een co-kweekmethode te ontwikkelen om het samenspel tussen de NK-cel en de nociceptorneuronen te bestuderen. Een dergelijke reductionistische methode zou nuttig kunnen zijn om te bestuderen hoe nociceptorneuronen de antitumorfunctie van NK-cellen beheersen, en het zou ook interessant kunnen zijn om te bestuderen hoe NK-cellen de eliminatie van gewonde neuronen controleerden. De procedure wordt gedemonstreerd door Ali Ahmadi, een voormalige masterstudent uit mijn lab.Om de natuurlijke killer of NK-celisolatie en -cultuur te beginnen, verzamelt u de muizen milt in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met 500 microliter steriele PBS en homogeniseert u vervolgens de milt met behulp van een stamper. Verdun vervolgens de cellen met één milliliter steriel PBS en filter het mengsel door een 50 micron celzeef in een conische buis van 50 milliliter. Vul het gefilterde homogenaatvolume aan tot 10 milliliter met steriel PBS.Tel de cellen in 10 microliter van het verdunde homogenaat met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de resterende cellen gedurende vijf minuten bij 500 G en verwijder het supernatant. Resuspendeer vervolgens de cellen op 10 tot de achtste cellen per milliliter in aangevuld RPMI 1640-medium.Zuiver de milt NK-cellen magnetisch met behulp van een NK-celisolatiekit van de muis en bevestig de zuiverheid van NK-cellen met behulp van flowcytometrie. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer, gevolgd door centrifugatie na vijf minuten bij 500 G en verwijder vervolgens het supernatant. Voor het stimuleren van de gepelletiseerde NK-cellen resuspensie deze cellen in IL-2 en IL-15 aangevuld RPMI 1640 kweekmedium.Kweek twee keer 10 tot de zesde NK-cellen per milliliter in een 96-well U-bodemplaat gedurende 48 uur. Bedek 24 uur voor de NK-celstimulatie de 96-wellsplaat met 100 microliter per putje laminine en incubeer deze gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder na incubatie de oplossing en laat de putten aan de lucht drogen in de bioveiligheidskast.Bevestig vervolgens de geëuthanaseerde muis op het bord in een buikligging. Til de huid op en snijd de huid langs de dorsale kolom. Knip het lumbosacrale gewricht af en scheid het heiligbeen van de lumbale wervelkolom met een schaar.Scheid vervolgens de wervelkolom door de spieren en ribben aan beide zijden in de schedelrichting te snijden totdat de basis van de schedel is bereikt. Gebruik een schaar om de wervelkolom bij het atlantooccipitale gewricht af te snijden. Verwijder vervolgens de spier en het vetweefsel van de wervelkolom.Pin en open de wervelkolom om het ruggenmerg te verwijderen voordat u toegang krijgt tot het dorsale wortelganglion of DRG in de tussenwervelforamina verbonden met het ruggenmerg via de dorsale wortel. Oogst vervolgens de DRG's in een conische buis van 15 milliliter gevuld met 10 milliliter ijskoude aangevulde DMEM. Centrifugeer vervolgens het preparaat gedurende vijf minuten bij 200 G bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.Voeg een 250 microliter PBS toe met één milligram per milliliter collagenase IV en 2,4 eenheden per milliliter dispase II.Incubeer deze DRG met collagenase-dispase-oplossing gedurende 80 minuten met milde agitatie. Om de enzymen te inactiveren, voegt u vijf milliliter aangevuld DMEM-medium toe en centrifugeert u de oplossing bij 200 G.Verwijder na vijf minuten voorzichtig het supernatant met een pipet en laat ongeveer 100 microliter van het supernatant achter om ongewenst celverlies te voorkomen. Voeg vervolgens een milliliter aangevuld DMEM-medium toe aan de cellen en gebruik een pipetpistool en drie glazen Pasteur-pipetten van afnemende grootte om de DRG voorzichtig te tritureren in een eencellig preparaat.Verdun tijdens het werken in een bioveiligheidskast runderserumalbumine of BSA in steriel PBS tot een eindconcentratie van 15% en bewaar één milliliter aliquot bij min 20 graden Celsius. Om een BSA-gradiënt in een conische buis van 15 milliliter te creëren, voegt u twee milliliter steriele PBS toe en doseert u vervolgens langzaam een milliliter 15% BSA-oplossing aan de onderkant van de buis. Verstoor het verloop niet door de pipet voorzichtig te verwijderen.Voeg met behulp van een P200-pipet de triturated ganglia-suspensie met de neuronen toe aan de zijkant van de buis in de gradiënt. Stel vervolgens de versnelling en vertraging in op het minimum om het neuron met de BSA-gradiënt gedurende 12 minuten bij 200 G te centrifugeren.Na de centrifugatie verwijdert u al het supernatant met een pipet en resuspendeert u de cellen in 500 microliter Neurobasal. Plaat 10, 000 neuronen per put in een laminine-gecoate platte bodem 96-well plaat.Om de aanhechting van de neuronen mogelijk te maken, incubeer je de 96-well plaat 's nachts bij 37 graden Celsius. Om te beginnen met co-cultiveren, verwijder je langzaam de Neurobasal uit de neuroncultuur. Na 48 uur stimulatie met IL-2 en IL-15, resuspensie de NK-cellen en voeg 10 toe aan de vijfde NK-cellen per put aan de neuroncultuur.Co-kweek de cellen in aangevulde Neurobasal MX bij 37 graden Celsius. Verzamel en was de cellen na 48 uur driemaal met PBS en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 500 G bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg voordat u de cellen kleurt met één tot 1.000 verdunde levensvatbaarheidskleurstof eFluor 780 gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.Was en centrifugeer de cellen zoals gedemonstreerd, gevolgd door behandeling met CD 1632 gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius om niet-specifieke plaatsen op de cellen te blokkeren, gevolgd door het verzamelen en wassen van de cellen met PBS driemaal. Na de volgende cyclus van wassen en centrifugatie, kleur de cellen met BV421, anti-NK-1.1, fluoresceïne isothiocyanaat anti-NKp46 en phycoerythrin anti-GM-CSF gedurende 15 minuten. Nogmaals, verzamel en was de cellen driemaal met PBS, centrifugeer ze en gooi het supernatant weg, resuspenseer de cellen vervolgens in 500 microliter FACS-buffer en immunofenotypeer de NK-cellen met behulp van flowcytometrie.Wanneer ze alleen werden gekweekt, brachten NK-cellen basale niveaus tot expressie van granulocytenmacrofaagkoloniestimulerende factor of GM-CSF en NKp46. Wanneer co-gekweekt met DRG-neuronen geoogst van nociceptor intacte muizen, verminderde capsaïcinestimulatie de EXPRESSIE VAN NK-cellen van GM-CSF. De capsaïcine had geen invloed op NK-celactivaties wanneer ze samen werden gekweekt met DRG-neuronen geoogst van nociceptor-geableerde muizen.Het niveau van NKp46 werd niet beïnvloed. De belangrijkste stappen in dit protocol is de DRG-dissociatie en isolatie. Het idee is om maximale neuronale levensvatbaarheid te behouden door het maken van bubbels te vermijden en de juiste maat pipet te gebruiken.Na het protocol kan de onderzoeker RNA-sequencing of qPCR gebruiken om transcriptverandering in FACS-gezuiverde cellen te meten, of ze kunnen ELISA gebruiken om de secretie van cytokine of neuropeptiden te meten. Een dergelijk samenspel onthult dat de NK-celfunctie waarschijnlijk is afgestemd door nociceptorneuron. En deze overspraak kan belangrijk zijn in biologische processen, variërend van zenuwletsel, bacteriële en virale infectie tot maligniteiten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulatie en Mitochondriale Transport: Live Imaging in hippocampale neuronen dan lange duur

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-loading: Een handig hulpmiddel is voor de behandeling van de omvang van Gap Junction Tracer koppeling tussen het netvlies Neuronen

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-herprogrammering van pericyte-afgeleide cellen van het volwassen menselijke hersenen in Induced Neuronen

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Een Engulfment Assay: Een protocol bij interacties tussen CNS Fagocyten en Neuronen Assess

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Isolatie en Cultuur van Gedissocieerde sensorische neuronen van Chick Embryo

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Achterwortelganglia Neuronen en Gedifferentieerde Adipose-afgeleide stamcellen: Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultuur Model naar regeneratie van perifere zenuwen Bestudeer

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualiseren van axonale groei Cone ineenstorting en vroege amyloïde β effecten in gekweekte muis neuronen

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...