Name: teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00
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Diese Arbeit wurde vom New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), den Canadian Institutes of Health Research (162211, 461274, 461275), der Canadian Foundation for Innovation (37439), dem Canada Research Chair Program (950-231859), dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (RGPIN-2019-06824) und dem Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380) unterstützt.

Die Institutional Animal Care and Use Committees der Université de Montréal (#22053, #22054) genehmigten alle Tierverfahren. Siehe Tabelle 1 für eine Liste der Lösungen und ihrer Zusammensetzung und die Tabelle der Materialien für eine Liste der Materialien , Ausrüstungen und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. NK-Zellisolierung, -kultur und -stimulation
<ol><li>Erzeugen Sie Nozizeptorneuron intakt (Wurfgeschwister...

<ol>
	<li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain.">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li><li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia.">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li><li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors.">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li><li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology.">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li><li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity.">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li><li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis.">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li><li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier.">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li><li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor.">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li><li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury.">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333 (2021).</li><li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis.">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li><li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation.">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li><li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism.">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li></ol>

Davies et al.11 fanden heraus, dass verletzte Neuronen RAE1 hochregulieren. Über Zell-Zell-Kontakt konnten NKG2D-exprimierende NK-Zellen dann RAE1+ -Neuronen identifizieren und eliminieren, was wiederum chronische Schmerzen begrenzt11. Angesichts der Tatsache, dass NK-Zellen auch verschiedene Neuropeptidrezeptoren exprimieren und dass diese Neuropeptide für ihre immunmodulatorischen Fähigkeiten bekannt sind, erscheint es immer wichtiger, die Interakti...

Die Zellkörper sensorischer Neuronen stammen aus den dorsalen Wurzelganglien (DRG). Die DRG befinden sich im peripheren Nervensystem (PNS), zwischen dem Rückenhorn des Rückenmarks und den peripheren Nervenendigungen. Die pseudo-unipolare Natur von DRG-Neuronen ermöglicht die Übertragung von Informationen vom peripheren Ast, der das Zielgewebe innerviert, zum zentralen Ast, der die somatosensorische Information zum Rückenmark transportiert1. Unter Verwendung spezialisierter Ionenkanalrezeptoren spüren Neuronen erster Ordnung Bedrohungen durch Krankheitserreger, Allergene und Schadstoffe2, was zum Einstrom von Kationen (Na+, Ca2+) und zur Erzeugung eines Aktionspotentials 3,4,5 führt.
Diese Neuronen senden auch ein antidromisches Aktionspotential in Richtung Peripherie, wo die anfängliche Gefahrenwahrnehmung aufgetreten war, was zur lokalen Freisetzung von Neuropeptidenführt 1,4. Daher dienen die Nozizeptorneuronen als Schutzmechanismus, der den Wirt vor Umweltgefahren 4,5,6,7 warnt.
Um mit Neuronen zweiter Ordnung zu kommunizieren, setzen die Nozizeptoren verschiedene Neurotransmitter (z. B. Glutamat) und Neuropeptide (z. B. Calcitonin-Gen-verwandtes Peptid (CGRP), Substanz P (SP) und vasoaktives intestinales Peptid (VIP)) frei)6,7. Diese Peptide wirken auf Kapillaren und fördern Plasmaextravasation, Ödeme und den lokalen Einstrom und die Modulation von Immunzellen 2,4,7.
Das somatosensorische und das Immunsystem nutzen ein gemeinsames Kommunikationssystem, das aus Zytokinen und Neuropeptiden und ihren jeweiligen verwandten Rezeptoren besteht4. Während diese bidirektionale Kommunikation hilft, vor Gefahren zu schützen und die Homöostase zu erhalten, kann sie auch zur Krankheitspathophysiologie beitragen4.
NK-Zellen werden als angeborene lymphatische Zellen klassifiziert und sind darauf spezialisiert, viral infizierte Zellen zu eliminieren. Die NK-Zellfunktion wird durch ein Gleichgewicht von stimulierenden und inhibitorischen Rezeptoren gesteuert, einschließlich des aktivierenden Rezeptors NKG2D8. Der endogene Ligand von NKG2D, Retinsäure früh induzierbar1 (RAE1), wird von Zellen exprimiert, die Stress ausgesetzt sind, wie Tumorgenese und Infektion 8,9.
Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass periphere Nervenverletzungen sensorische Neuronen dazu bringen, maladaptive Moleküle wie Stathmin 2 (STMN2) und RAE1 zu exprimieren. So wurden über Zell-Zell-Kontakt NKG2D-exprimierende NK-Zellen durch Interaktion mit RAE1-exprimierenden Neuronen aktiviert. Im Gegenzug waren NK-Zellen in der Lage, verletzte Nozizeptorneuronen und stumpfe Schmerzüberempfindlichkeit zu eliminieren, die normalerweise mit Nervenverletzungen einhergeht10. Zusätzlich zur NKG2D-RAE1-Achse exprimieren NK-Zellen die verwandten Rezeptoren für verschiedene Nozizeptor-produzierte Mediatoren. Es ist daher möglich, dass diese Mediatoren die NK-Zellaktivität modulieren. Dieser Artikel stellt eine Kokulturmethode vor, um die Biologie der Neuron-NK-Zellinteraktion des Nozizeptors zu untersuchen. Dieser Ansatz wird dazu beitragen, das Verständnis dafür zu verbessern, wie Nozizeptorneuronen angeborene Immunzellreaktionen auf Verletzungen, Infektionen oder Malignität modulieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 017769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 009669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Cat no: 504167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-mouse NK-1.1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (50 &#956;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: A3160702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphteria toxinfl/fl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: SH3057402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 13-678-20B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 07-200-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: CLS2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 04942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse NKp46</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 03690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 470236-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat no: 02-0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>Cat no: 03-50/31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: A14867-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat no: 13257-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 450-51-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse GM-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 210-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>Cat no: 19855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 108732</td>
			<td>Clone PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 137606</td>
			<td>Clone 29A1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRPV1Cre</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 505406</td>
			<td>Clone MP1-22E9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers and dissection tools.</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Shaped-bottom 96-well plate</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 101319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability Dye eFlour-780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons

Somatosensorische Neuronen haben sich entwickelt, um schädliche Reize zu erkennen und Abwehrreflexe zu aktivieren. Durch den Austausch von Kommunikationsmitteln stimmen Nozizeptorneuronen auch die Abwehrkräfte des Wirts ab, indem sie die Aktivität des Immunsystems steuern. Die Kommunikation zwischen diesen Systemen ist meist adaptiv und hilft, die Homöostase zu schützen, sie kann auch zum Ausbruch chronischer Krankheiten führen oder diese fördern. Beide Systeme haben sich gemeinsam entwickelt, um eine solche lokale Interaktion zu ermöglichen, wie sie in primären und sekundären lymphatischen Geweben und Schleimhäuten zu finden ist. Neuere Studien haben gezeigt, dass Nozizeptoren Fremdantigene, Immunzell-abgeleitete Zytokine und Mikroben direkt erkennen und darauf reagieren.
Die Aktivierung von Nozizeptoren führt nicht nur zu Schmerzüberempfindlichkeit und Juckreiz, sondern senkt auch die Nozizeptor-Feuerschwelle, was zur lokalen Freisetzung von Neuropeptiden führt. Die Peptide, die von den peripheren Terminals von Nozizeptoren produziert und freigesetzt werden, können die Chemotaxis und Polarisation von Lymphozyten blockieren und die Lokalisation, Dauer und Art der Entzündung kontrollieren. Jüngste Erkenntnisse zeigen, dass sensorische Neuronen mit angeborenen Immunzellen über Zell-Zell-Kontakt interagieren, zum Beispiel Gruppen-2D-Rezeptoren (NKG2D) auf natürlichen Killerzellen (NK).
Da NK-Zellen die verwandten Rezeptoren für verschiedene Nozizeptor-produzierte Mediatoren exprimieren, ist es denkbar, dass Nozizeptoren Neuropeptide verwenden, um die Aktivität von NK-Zellen zu steuern. Hier entwickeln wir eine Co-Kulturmethode, um Nozizeptor-Neuron-NK-Zell-Interaktionen in einer Schale zu untersuchen. Mit diesem Ansatz fanden wir heraus, dass lumbale Nozizeptorneuronen die NK-Zellzytokinexpression verringern. Insgesamt könnte eine solche reduktionistische Methode nützlich sein, um zu untersuchen, wie tumorinnervierende Neuronen die Antikrebsfunktion von NK-Zellen steuern und wie NK-Zellen die Eliminierung verletzter Neuronen steuern.

NK-Zellen wurden magnetisch aus Splenozyten der Wurfgeschwisterkontrolle (TRPV1 wt::D TAfl/wt) Mäuse gereinigt und mit IL-2 und IL-15 stimuliert (48 h). Die NK-Zellen wurden dann allein kultiviert oder mit DRG-Neuronen co-kultiviert, die aus intakten Nozizeptorneuronen gewonnen wurden (Wurfgeschwisterkontrolle; TRPV1wt::D TAfl/wt) oder abgetragene (TRPV1cre::D TAfl/wt) Mäuse. Die Zellen wurden dann dem TRPV1-Agonisten Capsaicin (1 μM) oder seinem Vehike...

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Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

Nozizeptorneuronen und NK-Zellen interagieren aktiv in einem entzündlichen Kontext. Ein Kokulturansatz ermöglicht es, dieses Zusammenspiel zu untersuchen.

Das Zusammenspiel zwischen natürlichen Killerzellen und Nozizeptorneuronen herauskitzeln

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

Angesichts der Tatsache, dass Nozizeptorneuronen verschiedene Neuropeptide sezernieren und dass NK-Zellen den Rezeptor für diese Neuropeptide exprimieren, haben wir uns entschieden, eine Kokulturmethode zu entwickeln, um das Zusammenspiel zwischen der NK-Zelle und den Nozizeptorneuronen zu untersuchen. Eine solche reduktionistische Methode könnte nützlich sein, um zu untersuchen, wie Nozizeptorneurone die Antitumorfunktion von NK-Zellen kontrollieren, und es könnte auch interessant sein zu untersuchen, wie NK-Zellen die Eliminierung verletzter Neuronen kontrollieren. Ali Ahmadi, ein ehemaliger Masterstudent aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren.Um mit der Isolierung und Kultur des natürlichen Killers oder der NK-Zellen zu beginnen, sammeln Sie die Milz der Maus in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern sterilem PBS und homogenisieren Sie dann die Milz mit einem Stößel. Als nächstes verdünnen Sie die Zellen mit einem Milliliter sterilem PBS und filtern die Mischung durch ein 50-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen. Füllen Sie das gefilterte Homogenatvolumen mit sterilem PBS auf 10 Milliliter auf.Zählen Sie die Zellen in 10 Mikrolitern des verdünnten Homogenats mit einem Hämozytometer. Die restlichen Zellen werden fünf Minuten lang bei 500 G zentrifugiert und der Überstand entfernt. Anschließend werden die Zellen bei 10 bis acht Zellen pro Milliliter in ergänztem RPMI 1640-Medium resuspendiert.Reinigen Sie die Milz-NK-Zellen magnetisch mit einem Maus-NK-Zellisolierungskit und bestätigen Sie die NK-Zellreinheit mittels Durchflusszytometrie. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, gefolgt von einer Zentrifugation nach fünf Minuten bei 500 G, dann entfernen Sie den Überstand. Zur Stimulation der pelletierten NK-Zellen resuspendieren Sie diese Zellen in IL-2 und IL-15 ergänztem RPMI 1640 Kulturmedium.Kultur zweimal 10 bis zur sechsten NK-Zellen pro Milliliter in einer 96-Well-U-Bodenplatte für 48 Stunden. 24 Stunden vor der NK-Zellstimulation die 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern Laminin pro Welle beschichten und 45 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation die Lösung und lassen Sie die Vertiefungen in der Biosicherheitswerkbank an der Luft trocknen.Als nächstes befestigen Sie die eingeschläferte Maus auf dem Brett in Bauchlage. Heben Sie die Haut an und schneiden Sie die Haut entlang der dorsalen Säule. Schneiden Sie das lumbosakrale Gelenk ab und trennen Sie das Kreuzbein mit einer Schere von der Lendenwirbelsäule.Trennen Sie dann die Wirbelsäule, indem Sie die Muskeln und Rippen auf beiden Seiten in Schädelrichtung schneiden, bis die Schädelbasis erreicht ist. Verwenden Sie eine Schere, um die Wirbelsäule am Atlantookzipitalgelenk abzuschneiden. Als nächstes entfernen Sie den Muskel und das Fettgewebe von der Wirbelsäule.Pinnen und öffnen Sie die Wirbelsäule, um das Rückenmark zu entfernen, bevor Sie Zugang zum dorsalen Wurzelganglion oder DRG in der Zwischenwirbelforamina erhalten, die durch die Rückenwurzel mit dem Rückenmark verbunden ist. Als nächstes ernten Sie die DRGs in ein 15-Milliliter-konisches Röhrchen, das mit 10 Milliliter eiskalt ergänztem DMEM gefüllt ist. Dann zentrifugieren Sie das Präparat für fünf Minuten bei 200 G bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand.Fügen Sie 250 Mikroliter PBS hinzu, die ein Milligramm pro Milliliter Kollagenase IV und 2,4 Einheiten pro Milliliter Dispase II enthalten.Inkubieren Sie dieses DRG mit Kollagenase-Dispase-Lösung für 80 Minuten unter leichtem Rühren. Um die Enzyme zu inaktivieren, fügen Sie fünf Milliliter ergänztes DMEM-Medium hinzu und zentrifugieren Sie die Lösung bei 200 G.Nach fünf Minuten entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und lassen Sie etwa 100 Mikroliter des Überstands stehen, um unerwünschten Zellverlust zu vermeiden. Als nächstes fügen Sie den Zellen ein Milliliter angereichertes DMEM-Medium hinzu und verwenden Sie eine Pipettenpistole und drei Glaspasteurpipetten abnehmender Größe, um das DRG vorsichtig in eine Einzelzellpräparation zu trituieren.Während der Arbeit in einer Biosicherheitswerkbank Rinderserumalbumin oder BSA in sterilem PBS auf eine Endkonzentration von 15% verdünnen und einen Milliliter Aliquots bei minus 20 Grad Celsius lagern. Um einen BSA-Gradienten in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen zu erzeugen, fügen Sie zwei Milliliter steriles PBS hinzu und dosieren Sie dann langsam einen Milliliter 15% BSA-Lösung am Boden des Röhrchens. Vermeiden Sie eine Unterbrechung des Farbverlaufs, indem Sie die Pipette vorsichtig entfernen.Fügen Sie mit einer P200-Pipette die geritrierte Gangliensuspension mit den Neuronen seitlich des Röhrchens in den Farbverlauf ein. Stellen Sie dann die Beschleunigung und Verzögerung auf das Minimum ein, um das Neuron mit dem BSA-Gradienten für 12 Minuten bei 200 G zu zentrifugieren.Entfernen Sie nach der Zentrifugation den gesamten Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern Neurobasal. Platte 10.000 Neuronen pro Vertiefung in einer lamininbeschichteten flachen 96-Well-Platte.Um die Anheftung der Neuronen zu ermöglichen, inkubieren Sie die 96-Well-Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Um mit der Co-Kultivierung zu beginnen, entfernen Sie langsam das Neurobasal aus der Neuronenkultur. Nach 48 Stunden Stimulation mit IL-2 und IL-15 resuspendieren Sie die NK-Zellen und fügen 10 zu den fünften NK-Zellen pro Vertiefung zur Neuronenkultur hinzu.Co-Kultur der Zellen in ergänztem Neurobasal MX bei 37 Grad Celsius. Nach 48 Stunden die Zellen dreimal mit PBS sammeln und waschen und fünf Minuten bei 500 G bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen mit einem bis 1.000 verdünnten Lebensfähigkeitsfarbstoff eFluor 780 für 15 Minuten bei vier Grad Celsius färben.Waschen und zentrifugieren Sie die Zellen wie gezeigt, gefolgt von einer Behandlung mit CD 1632 für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um unspezifische Stellen auf den Zellen zu blockieren, gefolgt von einem dreifachen Sammeln und Waschen der Zellen mit PBS. Nach dem nächsten Wasch- und Zentrifugationszyklus färben Sie die Zellen 15 Minuten lang mit BV421, Anti-NK-1.1, Fluorescein-Isothiocyanat-Anti-NKp46 und Phycoerythrin-Anti-GM-CSF an. Noch einmal, sammeln und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, zentrifugieren Sie sie und verwerfen Sie den Überstand, dann resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikroliter FACS-Puffer und Immunphänotyp die NK-Zellen mittels Durchflusszytometrie.Wenn sie allein kultiviert wurden, exprimierten NK-Zellen basale Konzentrationen von Granulozyten-Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor oder GM-CSF und NKp46. Bei Co-Kultivierung mit DRG-Neuronen, die von Nozizeptor-intakten Mäusen geerntet wurden, verringerte die Capsaicin-Stimulation die NK-Zellexpression von GM-CSF. Das Capsaicin hatte keinen Einfluss auf die NK-Zellaktivierungen, wenn es mit DRG-Neuronen aus nozizeptorabgetragenen Mäusen kokultiviert wurde.Der Spiegel von NKp46 wurde nicht beeinflusst. Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind die DRG-Dissoziation und -Isolierung. Die Idee ist, die maximale neuronale Lebensfähigkeit zu erhalten, indem man die Bildung von Blasen vermeidet und die richtige Pipette verwendet.Nach dem Protokoll kann der Prüfer RNA-Sequenzierung oder qPCR verwenden, um die Transkriptänderung in FACS-gereinigten Zellen zu messen, oder er kann ELISA verwenden, um die Sekretion von Zytokin oder Neuropeptiden zu messen. Ein solches Zusammenspiel zeigt, dass die NK-Zellfunktion wahrscheinlich durch das Nozizeptor-Neuron abgestimmt wird. Und dieses Übersprechen kann in biologischen Prozessen wichtig sein, die von Nervenverletzungen, bakteriellen und viralen Infektionen bis hin zu Malignomen reichen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-loading: ein nützliches Werkzeug für die Prüfung des Umfangs der Gap Junction Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-Umprogrammierung der Perizyten-abgeleiteten Zellen des erwachsenen menschlichen Gehirn in Neuronen induziert

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Isolation und Kultur der Dissoziierte sensorischen Neuronen aus Hühnerembryonen

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsalwurzelganglien Neuronen und differenzierten Fettgewebe gewonnene Stammzellen: Eine<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Kultur Modell zur Regeneration peripherer Nerven Studieren

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualisierung von axonale Wachstum Kegel Zusammenbruch und frühe Amyloid β-Effekte in kultivierten Maus Neuronen

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...